Microvasculaire embolisme Muizenmodel voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen
21 november 2025
Dit protocol bevat een grondige beschrijving van een stapsgewijze aanpak voor een chronisch craniaal venster- en microvasculaire emboliemodel van een muismodel, geoptimaliseerd voor in vivo tweefotonmicroscopie met fluorescerende polystyreenmicrosferen.
Met deze microsfeerinjectiemethode proberen we de korte- en langetermijngevolgen van capillairverstopping te ontrafelen om mogelijke mechanismen voor het opruimen van embolus in het cerebrale capillairnetwerk te onderzoeken. Het maakt realtime in vivo beeldvorming en tracking van fluorescerende deeltjes in het corticale capillaire netwerk mogelijk. De microsferen en de lokale gevolgen kunnen wekenlang na injectie worden gevolgd.
Onze studies helpen lokale weefselschade veroorzaakt door microvasculaire occlusies te begrijpen. Deze resultaten kunnen hopelijk leiden tot nieuwe behandelstrategieën. We kunnen nu dag na dag en wekenlang bestuderen hoe capillaire verstopping vaten verandert, cellen activeert, de bloedstroom verandert en de bloed-hersenbarrière beschadigt.
Om te beginnen knijp je in de teen van een verdoofde muis om de diepte van de verdoving te controleren. Maak een middenlijnincisie van ongeveer 0,5 centimeter over de luchtpijp onder de onderkaak met chirurgische schaar en dissectiepincetten. Ontleed het bindweefsel dat oppervlakkig is aan de cervicale fascia met behulp van microhechtende tangen om de onderliggende borstbeen tongspieren bloot te leggen.
Scheid nu de linker- en rechter borstspieren door voorzichtig het bindweefsel tussen hen los te trekken. Trek de rechter omohyoïdale spier caudaal lateraal in met een weefselhaak. Zorg ervoor dat de rechter halsslagaderdriehoek, inclusief de arteria van de arteria common carotis, de arteria internal carotis en de arteria external carotis, duidelijk zichtbaar zijn.
Verwijder vervolgens eventuele resterende fascia en vetweefsel rondom de arteria halsslagader (carotisarterius). Scheid zorgvuldig de arteria halsslagader van de nervus vagus. Plaats twee 4/0 1,5 draden rond de arteria halsslagader en bind ze losjes vast, zodat de knopen de bloedstroom niet belemmeren.
Verwijder fascia en vetweefsel uit de arteria carotis interna en de achterste pariëtale arterie. Bind vervolgens tijdelijk de achterste pariëtale arteria en alle zijtakken van de interne halsslagader af, inclusief de arteria occipitalis, door een knoop te maken met een 4/0 1,5 draad. Verwijder fascia en vetweefsel van de arteria carotis uitwendig en de temporale arterie.
Plaats twee losse knopen rond de externe halsslagader en de temporale arterie met 4/0 maat 1,5 draadjes. Plaats de meest distale draad zo ver mogelijk van de Y-vormige bifurcatie en gebruik deze om permanent de externe halsslagader en temporale arterie te ligaeren. Laat de proximale knoop los.
Homogeniseer en sonicaat de 10 micrometer microsferen om een uniforme suspensie van individuele deeltjes te verkrijgen. Voeg 20 microliter gehomogeniseerde microsferen toe aan 140 microliter FITC-Dextran om een eindvolume van 160 microliter mengsel te verkrijgen, bestaande uit 1,44 keer 10 op de macht van vijf microsferen. Trek kort de spuit die aan de katheter is verbonden terug om een luchtsluis te creëren.
Dompel vervolgens de kathetertip onder in het bereide FITC-Dextran/Tween20/microsphere-mengsel en trek langzaam de spuit terug totdat het mengsel in de katheter zit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de katheter aanwezig zijn. Plaats de spuit met de geladen katheter in de pomp van de spuit.
Stel de pomp in op 10 microliter per minuut en laat het draaien totdat er een klein druppeltje microsphere-mengsel aan de kathetertip verschijnt. Plaats nu een vatclip op de arteria carotis interna en span een van de eerder voorbereide proximale knopen rond de arteria halsslagader aan. Maak met een microschaar een kleine diagonale incisie in de externe halsslagader ongeveer 0,5 millimeter distaal van de ligatiedraad, zodat de incisie iets kleiner is dan de diameter van de katheter.
