In-vitro Reconstitutie van bacteriële ubiquitinatie en VCP/p97-gemedieerde eliminatie

Ons werk onthult hoe VCP of p97 fungeert als een cytosolische verdediger tegen meerdere verschillende pathogenen. Dit ontsluit het potentieel van VCP of p97 voor therapeutische toepassingen en bio-engineeringstrategieën. Naast routinematige biochemie worden superresolutiemicroscopie, cryo EM en cryo ET gebruikt om te bepalen hoe deze gastheereffectoren zich organiseren op een pathogeen om ze te vernietigen.

Om te beginnen, kweek de streptococcus pneumonie met zes stammen serotype twee 's nachts bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide in het Todd Hewitt gistmedium. Inoculeer één deel van de nachtkweek in 10 delen verse Todd Hewitt-gistmedium en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide totdat de optische dichtheid bij 600 nanometer 0,4 bereikt. Meng vervolgens 900 microliter van de streptococcus-pneumoniecultuur met 600 microliter glycerol van 50% en bewaar de glycerolvoorraad bij min 80 graden Celsius.

Ontdooi vervolgens een verse voorraad streptokokkenlongontsteking van min 80 graden Celsius en inoculeer deze volledig in vijf milliliter Todd Hewitt-gistmedium. Neem ongeveer 10 op de kracht van zeven streptokokken-pneumoniecellen. Om de cellen grondig te wassen, suspendeer je de bacteriën opnieuw in de reactiebuffer en centrifugeer je op 21.000 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Stil de pellet opnieuw met een 549 myzadiercellysaat. Voeg vervolgens gezuiverde ubiquitine en één millimolair adenosinetrifosfaat toe en laat het mengsel één tot twee uur incuberen bij 27 graden Celsius. Spoel de bacteriën vervolgens één keer met een reactiebuffer die één molair ureum bevat, gevolgd door twee extra wasbeuringen met alleen de reactiebuffer.

Fixeer de bacteriën met 1% paraformaldehyde. Na fixatie incubeer je de cellen met PBS, dat één milligram glycine per milliliter bevat gedurende 15 minuten. Daarna was je twee keer met PBS.

Bereid een reactiemengsel door ubiquitine te combineren met andere benodigde componenten in de reactiebuffer. Stel het totale volume van het reactiemengsel aan op 100 tot 150 microliter. Suspendeer de bacteriën opnieuw in het reactiemengsel dat ubiquitine bevat en incubeer de suspensie twee uur bij 27 graden Celsius.

Na het drie keer wassen van de bacteriën met reactiebuffer, die ureum bevat, fixeer je ze met 1% paraformaldehyde. Na fixatie incubeer je de cellen met PBS, dat één milligram glycine per milliliter bevat gedurende 15 minuten. Incubeer het monster vervolgens in 3% BSA gedurende een uur bij 27 graden Celsius, en was het monster twee keer met PBS.

Suspendeer de ubiquitineerde bacteriën opnieuw in een primaire antistofoplossing, bereid in hogere concentraties dan normaal gesproken wordt gebruikt bij immunofluorescentietests. Breng dan een uur uit bij 27 graden Celsius. Na het twee keer wassen van de bacteriën met PBS, word ze opnieuw opgeschorst in het overeenkomstige secundaire antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 555.

Giet nu ongeveer 10 tot 20 microliter van het gelabelde bacteriële monster op een glazen glaasje en meng vijf tot tien microliter montagemedium erin, met of zonder DAPI. Plaats een deksel over het monster en gebruik vloeipapier om overtollig vocht af te vegen. Combineer zes micromolaire VCP p97 met één micromolair NPLOC4 en één micromolair UFD-1.

Pas het volume van het reactiemengsel aan op ongeveer 90 microliter, gebruik een reactiebuffer, en incubeer twee uur op ijs. Voeg vervolgens één tot twee millimolaire adenosinetrifosfaat toe aan het reactiemengsel dat p97 UFD-1, NPLOC4, bevat. Combineer dit vervolgens met 10 tot de kracht van zeven ubiquitineerde streptococcus-pneumoniecellen, en incubeer twee uur bij 37 graden Celsius.

Onmiddellijk na de behandeling neem je een aliquot van 10 microliter uit het reactiemengsel en voer je een seriële verdunning uit. Plaats 10 tot 20 microliter van elke verdunning op de hersen-hartinfusie-infusieplaten. Beoordeel kolonievormende eenheden tussen het nuluur en het tijdstip van twee uur.

Bereken het percentage bacteriële levensvatbaarheid door het aantal CFU van twee uur te delen door het nul-uur CFU-aantal en te vermenigvuldigen met 100. Significante ubiquitinatie van streptococcus pneumoniae werd waargenomen wanneer behandeld met ofwel zoogdiercellysaat of een gereconstitueerd E-1, E-2, E-3 enzymsysteem. Het signaal van ubiquitinatie ontbrak bij de controle en werd duidelijk verminderd toen ubiquitinated streptococcus pneumoniae werd blootgesteld aan OTUB1, wat de K48-gekoppelde poly ubiquitine-modificatie bevestigde.

Een lijnprofielanalyse toonde volledige overlap tussen ubiquitine en bacteriële signalen, wat hun ruimtelijke colokalisatie bevestigde. Driedimensionale reconstructie bevestigde de ruimtelijke overlap van ubiquitine- en streptococcus pneumoniae-signalen. Wild type p97, gecombineerd met zijn cofactoren UFD1 en NPLOC4, verlaagde de bacteriële levensvatbaarheid tot 10 tot 20% na twee uur, ongeacht of ubiquitinatie werd uitgevoerd met cellysaat of met een gezuiverd enzymsysteem.

Er werd geen vermindering van bacteriële levensvatbaarheid waargenomen wanneer ubiquitinatie werd weggelaten, wanneer p97 door warmte werd geïnactiveerd, of bij het gebruik van de katalytisch inactieve p97, E57 8Q-mutant, wat bevestigt dat zowel ubiquitinatie als actief p97 essentieel zijn voor bacteriële doden. Onze studie opent de deur naar hoe gastheer-E3 ubiquitine-ligasen verschillende pathogenen aanpassen en de effectormechanismen onderzoeken om de infectieuze bedreigingen te verwijderen. Vervolgens willen we onderzoeken hoe p97 of VCP wordt gereguleerd, en verder ontwikkelen om de antibacteriële werking te verhogen.