Fenolrode draad-gebaseerde bemonsteringsprocedure voor niet-gerichte traanvloeistoflipidomics bij de biomarkerontdekking
December 12th, 2025
Dit protocol beschrijft een uniek klinisch protocol voor het verzamelen van menselijke traanvloeistofmonsters met behulp van fenolrode draden en vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS)-gebaseerde workflow om het scheurlipidomische profiel te ontdekken. De eenvoudige methyl tert-butylether (MTBE)/methanol biphasische scheidingsmethode maakt snelle traanlipide-extractie mogelijk met hoge opbrengst voor de ontdekking van traanbiomarkers.
We hebben een meer gestandaardiseerde, eenvoudig te bedienen fenolrode draad-gebaseerde methode ontwikkeld om reproduceerbare traanlipidomische profielen te realiseren voor toekomstige ontdekking van traanbiomarkers. De huidige uitdaging is dat Schirmer-strips irriteren, terwijl haarvaten operatorvariabiliteiten vertonen bij het verzamelen van tranen. Dit belemmert de rapportagebaarheid van experimentele studies en vergelijkingen tussen de studies.
Begin met het dragen van handschoenen en desinfecteer het werkstation grondig om besmetting van het monster te voorkomen. Houd het fenolrode draadje vast aan het uiteinde tegenover de gebogen haak, en zorg ervoor dat je het gebogen haakgebied niet raakt. Vraag het onderwerp om zijn blik in de bovenste neusrichting te richten.
Trek vervolgens voorzichtig het onderste ooglid van het onderwerp naar beneden en steek de fenolrode draad in met de gebogen haak in de onderste temporale palpebrale conjunctiva nabij de buitenste ooghoek. Vraag nu het proefpersoon om voorzichtig zijn ogen te sluiten en het hoofd iets naar voren te kantelen om te voorkomen dat de fenolrode draad contact maakt met de huid op het gezicht. Trek het onderste ooglid van het onderwerp weer naar beneden en verwijder voorzichtig de fenolrode draad, waarbij je contact met het bemonsterde gebied vermijdt.
Noteer de lengte van het bemonsterde rode gebied. En met steriele pincet brengt u de PRT over in een nieuw monsterbuisje. Label en kap nu het monsterbuisje goed.
Als de bemonsterde lengte minder dan 50 millimeter is, vraag dan het subject om één tot drie minuten te rusten en herhaal daarna de verzameling van traanvloeistof met hetzelfde oog. Plaats elke nieuw bemonsterde PRT in een apart monsterbuisje. Maak de handschoenen en pincet grondig schoon met methanol en schone papieren doekjes schoon om eventuele scheurresten of verontreinigingen te verwijderen.
Laat ze daarna helemaal aan de lucht drogen. Sluit alle monsterbuisjes af met parafilm en bewaar ze onmiddellijk bij min 20 graden Celsius voor tijdelijke opslag of min 80 graden Celsius voor langdurige opslag. Was de microschaar en pincet vooraf met methanol voordat je de fenolrode draden verwerkt.
Knip het gebogen haakuiteinde ongeveer de eerste drie millimeter van elke fenolrode draad af. Snijd het bemonsterde gebied tot aan de fenolrode kleurstofvoorkant in twee millimeter stukken en verzamel deze segmenten met een schone 1,5 milliliter organische, oplosmiddeltolerante microcentrifugebuis. Gooi het gebogen haakuiteinde en het ongewenste gebied van PRT weg.
Leg de monsters op ijs om een lage temperatuur te behouden vóór de extractie. Voeg nu 232 microliter ijskoude massaspectrometriekwaliteit methanol toe aan elk monster en laat het 15 seconden vortexen om het grondig te mengen. Sonicaer de monsters in een voorgekoelde ultrasone reiniger gedurende 15 minuten.
Voeg vervolgens 774 microliter HPLC-kwaliteit methyltert-butylether en 194 microliter gedeïoniseerd water toe aan elk monster. Vortex opnieuw 15 seconden om de oplosmiddelen grondig te mengen. Sonicaer de monsters opnieuw in een voorgekoelde ultrasone reiniger voor nog eens 15 minuten.
Na de sonicatie incubeer je de monsters in een ThermoMixer die op vier graden Celsius staat en acht uur lang schudt met 1.200 omwentelingen per minuut. Laat het mengsel vervolgens 10 minuten onaangeroerd op kamertemperatuur staan. Centrifugeer de mengsels op 10.000 G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Na centrifugatie zorg ervoor dat de mengsels zichtbaar gescheiden zijn in twee verschillende vloeibare fasen. Verzamel voorzichtig 700 microliter van de bovenste organische fase met lipiden en breng dit over in een voorgekoelde nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Verwijder de onderste waterige fase, die residuele methyltert-butylether en methanol bevat, als gevaarlijk chemisch afval.
