Aëroob testen van biologische afbraak van materialen met behulp van een natuurlijk marien zeewaterinoculum en een respirometer met gesloten lus

Ons onderzoek kwantificeert de aerobe biologische afbraaksnelheid en de mate van natuurlijke materialen in het mariene milieu met behulp van natuurlijk zeewaterinoculum voor gegevensvergelijking. Onze huidige experimentele uitdagingen omvatten beperkte testcapaciteit en een gebrek aan infrastructuur om te voldoen aan de groeiende vraag naar biologische afbraaktesten, terwijl we uniforme en transparante methoden in alle laboratoria waarborgen. Om te beginnen verzamel je 10 tot 20 liter zeewater in een 20-liter, zuur uitgelogde fles met een grote Niskin-fles.

Breng de gevulde mandblos terug naar het laboratorium. Doe één liter heel zeewater uit de fles over in een zuur uitgelogde, één liter amberkleurige HDPE-fles voor deeltjesanalyse van koolstof en stikstof. Filter het door een 0,2-micrometer, stikstofarme, cellulose-acetaat membraan.

Vul nu een volumetrische kolf van één, twee of vier liter halverwege met zeewater. Als het zeewater organisch materiaal met een hoog deeltje bevat, zeef het dan door een 20-micrometer netwerk om grote heterogene deeltjes te verwijderen. Vervolgens verzamel je 60 milliliter filtraat in een zuuruitgelogde polyethyleenfles voor analyse van opgeloste anorganische en organische stikstof en fosfor.

Bedek de opening van het mandfles losjes om aerobe omstandigheden mogelijk te maken. Bewaar tot zeven dagen in het donker bij 30 graden Celsius. Plaats vervolgens 10 tot 15 gram van het experimentele substraat in een 50-milliliter, roestvrijstalen freesjarenpot.

Met een stalen kogel van 20 millimeter. Dompel de molenpot 15 minuten onder in vloeibare stikstof om hem bros te maken. Bevestig de freesjar in het kogelmolenopzet.

Stel dan het instrument in op 30 hertz en twee minuten en 30 seconden, en druk op start. Voer vier keer maalen met 30 seconden koeling in vloeibare stikstof tussen elke cyclus. Maal het substraat tot een uniforme deeltjesgrootte tussen 0,10 en 0,25 millimeter vóór de start van de test.

Met een precisiebalans en 0,001 gram gevoeligheid weeg 0,5 gram per liter ammoniumchloride en 0,1 gram per liter monobasisch kaliumfosfaat. Voeg de anorganische voedingsstoffen toe aan de kolf. Breng het volume mee om te markeren met zeewater.

Doe het er dan in een roerreep en roer op een roerplaat tot alle zouten opgelost zijn. Op een analytische balans weeg je 20 milligram van het experimentele of controlesubstraat af. Noteer het volledige gewicht van de uitlezing en leg het flesje apart.

Om de reactorvaten op te zetten, gebruik je een zuurgelekte, 75-milliliter volumetrische pipet met een gemotoriseerde pipetregelaar en aspireer je het zeewater om 75 milliliter van het met voedingsstoffen aangevuld zeewater in elk reactorvat te doseren. Verwijder ongeveer drie milliliter zeewater uit elk vaartuig. Plaats het vervolgens op een schoon oppervlak naast het vat om het gemalen substraat van het beschadigde flesje te spoelen.

Breng nu het gefreesde substraat over in het bijbehorende reactorvat vanuit het verscheurde flesje. Plaats een O-ring op de rand van het reactorvat. Plaats dan een deksel met twee poorten over de O-ring en sluit het vast met een schroefdop.

Verbind elk reactorvat met de bijbehorende gas- of condensatieleidingen. Steek de gasleidingen stevig in de juiste inlaat- en uitlaatpoorten op het deksel. Zet het shakerplatform in op 0,05G in continue modus.

Controleer visueel of alle vaten vastzitten en sluit dan de broedmachinedeur. Navigeer in de instrumentensoftware naar Experiment en klik op Setup. Voer de start- en eindkanaalnummers in in de dropdownmenu's die overeenkomen met bezette kanalen.

Stel de verversingsdrempel in op 0,50. Verversinterval naar NA en verversvenster naar Auto. Vink dan het vakje aan voor purge-sensoren onder Diverse Setup.

Zorg ervoor dat de automatische volumemeting, zuurstofverbruik positief en Open Flow Mode niet zijn geselecteerd. Stel het sampleinterval in op 8,00. Stel daarna de gas- en tijdeenheden in zoals nodig.

Als je een primaire temperatuurprobe gebruikt voor correctie van de incubatietemperatuur, zorg dan dat Handmatig Kamer Temperaturen niet is geselecteerd. Vink het vakje aan voor Ventilatiemodus en zorg dat Drain Mode niet is geselecteerd. Selecteer nu Chamber Setup en voer de beschrijvende kanaallabels in.

Als er een lek wordt aangegeven, zorg dan dat de O-ring schoon, zittend en vrij van deeltjes of vezels is. Draai de schroefdop aan. Controleer de slangaansluitingen bij inlaat en uitlaat.

Snijd versleten of vervormde buizen af met een scherp mes om schone sneden te maken. Selecteer in het menu Tools, klik vervolgens op Servicemenu en bevestig dat de primaire temperatuursonde 30 graden Celsius meet met twee graden variatie en stabiel is. Klik op Run om het experiment te starten.

Sla het experimentbestand op onder een beschrijvende naam, inclusief de datum, en noteer de bestandsnaam op het datablad. De cumulatieve kooldioxideproductie over 84 dagen bevestigde de verwachte prestaties. Gedurende 84 dagen liet cellulose na een korte vertraging een snelle kooldioxideproductie zien en bereikte ongeveer 700 micromol.

PHA liet een langzamer beginpercentage zien over drie dagen. En de zeewatercontrole bleef laag op 150 micromol. Individuele negatieve controlereplicaten vertoonden een lage variabiliteit, waarbij alle krommen dicht bij elkaar bleven.

Cellulose positieve controlereplicaten vertoonden consequent lage variabiliteit, wat stabiele prestaties over alle vier de replicaten bevestigde. In de negatieve resultaatdataset vertoonde replicate vijf een abnormale piek in kooldioxideproductie, waarschijnlijk door labiele organische materie, maar de cumulatieve productie begon te stabiliseren bij 100 micromol. Replicaten één op de zes hadden een lagere cumulatieve kooldioxideproductie vergeleken met anderen, wat wijst op mogelijke technische problemen.

De standaardfout van de gemiddelde cumulatieve kooldioxideproductie in de negatieve controle was 2,5%, wat wijst op een lage variabiliteit tussen replicaten. De standaardfout voor de cellulose-positieve controle was 0,83%, wat de hoge reproduceerbaarheid van de biodegradatietest verder bevestigde. PHA heeft een hoge mineralisatie dicht bij de positieve controle met standaardfouten vergelijkbaar met de controle.

Dit protocol pakt de kloof aan in gestandaardiseerde, toegankelijke methoden voor het screenen van de biologische afbreekbaarheid van materialen in de mariene omgeving voor industrie, academische instellingen en regelgevende instanties. Het protocol biedt een snellere gestandaardiseerde manier om deze biologische afbraak direct te meten, met een kortere testduur bij gelijktijdige monsterevaluatie. Het protocol maakt gestandaardiseerde tests met hoge doorvoer mogelijk voor materiaal- en laboratoriumvergelijkbaarheid voor machine learning en voorspellende modellering van materiaalprestaties.