Evaluatie van therapeutische interventies in het SHIP-deficiënte muismodel van de ziekte van Crohn, zoals ileitis en fibrose

We gebruiken muizen met SHIP-deficiëntie om de mechanismen te bestuderen die darmontsteking en fibrose bij de ziekte van Crohn aansturen en om nieuwe medicijnen of therapeutische strategieën te evalueren voor de behandeling van de ziekte van Crohn. Daarom hebben we dit model gebruikt in preklinische studies om de effectiviteit van glycogeen IBD-geneesmiddelen voor gerichte medicijnafgifte aan te tonen. Ons protocol gebruikt muizen met SHIP-tekort, die van nature ileale ontsteking en fibrose ontwikkelen, wat een fysiologisch relevanter model biedt dan traditionele chemisch geïnduceerde of blessure-gebaseerde modellen.

Onze bevindingen bewijzen muizen met SHIP-deficiëntie als een robuust model van ileale ontsteking en fibrose, wat mechanistische studies en preklinische tests van therapieën voor de ziekte van Crohn mogelijk maakt. Om te beginnen vasten de muizen vier uur voordat je de test uitvoert. Los vier kilodalton FITC-dextran op in steriele PBS om een uiteindelijke concentratie van 80 milligram per milliliter te bereiken.

Vervolgens bind je elke muis voorzichtig vast en geef je 150 microliter van de FITC-dextran-oplossing via orale gavage, en houd je de muizen daarna nog eens vier uur zonder voedsel. Na het inslapen van de muis voert u een hartpunctie uit met een 25-gauge naald en een spuit van één milliliter om bloed op te nemen. Voeg onmiddellijk 10 microliter zuur-citrat-dextroseoplossing toe aan elke 100 microliter verzameld bloed als antistollingsmiddel.

Meng grondig door de buis meerdere keren om te draaien. Centrifugeer de verzamelde bloedmonsters op 1.500 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng het plasma voorzichtig over in gelabelde 1,7 milliliter microcentrifugebuizen.

Houd alle monsters op ijs en bescherm ze tegen licht totdat ze klaar zijn voor analyse. Verdunn nu elk plasmamonster met de verhoudingen één op twee en één op tien met PBS. Voeg 100 microliter van elke plasmaverdunning toe aan een ondoorzichtige plaat met 96 putjes, waarbij ze in dubbele putten worden geplaatst.

Voer één tot twee seriële verdunningen uit van de oorspronkelijke 80 milligram per milliliter FITC-dextran-materiaal met PBS om verschillende concentraties van de oplossing te bereiden. Voeg 100 microliter van elke verdunning toe aan dubbele putten van de 96-put plaat. Meet vervolgens de fluorescentie met een microplaatmeter ingesteld op 485 nanometer voor excitatie en 535 nanometer voor emissie.

Na bloedafname voor de FITC-dextran-test verwijder zorgvuldig de gehele dunne darm van de muis. Verwijder voorzichtig al het vastzittende vet en bindweefsel uit de darm. Leg de schoongemaakte darm plat op een vel blanco wit papier om het visuele contrast te versterken.

Onderzoek het weefsel visueel op macroscopische tekenen van ziekte, met bijzondere aandacht voor de distale 10 centimeter bij SHIP-knockoutmuizen, waar ontsteking vaak voorkomt. Lijn de darm uit langs een liniaal om schaal te geven en fotografeer het hele exemplaar om eventuele grove pathologische bevindingen te documenteren. Spoel voorzichtig het darmlumen door met PBS met een spuit om de darminhoud te verwijderen, terwijl overmatige kracht wordt voorkomen om vervorming van de villus en cryptarchitectuur te voorkomen.

Identificeer het gebied van het distale ileum dat het meest representatief is voor de grove pathologie en verwijder ongeveer één centimeter weefsel. Leg het verwijderde weefsel plat in een histologiecassette en plaats het tussen twee sponzen om vouwen tijdens fixatie te voorkomen. Voor hematoxyline- en eozinkleuring en Masson's tricchrome kleuring, fixeer het weefsel in 10% neutraal gebufferde formaline met 10 tot 20 keer het weefselvolume 's nachts bij vier graden Celsius.

