Uitgebreide ruimtelijke profilering van soortagnostische transcriptomen via stereo-seq

Ons onderzoek richt zich op het gedetailleerd karakteriseren van de microomgeving van de eierstoktumor om voorspellende en therapeutische biomarkers te identificeren. We willen bijvoorbeeld markers vinden om chemorespons en chemoresistentie te voorspellen, of nieuwe therapeutische doelen voor tweedelijnsbehandelingen. De experimentele uitdagingen omvatten het behandelen van monsters, de kwaliteitsbeoordeling van het monster en de duur van de verwerking van een monster.

Aan de data-analysekant zijn de uitdagingen onder andere de schaarsheid van de data, vergelijkbaar met andere single cell-processen, of ook het in kaart brengen van gebieden, vooral repetitieve regio's. Na het verwijderen van de stereosequencing N-Chip uit de verpakking, noteer je het chipidentificatienummer. Maak de glazen schuif schoon met 100% ethanol zonder het N-Chip oppervlak aan te raken.

Met een micropipet breng je voorzichtig 10 microliter ultraviolet uithardbare keramische hars aan rond de rand van de stereo-sequencing N-chip. Gebruik een afgesloten schuimstaafje om overtollige hars te verwijderen, zodat er alleen een dunne lijn rond de chiprand overblijft. Plaats de schuif in het ultraviolet uithardingsapparaat, zodat het chipoppervlak niet wordt aangeraakt.

Plaats nu de met hars aangebrachte chip bovenop een ondoorzichtig masker op de 405-nanometer ultraviolet lichtbron om de achterkant van het glaasje te verlichten, en hard vijf minuten uit. Na het uitharden gebruik je afgesloten schuimwattenstaafjes geweekt in 100% moleculair ethanol, daarna 70% ethanol en tenslotte nucleasevrij water om rond de harsrand schoon te maken. Doe de chip drie keer onder in vers nucleasevrij water met een 50-milliliter conische buis.

Met perslucht droog je de chip met de volle luchtkracht onder een hoek van ongeveer 60 tot 80 graden, terwijl je diagonaal over het oppervlak beweegt vanaf ongeveer vijf centimeter afstand. Breng vervolgens 150 microliter Poly-L-Lysine-oplossing gelijkmatig aan over het gehele chipoppervlak en incubeer de chip 10 minuten op kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de Poly-L-Lysine-oplossing uit de chip.

Droog na de tweede wasbeurt zorgvuldig de randen van de slede zonder het chipoppervlak aan te raken. Droog de chip stevig met perslucht zoals eerder gedemonstreerd. Bij het snijden van het FFPE-weefsel moet je de chip niet direct aanraken en slechts 80% van de chip bedekken met weefsel.

Om twee microliter enkelstrengs DNA-kleuringsoplossing in SSC-buffer te bereiden, verdund je het Qubit enkelstrengs DNA-reagens met 5X SSC-buffer. Creëer een mastermix van kleuringsoplossing met een verdunning van één tot 20 van ribonucleaseremmer, één tot 20 verdunning van de enkelstrengige DNA-oplossing, en het resterende volume met een 5X SSC-buffer. Voeg 150 microliter kleuroplossing toe aan elke chip en laat het vijf minuten in het donker op kamertemperatuur incuberen.

Verwijder vervolgens voorzichtig de kleuroplossing uit de hoek van elke chip met een pipet. Na het twee keer wassen van de chip met 0,1X SSC-buffer gedurende 10 tot 15 seconden, droog je zorgvuldig de randen van de slide. Voeg ongeveer drie tot vijf microliter glycerol toe aan de glaasje om het te monteren.

Laat een dekmantel van ongeveer één centimeter boven de slede vallen, zodat deze waterpas blijft en ervoor zorgt dat hij het chipoppervlak niet raakt. Leg fluorescerende beelden vast van enkelstrengs DNA-gekleurd weefsel met een grootveldmicroscoop, zodat 10% overlap tussen beeldtegels wordt gegarandeerd. Stitch de verkregen beelden in beeldverwerkingssoftware zoals ImageJ door eerst theoretische overlap te gebruiken om benaderende tegelposities te genereren, en vervolgens pixelmatching computationele overlap toe te passen om de tegeling fijn af te stemmen.

