Gestandaardiseerde SDS-PAGE workflow voor gepersonaliseerde eiwitcoronaprofilering bij vroege kankerdetectie

We bestuderen hoe nanodeeltjes met bloed interageren om vroege kankersignalen te onthullen, met als doel een eenvoudige reproduceerbare en voornamelijk niet-invasieve diagnostische test. Om te beginnen verdun je de vier milligram per milliliter basisoplossing van grafeenoxide-nanosheets in ultrazuiver water tot de gewenste concentratie. Sonicaer de verdunde oplossing twee minuten lang op 28% amplitude met een pulsinstelling van acht seconden aan en zes seconden uit om een uniforme dispersie te garanderen.

Kwantificeer de concentratie van de verspreide oplossing met behulp van ultraviolet zichtbare spectroscopie. Meet vervolgens de hydrodynamische grootte en zetapotentiaal van de oplossing met dynamische lichtverstrooiing met een 633 nanometer helium-neonlaser. Verdun het monster in ultrazuiver water volgens de QVet-detectielimieten.

Verdunn vervolgens het commercieel gelyofilieerde menselijke plasma met ultrazuiver water indien nodig. Centrifugeer het gereconstrueerde plasma op 18.620 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius. Verzamel het supernatant en bewaar het op min 80 graden Celsius tot verder gebruik.

Kwantificeer nu de eiwitconcentratie met behulp van de bicinchoninezuurtest om de plasmaverdunning aan te passen en de optimale nanodeeltje-plasmaverhouding te bepalen. Meng het geselecteerde volume nanodeeltjes met plasma om de doelverhouding tussen de twee te bereiken. Broed het mengsel een uur uit bij 37 graden Celsius.

Om de eiwitcorona te isoleren, centrifugeer je de nanodeeltjesplasmamonsters op 18.620 G bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Was de resulterende pellet met 200 microliter ultrazuiver water. Daarna weer ophangen en opnieuw centrifugeren.

Na de laatste wasbeurt bevestig de aanwezigheid van een compacte pellet als bewijs van isolatie van nanodeeltjes-eiwitcomplexen. Vervolgens meng je het reduceringsmiddel, de laadbuffer en het water om het berekende laadbuffervolume te bereiken. Hang de pellet opnieuw in de voorbereide laadbuffer.

Kook de suspensie vervolgens 10 minuten op 100 graden Celsius. Centrifugeer het gekookte monster op 18.620 G bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Verzamel het supernatant in een nieuwe buis.

Bereid nu de eiwitladder voor door de molecuulmassastandaard in ongekleurde buffer te verdunnen met de gekleurde buffer. Verdun de 10 x Tris-Glycine-SDS loopbuffer tot één x concentratie. Stel de elektroforesekamer samen met een vrije gradiënt gel van vier tot 20% kleuring.

Giet daarna de loopbuffer erin tot het door de fabrikant aanbevolen niveau is aangegeven. Laad 10 microliter monster in elke put. Pipetteer vervolgens zeven microliter ladder in elke put.

Laat de gel ongeveer 90 minuten op kamertemperatuur draaien op 150 volt. Sla de gelafbeelding op als een tiff-bestand in dezelfde map als de scripts. Daarna open je gelverwerking.

m in MATLAB. Voer de naam van de gelafbeelding in als afbeeldingsnaam. Voer vervolgens de index van één ladderbaan in als indexmarker.

Voer het script uit. Het voltooien van de stappen wordt aangegeven in het commandovenster en er verschijnen vier vensters op het scherm. Open nu figuur één met het originele gelbeeld bovenaan en de correctie voor het schuine baan-effect onderaan.

Pas de waarden van linker- en rechtercorrectie aan om de correctieparameters af te stemmen. Open Figuur Twee. Het bevat het beeld dat is gecorrigeerd voor het schuine baan-effect bovenaan en het achtergrondbeeld verwijderd onderaan.

Pas de waarde van BKG par X in het script aan om het verwijderen van de achtergrond af te stemmen. Let op dat alle geïdentificeerde rijstroken in Figuur Twee als verticale witte lijnen zijn aangegeven. Open nu Figuur Drie met het intensiteitsprofiel van de marker lane met de gedetecteerde pieken aan de linkerkant en een niet-lineaire passing met de R kwadraatwaarde aan de rechterkant.

