Een minimaal invasieve methode voor het genereren van een syngeen orthotopisch muismodel van longkanker

Ons huidige onderzoek richt zich op het begrijpen van longkanker en hoe nieuwe behandelmethoden kunnen worden ontwikkeld die compatibel zijn met standaardtherapie, waaronder chemotherapie, bestraling en immunotherapie. We konden geen orthotopisch longkankermodel vinden dat criteria vastlegde om specifiek longkanker in een vroeg stadium te bestuderen. We werken eraan om duidelijke en reproduceerbare richtlijnen te bieden om die kloof met dit protocol te dichten.

Dit protocol is minimaal invasief en eenvoudig uit te voeren. Daarnaast maakt dit protocol, met de door ons opgestelde criteria, screening van precieze tumorimplantatie mogelijk en maakt het vroege tumordetectie mogelijk via bioluminescente beeldvorming. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om longkanker in een vroeg stadium in het gastheerweefsel te bestuderen, waardoor preklinische ontwikkeling van nieuwe kankertherapieën en onderzoek naar de tumormicro-omgeving mogelijk is.

We zullen deze techniek gebruiken om de mechanismen en effectiviteit van spannende nieuwe longkankerbehandelingen preklinisch te evalueren en hopen dat dit kan leiden tot toekomstige patiëntenzorg. Begin met het plaatsen van de verdoofde muis in een neuskegel in buikligging op een verwarmingsapparaat en breng je oogzalf aan op beide ogen van de muis. Zodra de anesthesie is bevestigd, gebruik je een elektrische knipper om de vacht te verwijderen uit een rechthoekig gebied van twee bij drie centimeter aan de linker rugzijde van de muis.

Scheer vanaf de stekel mediaal, de tafel lateraal, de laatste rib naar beneden en de bovenste rand van het schouderblad naar de kop totdat er geen vacht meer zichtbaar is. Plaats de muis in een lege kooi op een verwarmingsapparaat. Observeer het ademhalingspatroon totdat de muis weer alert is en keer hem dan terug naar zijn thuiskooi tot de operatie.

Op de dag van celoogst voeg je drie tot vier uur voor de verzameling verse media met 50 milligram per milliliter Gentamycine toe aan de kweekplaat. Aspireer het medium van de kweekplaat en was de aangesloten cellen met 1x PBS. Incubeer de cellen vervolgens één tot twee minuten met trypsine EDTA-oplossing bij 37 graden Celsius.

Voeg verse media toe om de trypsine te neutraliseren. Verspreid de cellen door zachtjes op de plaat te tikken of te pipetten. Verzamel vervolgens de celsuspensie in een 50 milliliter conische buis.

Centrifugeer nu de kegelvormige buis op 1.200 G gedurende drie minuten op kamertemperatuur. Na bevestiging van de aanwezigheid van een compacte pellet onderin, aspireer je het supernatant en was je de pellet met PBS. Suspendeer de gewassen celpellet opnieuw in PBS om een concentratie van ongeveer één tot 2 miljoen cellen per milliliter te bereiken voor het tellen.

Filter de suspensie door een 40 micrometer celfilter voordat je verder gaat. Vervolgens combineer je 10 microliter celsuspensie met 10 microliter trypanblauw. Laad het gekleurde monster in een hemocytometer en tel de cellen.

Bereken het totale aantal cellen en de levensvatbaarheid van de cel. Centrifugeer de cellen opnieuw op 1.200 G gedurende drie minuten op kamertemperatuur en aspireer de PBS die de pellet verlaat. Susser de celpellet opnieuw in 0,5 milligram per milliliter metra-gel in PBS.

Pas het gewenste celaantal aan in een totaal injectievolume van 50 microliter. Houd de celsuspensie op ijs om matrigel-stolling te voorkomen. Maak de operatieplaats van het verdoofde dier drie keer schoon met steriele gaas, afwisselend tussen Betadine en 70% ethanol.

Plaats een gesteriliseerd fenestreerd chirurgisch doek met een opening van drie bij vier centimeter over de muis en legt autoclave-chirurgische instrumenten bovenop het doek. Met een tang identificeer je de schedelrand van het schouderblad en de coddle-rand van de thoracale ribkast. Met de huid strak gehouden tussen duim en wijsvinger van de chirurg, maak je een oppervlakkige incisie van vijf millimeter direct onder het schouderblad met een scalpelblad maat 10.

Gebruik vervolgens een 115 millimeter rechte schaar om het onderhuidse vet stomp te dissecten van de ribben en intercostale spieren zonder erdoorheen te snijden. Om lichtbloeding door capillaire schade te stoppen, druk je een gesteriliseerde watten applicator licht op het bloedende gebied. Houd de incisie open met micro-ads en pincetten.

Vanaf de zevende ware rib gebruik je gebogen mediane puntpincet om omhoog te tellen en de vierde en vijfde rib te lokaliseren. Markeer dit gebied als injectieplaats. Draai nu voorzichtig de celsuspensiebuis drie tot vier keer om om te mengen.

Vlak voor de injectie zuig je 50 microliter van de suspensie in een steriele 300 microliter 31 gauge acht millimeter insulinespuit, waarbij je zeker weet dat er geen belletjes aanwezig zijn. Plaats een vier millimeter dikke strook gesteriliseerd metalen tape die door de spuit wordt gespoeld om als stop te fungeren en de injectiediepte te regelen. Injecteer de 50 microliter celophanging onder een hoek van 90 graden in de intercostale ruimte tussen ribben vier en vijf, direct onder de vierde rib, en houd de naald twee tot drie seconden in positie.

Trek de naald langzaam uit onder dezelfde hoek als de ingebrachte en gooi hem weg in een scherpe container. Sluit tenslotte de huidincisie met twee tot drie vierkante geknoopte hechtingen en breng veterinaire chirurgische lijm aan over de hechtingen om de wondsluiting te versterken. Bioluminescentiebeeldvorming detecteerde tumorgerelateerde signalen in de experimentele muizen al vanaf één dag na injectie en de straling nam zichtbaar toe in de loop van de tijd voor zowel 25.000 als 50.000 cellen per muisgroep, met een grotere intensiteit waargenomen in de 50.000-celgroep.

De totale tumorflux nam exponentieel toe in zowel 25.000 als 50.000 celgroepen, en bereikte meer dan 10 keer 10 tot de macht van acht fotonen per seconde op dag 21 in de 50.000 celgroep. Schijnmuizen vertoonden geen luminescentie of zichtbare tumor in gedissectiede longen, terwijl experimentele muizen een hoge luminescentie en rode tumormassa's in longweefsel vertoonden. Op 21 dagen na de injectie vertoonden de aanwezige muizen tumoren die beperkt waren tot de linker longkwab zonder invasie in de omliggende gebieden.