Amyloïde en de Cross-Beta Architectuur

Ons onderzoek gebruikt röntgenvezeldiffractie om de structuur van cross-beta amyloïde fibrillen en de moleculaire organisatie ervan te onderzoeken. Dit protocol gebruikt röntgenvezeldiffractie om cross-beta patronen te bevestigen en fibrillenarchitecturen te verduidelijken. Dit protocol maakt structurele analyse van amyloïde fibrillen mogelijk, van het bevestigen van cross-beta organisatie tot het verduidelijken van verdere moleculaire details.

Om te beginnen lijn je de eiwit- of peptidefibrillen zo dat een bundel ontstaat waarvan de vezelassen idealiter allemaal parallel lopen. Smelt kaarswas met een hete plaat tot het vloeibaar wordt. Snijd met een glassnijder 1 millimeter borosilicaatglascapillairen tot een lengte van ongeveer 2-3 centimeter.

Doop de gesneden haarvaten kort in de vloeibare was. Trek vervolgens de kaarswas door capillairwerking omhoog tot ongeveer 1-2 millimeter binnen de capillair. Gebruik nu plasticine om de afgesloten haarvaten horizontaal te bevestigen in een petrischaal.

Houd een afstand van 0,5-2 millimeter tussen de met was gevulde uiteinden van de haarvaten. Met een pipet laat je voorzichtig een druppel fibrilleoplossing van 10 microliter tussen de met was gevulde uiteinden van de twee haarvaten hangen. Bedek de petrischaal om het monster tegen stof te beschermen en laat het een nacht verdampen.

Daarna sluit het bord af om een gecontroleerde droogomgeving te behouden. Om de amylode fibrillen in een glazen capillair uit te lijnen, bevestig je een 1-milliliter spuit met rubberen slang aan het brede uiteinde van een 0,7 millimeter diameter siliconenglazen capillair. Aspiraat 2-3 centimeter fibrillususpensie in de capillair.

Sluit één uiteinde van de capillaire af met gesmolten was en laat het andere uiteinde open om verdamping mogelijk te maken. Plaats de capillaire verticaal en laat deze drogen totdat er een opgedroogde schijf is gevormd. Om fibrillen als mat of dunne film uit te lijnen, plaats je een fibrillenmonster met hoge concentratie op een glazen glaasglaasje en dek je af voordat je het 24 uur aan de lucht laat drogen.

Bevestig voorzichtig de vezelbundel op een goniometerkop en oriënteer deze zo dat de röntgenbundel door de bundel heen gaat. Als je een vlindermatmonster gebruikt, oriënteer deze dan zo dat de röntgenstraal door de rand van de mat gaat. Onderzoek het monster onder een lichtmicroscoop uitgerust met een kruispolarisator om dubbelbreking te observeren.

Plaats het monster in de röntgenbundel op basis van of het een vezelbundel, mat of schijf is. Verzamel een diffractiepatroon met eigen röntgenapparatuur of synchrotronstraling. Om data-analyse uit te voeren, upload je het bestand in de CLEARER diffractiepatroonanalysesoftware.

Navigeer naar Diffractiepatroon en Diffractie-instellingen om diffractie-instellingen in te voeren, inclusief pixelgrootte, röntgenbron en afstand tussen monster en detector. Klik op Beeldverwerking en Roteer om het diffractiebeeld te draaien zodat de meridiaan verticaal is. Gebruik de centreringsmodule door naar Diffractiepatroon te navigeren en op Afbeelding Midden te klikken om het beeld te centreren.

Definieer de meridiaan- en equatarassen. Bewaar de gecentreerde afbeelding voor verdere analyse. Vervolgens specificeer je een geschikte hoek langs de meridiaan en de evenaar.

Klik op Diffractiepatroon en vervolgens op Radially Average-module om een grafiek van de positie van het diffractiesignaal te genereren. versus intensiteit. Ga vanuit het Diffractiepatroon naar de Peak Find-module om het diffractiesignaal te meten en automatisch uit te geven.