Neem eventueel bloed op met een steriele doek. Start kort de spuitpomp om een druppel microsfeermengsel aan de kathetertip te vormen, zodat er geen lucht meer in de kathetertip zit. Open de incisie in de externe halsslagader en plaats de katheter met fijne micropincetten.
Vervolgens sluit je de katheter in de externe halsslagader vast door de proximale hechting rond de arteria externe halsslagader aan te spannen. Pomp geleidelijk met 10 microliter per minuut totdat de slagader zichtbaar vergroot en de groene FITC-kleurstof de externe halsslagader vult, waarmee de injectie succesvol is bevestigd. Verwijder vervolgens de vatclip uit de arteria halsslagader interna.
Verhoog vervolgens de doorstroming van de spuitpomp tot 20 microliter per minuut. Bevestig een succesvolle microsfeerinjectie door te controleren of de interne halsslagader distaal van de achterste pariëtale arteriebifurcatie gevuld is met FITC-kleurstof. Zodra de injectie succesvol is, verwijder je de draad die de arteria halsslagader ligaterde, zodat het microsfeermengsel naar de interne halsslagader kan stromen.
Tijdens de injectie is de FITC-kleurstof nog steeds waargenomen in de externe halsslagader. Zet de spuitpomp uit zodra het mengsel in de katheter de 80 microliter grens bereikt om de injectie te stoppen. Bind vervolgens de arterie halsslagader van de algemene halsslagader af, knip de interne halsslagader af en verwijder voorzichtig de katheter, terwijl de bevestigingsdraad op zijn plaats blijft.
Ligaer de externe halsslagader permanent door de draad die de katheter had vastgezet aan te spannen. Verwijder de vatclip en de draad rond de arteria halsslagader, de arteria internal carotis en de achterste pariëtale arteria om de bloedcirculatie te herstellen. Het succes van de microvasculaire embolie-operatie werd bevestigd door post mortem in situ beeldvorming van het hele lichaam en de volledige hersenen, vier dagen na de operatie.
Een sagittale hersensnede toonde het vastzitten van microsferen in de hersenen. Geëxtraheerde muizenhersenen die één dag na de operatie werden afgebeeld, toonden aan dat microsferen voornamelijk in de ipsilaterale hemisfeer zaten, binnen het flowgebied van de middelste en voorste cerebrale arterie. Het aantal microsferen in hersensneden nam significant toe toen Tween20 aan het microbolmengsel werd toegevoegd.
Muizen verloren minder gewicht en herstelden sneller na de operatie wanneer ze werden geïnjecteerd met een microbolmengsel dat Tween20 bevatte. Fluorescentiemicroscopiebeelden van de hersenschors, genomen 0,5 uur na de operatie, toonden individuele witte stippen, die microsferen vertegenwoordigden die de haarvaten afsloten. Twee-foton z-stack projectiebeelden toonden microsferen die cerebrale microvasculaire embolismen veroorzaakten met verminderde perfusie.
Embolismen veroorzaken ook verstoring van de bloed-hersenbarrière met zichtbare kleurstoflekkage uit de vaten.
Overzicht
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde stapsgewijze aanpak voor het creëren van een chronisch craniaal venster en een muismodel voor microvasculaire embolie, geoptimaliseerd voor in vivo twee-foton microscopie-imaging. De methode maakt gebruik van fluorescerende polystyreen microsferen om de effecten van capillaire verstopping te onderzoeken.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Microvasculair onderzoek
- In vivo beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de gevolgen van microvasculaire occlusies is cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe behandelstrategieën.
- Real-time imaging maakt het mogelijk om fluorescente deeltjes in het cerebrale capillaire netwerk te volgen.
- Eerdere studies hebben aangetoond dat capillaire verstopping kan leiden tot lokale weefselschade.
- Dit onderzoek heeft tot doel de mechanismen van embolusklaring in de hersenen te verduidelijken.
Doel van de studie
- Om de korte- en langetermijneffecten van capillaire verstopping te onderzoeken.
- Om te begrijpen hoe microvasculaire occlusies de bloedstroom en de bloed-hersenbarrière beïnvloeden.
- Om potentiële behandelstrategieën te verkennen voor aandoeningen die gerelateerd zijn aan microvasculaire schade.
Gebruikte methoden
- Creëren van een chronisch craniaal venster in muizen voor beeldvorming.