Na fixatie worden de cassettes overgebracht naar 70% ethanol voor opslag en worden ze volledig ondergedompeld tot de verwerking. Voor Alcian blue en periodiek zuur-Schiff kleuring, fixeer het weefsel in Carnoy's oplossing een nacht op vier graden Celsius. Na fixatie worden de cassettes overgebracht naar 100% ethanol voor opslag tot verwerking.

Vervolgens wordt de vaste weefsels in paraffine ingebed en in vijf micrometerplakjes gesneden voor verdere kleuring. Beoordeel de hematoxyline- en eosine-gekleurde ileale secties met een schaal van 16 punten volgens vastgestelde histopathologische criteria. Evalueer de trichrome gekleurde dwarsdoorsneden van de Masson met behulp van een zespuntsschaal op basis van vooraf gedefinieerde criteria.

Bereken de uiteindelijke fibrosescore als de mediaan van de scores toegekend door twee onafhankelijke beoordelaars die blind zijn voor de experimentele omstandigheden. Na dissectie en verwijdering van het histologiemonster verzamel je het resterende deel van de distale 10 centimeter van het ileum. Dep het verzamelde weefsel droog met een papieren handdoek of pluisvrij doekje en registreer vervolgens het weefselgewicht met een gekalibreerde weegschaal.

Vries het weefsel in vloeibare stikstof in voordat je het opbewaart bij min 80 graden Celsius voor toekomstige verwerking. Wanneer je klaar bent voor verwerking, haal je het bevroren weefsel eruit en houd je het altijd op ijs. Weeg vervolgens de weefselmonsters opnieuw om de juiste massa te bevestigen.

Bereid de homogenisatiebuffer voor door een proteaseremmer toe te voegen aan PBS. Gebruik 10 microliter buffer per milligram weefsel. Gebruik een laboratoriumhomogenisator om het volledige dikte ileale weefsel te homogeniseren in een ijskoude homogenisatiebuffer.

Ga door totdat het homogenaat uniform is en vrij van zichtbare weefselfragmenten. Spoel de homogenisatortip grondig af met PBS tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen. Centrifugeer het weefsel bij 10.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.

Aliquot de geklaarde supernatanten in kleinere volumes om vries-dooicycli te voorkomen, en bewaar ze vervolgens bij min 80 graden Celsius voor toekomstige analyse. Histologische analyse toonde significant grotere darmschade aan bij muizen met SHIP-deficiëntie vergeleken met SHIP-controles. De behandeling met dexamethason verminderde de histologische schade bij muizen met SHIP-deficiënt, hoewel de afname niet statistisch significant was.

Massons tricroomkleuring toonde een significant verhoogde collageenafzetting bij SHIP-deficiënte muizen ten opzichte van SHIP-controles, wat wijst op hogere fibrose-scores. De behandeling van dexamethason verminderde de fibrose bij muizen met SHIP-deficiënt aanzienlijk, waardoor de scores dichter bij SHIP-positieve controles kwamen. Alcian blue en PAS-kleuring bevestigden bekercelhyperplasie bij muizen met SHIP-deficiënt, wat zichtbaar verminderd was na behandeling met dexamethason.

De IL-1 bètaconcentraties waren significant verhoogd bij SHIP-deficiënte muizen ten opzichte van SHIP-controles. Dexamethason verlaagde significant de IL-1beta-concentraties bij muizen met SHIP-tekort. De MPO-concentraties waren significant verhoogd bij muizen met SHIP-deficiëntie vergeleken met SHIP-controles, en deze toename werd verminderd door dexamethason zonder statistische significantie te bereiken.

De LCN-2-concentraties waren ook verhoogd bij muizen met SHIP-tekort, maar hoge waarden werden niet consequent verlaagd door dexamethason. IL-1 bètaconcentraties correleerden positief met histologische schadescores en fibrosescores, wat wijst op een verband tussen ontsteking en weefselbeschadiging. Histologische schadescores correerden positief met fibrose-scores, wat suggereert dat weefselschade en fibrotische remodellering parallel vorderden.