Gebruik van cerebrale open-flow microperfusie voor de longitudinale verzameling van interstitiële vloeistof in een diermodel van glioblastoom

We karakteriseren oplosbare signaalcomponenten in de interstitiiële vloeistof van de hersentumor die bijdragen aan de ziekteprogressie en de respons op de behandeling. Het evalueren van absolute concentraties opgeloste stoffen in de hersentumor interstitieel blijft een onderzoeksuitdaging die het gebruik van geavanceerde experimentele methoden vereist. Begin met een steriel scalpel een sagittale middenlijnincisie langs het oppervlak van de schedel, beginnend tussen de ogen en kaudaal uitstrekkend 8 tot 10 millimeter.

Gebruik vervolgens een steriele tang om de huid lateraal terug te trekken vanaf de middenlijnincisie. Zorg dat zowel bregma als lambda zichtbaar zijn, en verleng de incisie indien nodig. Vervolgens snijd je met een steriel scalpel het periost in en trek je het weefsel lateraal terug met een tang.

Breng 1% tot 3% waterstofperoxide aan met een steriele watten-tip applicator om het schedeloppervlak schoon te maken. Gebruik nu een insulinespuit van 0,3 tot 1,0 milliliter om 20 tot 40 microliter zelfetsende tandheelkundige lijm gelijkmatig op het schedeloppervlak aan te brengen. Blootstel het vervolgens aan een tandheelkundige uithardingslamp om de lijm te etsen.

Na het uitharden verwijder je overtollige lijm met steriele watten en zoutoplossing. Plaats de boorbit opnieuw op de cOFM-geleidercoördinaat. Stel de boor in op 15.000 omwentelingen per minuut en boor een maalgat met de DV micromanipulator-draaiknop.

Controleer regelmatig de dikte van de schedel tijdens het boren en spoel met fysiologische zoutoplossing om vuil te verwijderen en warmte te verminderen. Herhaal de boorprocedure bij elke ankerschroefcoördinat. Plaats nu ankerschroeven met steriele pincetten en een steriele schroevendraaier totdat ze één tot twee schroefdraadlengtes diep zijn geplaatst.

Vervolgens monteer je de cOFM-geleider en dummy-assemblage in de geleiderhouder en bevestig je de houder aan het stereotactische frame. Plaats de geleidepunt boven het maalgat en laat deze langzaam zakken tot de vooraf bepaalde diepte met 1 millimeter per minuut. Breng het cementmiddel in dunne, uniforme lagen aan op de schedel, waarbij de gebieden onder en rond de cOFM-geleider en schroeven worden bedekt.

Gebruik een tandheelkundige uithardingslamp om elke laag te verharden voordat je de volgende aanbrengt. Zorg ervoor dat het cement het hele oppervlak tussen de componenten bedekt en vermijd de vergrendelingswig. Haal de geleiderhouder los van de cOFM-geleider en hef deze langzaam op met de DV-knop van de micromanipulator.

Verwijder met een tang de vergrendelingswedge van de cOFM-geleider en dummy-assemblage. Til voorzichtig de pop uit de geleider. Gebruik de knoppen van de ML- en AP-micromanipulator om de injectie-infusie-inzet-assemblage over de cOFM-geleider uit te lijnen.

Laat de infusie-inzet zakken met de DV-knop en zet deze vast door de vergrendelingswig stevig met een tang opnieuw in te brengen. Injecteer nu 3 microliter celsuspensie uit de spuit met 1 microliter per minuut. Controleer het gebied rond de cOFM-geleider om te zorgen dat er geen celsuspensie-efflux uit de assemblage komt.

Gebruik een tang om de vergrendelingswedge van de geleider en infusie-inzetapparaat te verwijderen. Tilt vervolgens voorzichtig de infusie-insert van de geleider met de DV-afstelknop. Vul de duw- en trekslangen vooraf met kunstmatig cerebrospinaal vocht met gasdichte glazen spuiten.

