Subnanometer-resolutie structurele bepaling van hemagglutinine uit cryo-elektronentomografie van griepvirussen

Ons laboratorium gebruikt structurele biologie om virussen en de evolutie van geneesmiddelresistentie te bestuderen. In het huidige werk karakteriseren we hoe influenzahemagglutinine de conformatie verandert bij receptorbinding. We hebben cryo-elektrontomografie gebruikt om de organisatie en structuur van virale morfologie te visualiseren.

Specifiek hebben we deze modaliteit van cryo-elektronenmicroscopie gebruikt om de pleomorfe virusinfluenza in beeld te brengen. Ons protocol stelt ons in staat de organisatie en structuur van influenza-hemagglutinine in situ op intacte virussen te bestuderen met een resolutie onder nanometer. Deze hogere resolutie stelt ons in staat om voorheen verborgen interacties te visualiseren.

Start om te beginnen een Linux-terminal om de Conda-omgeving te activeren. Gebruik de terminal om de Conda-omgeving te activeren met ISO-netwerk geïnstalleerd. Maak een submap aan genaamd tomo folder, en verplaats vervolgens alle tomogram-bestanden naar die map.

Gebruik vervolgens de code om een sterbestand te genereren in de projectmap. Open met een teksteditor het gegenereerde sterbestand en voer de benaderende defocuswaarde van de nul-graad-hellingsafbeeldingen in in de vierde kolom. Voer nu het CTFD-convolutiecommando uit in de terminal.

Na deconvolveren activeer je de EMAN2 GUI-omgeving om te beginnen met preprocessing voor deeltjespicking. Onder tomografie klik je met de linkermuisknop op de pijltje naast ruwe gegevens, selecteer je tomogrammen importeren in het dropdownmenu en selecteer je de bestanden. Klik vervolgens met de linkermuisknop op de pijl naast segmentatie en kies voorbewerkte tomogrammen.

Gebruik geschikte standaardparameters. Na de voorverwerking wordt automatisch een infomap aangemaakt met lege JSON-bestanden die overeenkomen met de basisnamen van de procestomografiebestanden. Voeg angstrom-pixelinformatie toe aan de bestanden voordat je verder gaat.

Om een convolutioneel neuraal netwerk, of CNN te trainen om het HA-glycoproteïne te herkennen, wijzig je de werkdirectory naar de locatie van de te gebruiken tomogrammen. Open vervolgens de CNN-trainingsinterface via de terminal. Bevestig dat er vier ramen open zijn.

Eén met informatie over CNN-parameters en tomogrammen in de directory, en de andere drie vensters met afbeeldingen van goede referenties, slechte referenties en deeltjes geselecteerd door het CNN. Klik in de CNN GUI op de nieuwe optie om een CNN te initialiseren met een standaard leersnelheid van 0,0001 en een boxgrootte van acht. Klik onder de kolom bestandsnaam met de linkermuisknop op een representatief tomogram om het te openen.

Beweeg de cursor met de muis boven het geopende tomogram en klik op het muisscrollwiel om een nieuw venster te openen. Klik met links op de N-getal schuifregelaar om de Z-as te doorlopen. Gebruik vervolgens op het open tomogram het panel goede referenties om 10 tot 20 kenmerken te selecteren die overeenkomen met de HV. Positieve beelden verschijnen in het positieve venster.

Om er een te verwijderen, houd je shift ingedrukt en klik je met de linkermuisknop erop. Schakel nu over naar het slechte referentiepaneel en selecteer 10 tot 20 referenties die overeenkomen met kenmerken zoals lege membraanpatches, de RNP-dichtheid, fiduciale markers en puin. Stel het aantal iteraties in op 50 en klik op het treinicoon om te beginnen met CNN-training.

Druk na de training op solliciteren. Geselecteerde deeltjes worden op het tomogram weergegeven als blauwe cirkels of zijn zichtbaar in het deeltjesvenster. Blijf verfijnen door extra positieve en negatieve referenties te selecteren en af en toe op opslaan te klikken om voortgang te behouden.

Zodra de CNN naar behoren presteert, klik je op 'apply all' om deeltjespicking uit te voeren. Beoordeel vervolgens de resultaten op verschillende tomogrammen en train indien nodig. Om coördinaten voor elk tomogram op te slaan, open je de EMAN2 GUI opnieuw met het commando e2projectmanager.py.

Klik op de pijl onder subtomogram gemiddelde en selecteer handmatig boksen. Voer nu de naam van het tomogram in en klik op opstarten. Klik vervolgens achtereenvolgens op het bestand, save box-kabel en tomogram_ha.

txt om de coördinaten op te slaan. Navigeer naar de neural net-submap en info-submappen om een back-up te maken en op te slaan. HDF, treinvertrekken.

HDF, Segouts. hdf, en boxes3Dref.hdf. Train een tweede CNN om de M1-eiwitlaag en de aanwezigheid van VRNP te detecteren door de trainingsbox te veranderen van acht naar veertien.

Om deeltjes te cureren, download eerst notitieboeken uit de GitHub-repository. Open vervolgens het CNN-deeltjesreinigingsritme van het IPYNB-notebook en laad de benodigde modules. Laad de tekstbestanden met de HA- en M1-coördinaten in het notitieboek.

Bekijk ze als 3D-wolken met behulp van de open 3D-bibliotheek. Filter vervolgens HA-coördinaten uitschieters met behulp van de open 3D statistische uitschieterverwijderingsmethode. Bereken vervolgens de afstanden tussen HA- en M1-puntwolken door HA-punten meer dan 20 pixels van M1 als uitschieters te identificeren en de resterende coördinaten op te slaan in een uitvoertekstbestand.

Verbind alle deeltjes en sla op als sterbestanden met het pts2 sterbestand. IPYNB. Met WarpTools extraheer je deeltjes met buigingsfactor vier en voer je initiële subtomogram-gemiddelde uit in RELION min vier met behulp van de code. Converteer het warpsterbestand naar RELION 4-formaat.

Genereer vervolgens een initiële referentie met behulp van RELION en verfijn MPI op een deelverzameling van deeltjes. Voer 3D auto-verfijning uit op subtomogrammen met RELION refine MPI. Bij convergentie herhaal je de automatische verfijning met titan translatie verschoven naar acht en stap naar twee.

Gebruik 2D-classificatie om junk particles te verwijderen met behulp van RELION refine. Maak sterbestanden met goede klassen met de code, en combineer dan de individuele sterbestanden. Representatieve tomogrammen toonden pleomorfe virionen met vormen variërend van bolvormig tot langgerekte vormen.

Het uiteindelijke subtomogramgemiddelde bereikte een globale resolutie van 6,0 angström met een lokale resolutie variërend van vijf tot zeven ångström. Alpha-helices en bèta-sheets werden opgelost in de definitieve HA-reconstructie, wat de structurele kwaliteit van de verfijnde kaart ondersteunde. Glycosyleringsplaatsen waren op vier posities op de HA-kop en stam te identificeren, wat de zichtbaarheid van glycandichtheid in de uiteindelijke reconstructie bevestigde.