- Injecteren van fluorescente microsferen om microvasculaire embolieën op te wekken.
- Gebruik van tweefotonmicroscopie voor real-time beeldvorming.
- Beeldvorming na de chirurgie om de lokalisatie van microsferen in de hersenen te bevestigen.
Belangrijkste resultaten
- Microsferen waren hoofdzakelijk gelokaliseerd in het ipsilaterale hemisfeer.
- Er werden verhoogde aantallen microsferen waargenomen bij de toevoeging van Tween20.
- Muizen die waren geïnjecteerd met Tween20 vertoonden een sneller herstel na de operatie.
- Fluorescentiemicroscopie onthulde occlusie van haarvaten door microsferen.
Conclusies
- Deze methode maakt gedetailleerde studie van microvasculaire occlusies in vivo mogelijk.
- De bevindingen kunnen leiden tot nieuwe inzichten in behandelstrategieën voor cerebrale microvasculaire aandoeningen.
- De studie vergroot het begrip van de dynamiek van de bloedstroom en weefselschade in de hersenen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Microvasculaire emboliemodellen met gebruik van fluorescente microsferen en in vivo tweefotonmicroscopie bieden een robuust platform voor het ontleden van de mechanismen en gevolgen van cerebrale micro-occlusies. Deze benadering maakt resolutie-rijke, longitudinale tracking van vasculaire gebeurtenissen en weefselreacties mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij de validatie van neurovasculaire targets in een vroeg stadium. De reproduceerbaarheid van het model en de kwantitatieve imaging-outputs maken het tot een waardevol instrument voor portfoliotriage en mechanistische risicoreductie bij de ontdekking van neurovasculaire geneesmiddelen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het toetsen van hypothesen over neurovasculaire letsels mogelijk via de gecontroleerde inductie van micro-occlusies.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door de respons van vaten, cellen en de bloed-hersenbarrière in de loop van de tijd te visualiseren.
- Faciliteert de functionele validatie van targets door embolieën te koppelen aan neerwaartse weefselschade en klaringdynamiek.
Screening & Assayontwikkeling
- Biedt een gevalideerd in vivo systeem voor kwantitatieve beoordeling van microvasculaire occlusie en reperfusie.
- Levert reproduceerbare high-content imaging-resultaten die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en vergelijkingen tussen verschillende studies.
- Maakt screening mogelijk van kandidaat-interventies die gericht zijn op het opheffen van embolieën of neurovasculaire bescherming.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Komt overeen met ziekterelevante modellen van cerebrale microvasculaire schade voor translationeel onderzoek naar biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale tracking van uitkomsten mogelijk te maken.
- Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang door weefsel- en vasculaire reacties op micro-occlusies te kwantificeren.
Integratie van pijplijn & workflow
Dit model is geïntegreerd in het continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek en slaat een brug tussen mechanistische studies en translationeel onderzoek in de neurovasculaire biologie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetoetsing met betrekking tot microvasculaire beschadiging en klaringmechanismen met behulp van real-time imaging.
- Screening: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare read-outs voor het evalueren van therapeutische kandidaten in vivo.
- Analytics: Maakt statistische vergelijking mogelijk van de embolielast, weefselschade en het herstel over verschillende experimentele groepen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt mechanistische bevindingen met ziekterelateerde eindpunten en de ontwikkeling van biomarkers.
- Enterprise Reuse: Biedt een gestandaardiseerd, herbruikbaar platform voor neurovasculair onderzoek en het testen van interventies.
Operationele & zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van neurovasculaire targets en mechanische risicoreductie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid door gestandaardiseerde beeldvormings- en injectieprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het verstrekken van kwantitatieve, longitudinale gegevens over vasculaire en weefselresultaten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van neurovasculaire programma's op basis van robuust in vivo bewijs.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie, in vivo imaging en kwantitatieve analyse van vasculaire gebeurtenissen.
- Vereist toegang tot tweefotonmicroscopie en infrastructuur voor post-mortem 3D-imaging.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams van injectiemengsels en imaging-protocollen voor reproduceerbaarheid.
- Aanpasbaar aan verschillende muismodellen, maar kan optimalisatie vereisen voor verschillende vasculaire gebieden.
- Potentiële beperkingen omvatten de technische complexiteit en de noodzaak voor longitudinale monitoring van de dieren.