Installeer het peristaltische gedeelte van de slang in de pompkop van de microperfusiepomp. Verbind de perfusataat zak met de push-buis met een Luer lock-connector. Verbind vervolgens de bemonsteringsinsert met behulp van flensverbindingen op de buis.

Bevestig de langere inlaatas aan het uiteinde van de push-tubing en de kortere uitlaatas aan het ingangsuiteinde van de trektube. Plaats het aangesloten bemonsteringsinzetstuk in een steriele microcentrifugebuis met 750 microliter kunstmatig hersenvocht. Verbind de fractiecollectornaald met de trekbuis-uitgangslijn met een geflensde buisconnector.

Voer vervolgens een slangspoeling uit van 20 minuten met 10 microliter per minuut om luchtbellen te elimineren. Vul vervolgens de trekbuis vooraf met kunstmatig cerebrospinaal vocht met gasdichte spuiten. Plaats de peristaltische slang opnieuw in de pompkop van de microperfusiepomp.

Sluit de bemonsteringsinsert opnieuw aan met geflensde buisconnectoren. Verbind de inlaat aan het uitgangsuiteinde van de trekbuis en de uitlaat aan het ingangsuiteinde van de trekbuis. Plaats het inzetstuk in een steriele microcentrifugebuis met 750 microliter kunstmatig hersenvocht.

Voer nog een 20-minuten slangspoeling uit met 10 microliter per minuut om eventuele resterende luchtbellen te verwijderen. Plaats een verdoofd dier in een jas van passende grootte. Trek de voorpoten volledig door de armsgaten en maak de jas stevig vast op de rug van het dier.

Gebruik een paar pincet om de vergrendelingswedge van de geleider en dummy-assemblage te verwijderen. Til dan voorzichtig de dummy-insert uit de geleider. Plaats voorzichtig de bemonsteringsinserts in de geleider en plaats de vergrendelingswig terug.

Haal het dier uit de narcose en plaats het in het roterende kooisysteem. Bevestig de kooi-kabel aan de dierenjas en activeer het roterende kooisysteem. Na cOFM-bemonstering deactiveer je het roterende kooisysteem en maak je de kooiverbinding los van de dierenjas.

Gebruik nu een pincet om de vergrendelingswedge van de geleider en de bemonsteringsinsert-assemblage te verwijderen. Tilt voorzichtig de monsterinzet uit de geleider, steek de dummy-inzet voorzichtig terug in de geleider en plaats de vergrendelingswig weer. Maak de sluitingen aan de achterkant van de dierenjas los en verwijder de jas voorzichtig van het dier.

Bioluminescente beeldvorming bevestigde de aanwezigheid van tumoren bij dieren met cOFM-geleide tumorcel-engraftment. Proteomische hoofdcomponentanalyse van cOFM-bemonsterde interstitiële vloeistof toonde een duidelijke scheiding tussen temozolomide-behandelde en dimethylsulfoxide-behandelde diergroepen. Globale metabolomische signaalverdelingen overlappen vrijwel perfect tussen temozolomide- en dimethylsulfoxidemonsters.

Ondanks signaaloverlap toonde metabolomische vulkaananalyse een duidelijke door temozolomide veroorzaakte verschuiving. Kwantitatieve vergelijkingen van metabolomische waarden van dezelfde dieren toonden aan dat gerecirculeerde configuraties de analytenconcentraties verbeterden terwijl de relatieve metabolietverhoudingen behouden bleven. De relatieve beschikbaarheid van voedingsstoffen binnen de micro-omgeving van de hersentumor is nog slecht begrepen.

Dit protocol wordt gebruikt om dit gat te dichten. Het karakteriseren van nutriëntenbeschikbaarheid en signaaloverdracht binnen de tumormicro-omgeving kan mechanismen van gliomaprogressie en adaptieve weerstand tegen behandeling verduidelijken.