Controleer dubbel of het aantal verwachte banden in de ladderbaan overeenkomt met het aantal gedetecteerde pieken dat voor de fittingprocedure is gebruikt. Open vervolgens Figuur Vier met de genormaliseerde intensiteitsprofielen voor alle gedetecteerde banen in de gel. Stel de exportparameter in op één om de intensiteitsprofielen als functies van molecuulgewichten in een Excel-bestand te exporteren.

Voer het script uit. Na voltooiing wordt er een Excel-sheet gegenereerd in de werkmap met de absolute en genormaliseerde profielen als functies van molecuulgewicht in de eerste kolom. Open dan het Gel Profiles Pro M-bestand en voer het script uit.

Er verschijnen vier vensters op het scherm. Open Figuur Vijf met de absolute intensiteitsprofielen bovenaan en de bijbehorende totale intensiteiten onderaan voor elke baan. En Figuur Zes met de genormaliseerde intensiteitsprofielen voor elke rijbaan.

Met de molecuulmassa-as onderverdeeld volgens de bereiken die als reg in het script zijn gespecificeerd. Stel de exportgegevens in op één om de absolute en genormaliseerde integrale gebieden te exporteren. Voer het script uit.

Na voltooiing wordt er in de werkmap een spreadsheet gegenereerd met de geëxporteerde absolute en genormaliseerde gebieden binnen de gespecificeerde molecuulgewichtbereiken. Tot slot, open Figuur Zeven en Acht. Ze bevatten het histogram van absolute en genormaliseerde oppervlakten voor elke baan, respectievelijk gegroepeerd per baan en oppervlakte.

Het hier gepresenteerde protocol stelt een gestandaardiseerde en reproduceerbare workflow vast voor het isoleren en karakteriseren van de eiwitcorona die na incubatie met plasma op nanodeeltjes wordt gevormd. Deze methode levert zeer consistente SDS-paginaprofielen op die biologisch betekenisvolle en diagnostisch relevante kenmerken van elke gepersonaliseerde corona kunnen vastleggen. De SDS-paginaprofielen verkregen over alle aandoeningen waren zeer reproduceerbaar.

Verhoogde plasmaconcentraties van 5% tot 50% resulteerden in sterkere signaalintensiteiten in het 30 tot 80 kilodalton-gebied van de SDS-paginaprofielen. De geautomatiseerde pipetwerkstroom leverde vrijwel identieke elektroforetische profielen op. Grafeenoxide produceerde consequent goed opgeloste stabiele coronaprofielen, wat werd toegeschreven aan het hoge oppervlak en de geladen eigenschappen.

De grootteverdelingen van kleine, middelgrote en grote grafeenoxidemonsters waren smal, niet-overlappend en gecentreerd rond respectievelijk 100, 300 en 750 nanometer. SDS-paginaprofielen van eiwitcoronas gevormd op grafeenoxide waren vergelijkbaar in de grootte. Hoewel duidelijke verschillen werden waargenomen tussen verschillende verdunningen, produceerden lagere plasmaconcentraties intensere banden in specifieke molecuulgewichtbereiken, wat wijst op selectieve eiwitverrijking.

Bij intermediaire plasmaverdunningen toonden de dichtheidsmetrische profielen ziektespecifieke verschillen, vooral in het gebied van 20 tot 30 kilodalton waar PDAC-monsters een verminderde signaalintensiteit vertoonden. Het SDS-pagina-gebaseerde profileringsmodel identificeerde alleen alleen zowel PDAC- als controlemonsters correct met 83% nauwkeurigheid en een gebalanceerde gevoeligheid en specificiteit. Het gecombineerde diagnostisch model, dat SDS-pagina-coronaprofielen en CA 19 tot negen niveaus bevat, bereikt de hoogste nauwkeurigheid, gevoeligheid en specificiteit bij het classificeren van PDAC-patiënten.

We gebruiken geautomatiseerde workflows, niet-technologiegebaseerde technieken en AI-gedreven tools om kankerdiagnostisch onderzoek te bevorderen. Ons protocol is snel, gebruiksvriendelijk, WHO-conform, en zorgt voor gestandaardiseerde, reproduceerbare eiwit-coronavingerafdrukken met een sterke diagnostische relevantie.