Pas de piekzoekbreedte aan om echte signalen zonder ruis te detecteren. Gebruik de zoom- en meetoptie om de uitgang van het diffractiesignaal te verifiëren met peak find. Verken potentiële eenheidsceldimensies met behulp van de module Unit Cell Optimization.

Voer initiële schattingen in op basis van sterke equatoriale signalen en definieer de minimum- en maximumindices voor celzoek. Bereken de afmetingen van potentiële eenheidscel en vergelijk de voorspelde posities van het diffractiesignaal met de waargenomen reflecties. Kies de eenheidscel die het beste past bij de data en het monster.

Om moleculaire modellen te construeren, maak je 3D-arrangementen van peptiden in een bètabladconfiguratie die past bij de bepaalde eenheidscel. Zorg ervoor dat alle symmetrie-gerelateerde componenten zijn opgenomen. Klik vervolgens op Diffractiesimulatie gevolgd door Structuren en Structuurkettinggenerator en laad het PDB-model.

Wijs de vezelas en bundelas toe, voer eenheidscelafmetingen toe en controleer dan op sterische botsingen. Navigeer naar Diffractiesimulatie en klik op Vezeldiffractiesimulatie om de PDB-coördinaten te uploaden naar de Fiber Diffraction Simulatiemodule. Voer de richting van de vezelas, bundeloriëntatie, eenheidscelafmetingen, röntgenbron en detectorinstellingen in, en klik vervolgens op Simuleren om de simulatie uit te voeren.

Zorg ervoor dat de bundelas loodrecht staat op de vezelas. Ga dan naar Bestand en klik op Opslaan Als om de simulatie-instellingen als html-bestanden op te slaan voor latere bewerking. Sla het gesimuleerde diffractiepatroon op in RAW-formaat of als een TIFF-bestand.

Vergelijk het gesimuleerde patroon met het experimentele diffractiepatroon. Meet gesimuleerde diffractiesignalen met dezelfde analyseworkflow. Noteer en vergelijk deze waarden met experimentele gegevens.

Elektronenmicrografieën toonden een hoge dichtheid van amyloïde fibrillen op het rooster, geschikt voor de voorbereiding van een röntgenvezelmonster. Vezels die met rekframes zijn uitgelijnd, produceerden een karakteristiek cross-beta diffractiepatroon met een meridianale reflectie van 4,76 ångström en equatoriale reflecties die voortkwamen uit kettinglengte, plaatafstand en protofilamentgrootte. Een geïdealiseerd kruis-beta diffractiepatroon toonde aan dat meridianale en equatoriale reflecties overeenkomen met herhaalde afstanden langs de vezelassen.

Een goed gecentreerd diffractiepatroon was symmetrisch met equatoriale en meridianale toppen die in positie overlappen. Diffractiepieken werden automatisch gedetecteerd en opgesomd met behulp van piekbepalingsanalyse. De gedetecteerde diffractiepieken werden gebruikt om plausibele eenheidscelafmetingen te identificeren.

Een structureel model werd opgesteld met behulp van de geïdentificeerde eenheidscel en gevisualiseerd voorafgaand aan de diffractiesimulatie. Gesimuleerde diffractiegegevens die uit het voorgestelde structurele model zijn gegenereerd, toonden redelijke overeenstemming met het experimentele diffractiepatroon in zowel reflectieposities als relatieve intensiteiten. Het over elkaar leggen van gesimuleerde en experimentele diffractiepatronen toonde verder de uitlijning van de bijbehorende reflecties aan.

Een juiste uitlijning van het monster is cruciaal omdat dit de kwaliteit van de diffractiegegevens en de informatie die daaruit kan worden verkregen bepaalt. Dit werk maakt atomaire resolutie van structurele modellering en integratie met andere structurele technieken, zoals AFM, mogelijk om gedetailleerde moleculaire structuren mogelijk te maken.