Verwerk de gestitchte beelden in de StereoMap-software en controleer of de beeldkwaliteitscontrole is goedgekeurd voordat je verder gaat. Dompel de stereosequencing-slede onder in 30 milliliter 0,1X SSC-buffer totdat de dekmantel loskomt. Zorg ervoor dat het FFPE-decrosslinking-reagens kamertemperatuur heeft en inspecteer het op deeltjes.

Zet de thermocycler aan en stel hem in op 30 graden Celsius voor evenwicht, 95 graden Celsius voor een incubatie van 30 minuten, en oneindig houd op vier graden Celsius. Zet de cassettepakking in elkaar en plaats de stereo-sequencing chip-schuif in de cassette. Voeg vervolgens FFPE decrosslinking reagens toe aan de put van de stereosequencing slidecassette, plak zegelband op de cassette en controleer of deze goed verzegeld is.

Begin de 30 minuten durende incubatie bij 95 graden Celsius. Na 10 minuten plaats je 25 milliliter methanol in een 50-milliliter container in een vriezer bij 20 graden Celsius, waarbij je ongeveer één milliliter per diasoort voorbereid voor later gebruik. Na het verwijderen van de chip uit de thermocycler, plaats je de schuifcassette op de bank en haal je de afdichtingstape eraf.

Verwijder en verwijder met een pipet het FFPE-decrosslinking-reagens van de cassette. Zodra het reagens volledig is verwijderd, haal je de cassette en pakking los en gooi je ze weg. Droog onder een steriele afzuigkap de rand van de slede en breng indien nodig een nieuwe siliconenkamer aan.

Voeg 500 microliter gekoelde methanol toe uit de 20 graden Celsius vriezer, zodat het hele gedeelte onder water is. Voorwarm PR-oplossing op een droogblok van 37 graden Celsius gedurende 10 minuten voor gebruik. Na fixatie veegt je in een afzuigkap overtollige methanol van de schuif en wacht je tot de resterende methanol op de chip verdampt.

Zet een nieuwe cassette-eindpakking in elkaar. Zodra de verdamping is voltooid, plaats je de stereo-sequencing chipslide in de cassette. Voeg 200 microliter voorverwarmde permeablisatiereagens toe aan de chip.

Breng afdichttape aan op de stereosequencing slidecassette en zorg dat deze stevig is afgesloten. Voer omgekeerde transcriptie uit en vervolgens CDNA-afgifte en zuivering volgens de stappen zoals hier getoond. Verwarm nucleasevrij water voor tot 37 graden Celsius.

Verwijder de afdichting van de chip. Pipetteer krachtig in elke hoek en in het midden van de chip over het weefsel zonder het te schrapen of aan te raken. Verzamel alle gratis DNA-releasemix uit de chip en breng het over in een centrifugebuis van 1,5 of 2,0 milliliter.

Voeg 350 microliter voorverwarmd nucleasevrij water direct toe aan het chipoppervlak. Pipetteer krachtig met een kleinere pipet, en draai de punt zo dat er pure kracht op zit zonder het weefsel te raken of de chip te schrapen. Combineer de wash met de 400 microliter gratis DNA-release mix die eerder is verzameld, zodat alleen materiaal van één chip wordt gecombineerd.

Plaats 100 microliter nucleasevrij water op de chip. Sluit de stereosequencing-slide af en bewaar deze in de koelkast tot het einde van het protocol. Single-celsegmentatie met behulp van de SAW-pijplijn werd bereikt op FFPE-secties, waardoor mapping mogelijk werd gemaakt naar niet-polyadenyleerde RNA's zoals tRNA en TRDMT1.

Interactieve ruimtelijke visualisatie toonde veronderstelde celtypen met behulp van de propriëtaire software StereoMap, met clusters in verschillende kleuren weergegeven over een ingezoomd gebied van het weefsel. De expressie van het niet-polyadenyleerde RNA TRDMT1 in het hele weefsel werd gevisualiseerd met behulp van StereoPi. De aanpassingen van het protocol pakken problemen aan die we hadden bij volledige transcriptomics, ruimtelijke profilering van vette en fragiele weefsels, door de weefseladhesie, RNA-toegankelijkheid en de behandeling van stereo-seqs op deze moeilijke weefseltypen te verbeteren.

Stereo-seq biedt momenteel een hogere resolutie dan andere ruimtelijke transcriptomische methoden, met een resolutie van 500 nanometer vergeleken met twee micrometer. Het biedt ook onbevooroordeelde opname die nodig is voor het bestuderen van de microbioom-, virale en niet-polyadenyleerde transcripten.