Droog de lipidenextracten vier uur lang met een gekoelde SpeedVac-concentrator die op vier graden Celsius staat. Bewaar vervolgens de gedroogde lipide-extracten bij min 20 graden Celsius voor kortdurende opslag of min 80 graden Celsius voor langdurige opslag. Bereid het methanol-chloroform oplosmiddelmengsel door methanol met chloroform te mengen in een één-op-één volumeverhouding.
Reconstrueren de gedroogde lipide-extracten met 50 microliter van het ijskoude methanol-chloroform oplosmiddelmengsel. Sonicaer de gereconstitueerde oplossing in een voorgekoelde ultrasone reiniger gedurende 15 minuten. Centrifugeer nu de gereconstitueerde lipide-extracten op 14.000 G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.
Breng voorzichtig 40 microliter van het resulterende supernatant over in een glazen flesje van autosampler met een glazen inzetstuk. Sluit het buisje stevig af met een niet-gespleten septum, open bovenste kap om het voor te bereiden op vloeistofchromatografie tandem massaspectrometrie-analyse. Met behulp van strenge criteria werden respectievelijk 773, 890 en 1.025 unieke lipidensoorten geïdentificeerd in respectievelijk de groepen die één exemplaar reproduceren, twee en drie monsters repliceren.
Positieve ionenmodus identificeerde 1.302 lipidensoorten met 26% graad A, 13,2% graad B en 60,8% graad C identificaties. Negatieve ionmodus identificeerde 257 lipidensoorten met ongeveer 8,2% grade A, 22,9% grade B en 68,9% grade C identificaties. Ondanks opslaggerelateerde variaties werden 394 unieke lipidensoorten consequent geïdentificeerd in alle drie de monstersets.
De variatiecoëfficiënt tussen de proefpersonen over drie bezoeken was 21,5% in positieve modus en 31,3% in negatieve modus. Dit protocol pakt het ontbreken van een gestandaardiseerde workflow voor reproduceerbare scheurlipidomische analyse aan en kan de vergelijkbaarheid tussen de studies vergroten. Onze op PRT gebaseerde methode minimaliseert irritatie en maakt snelle tranenophoping mogelijk en vermindert de variabiliteit van de operator.
Ons toekomstig onderzoek zal traan-lipidomische biomarkers valideren in grote cohorten en multiomics integreren voor gepersonaliseerde diagnostiek.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor het verzamelen van menselijke traanvloeistofmonsters met behulp van fenolrode draden, gericht op het verbeteren van de reproduceerbaarheid in traanlipidomische studies. De workflow omvat vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) voor lipidextractie en -analyse.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Klinisch onderzoek
Achtergrond
- Huidige methoden voor traanverzameling leiden vaak tot irritatie of variabiliteit.
- Standaardisatie is cruciaal voor betrouwbare biomarkerontdekking.
- Fenolrode draden bieden een minder invasieve alternatief voor traanmonstering.
- LC-MS/MS biedt een robuust platform voor lipidomische analyse.
Doel van het onderzoek
- Om een reproduceerbare methode voor traanlipidomische profilering te vestigen.
- Om operatorvariabiliteit te minimaliseren en de vergelijkbaarheid tussen studies te verbeteren.
- Om toekomstig onderzoek naar traanlipide biomarkers te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Verzameling van traanmonsters met behulp van fenolrode draden.
- Extractie van lipiden met behulp van een bifasische scheidingsmethode.
- Analyse van lipidesoorten via LC-MS/MS.
- Opslag van monsters bij gecontroleerde temperaturen voor stabiliteit.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van meer dan 1.300 lipidesoorten in positieve ionmodus.
- Consistente identificatie van 394 unieke lipidesoorten tussen monsters.
- Inter-subject variabiliteit gemeten op 21,5% in positieve modus.
- Methode verbetert de reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van lipidomische studies.
Conclusies
- De fenolrode draadmethode vermindert irritatie en variabiliteit.
- Gestandaardiseerde workflow verbetert de betrouwbaarheid van traanlipidomische analyse.
- Toekomstig onderzoek zal zich richten op het valideren van lipide biomarkers in grotere cohorten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Standardized, minimally invasive tear fluid sampling is critical for robust lipidomic biomarker discovery in ocular and systemic disease research. The phenol red thread (PRT)-based protocol addresses reproducibility and operator variability, enabling higher predictive confidence in early biomarker validation. This workflow supports translational continuity from discovery to preclinical research by ensuring consistent, high-quality lipidomic data across studies and sites.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reproducible interrogation of tear lipid profiles for biomarker hypothesis testing.
- Reduces biological and procedural variability, supporting functional target validation.
- Facilitates portfolio triage by providing robust, quantitative lipidomic datasets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tear fluid samples for downstream high-resolution LC-MS/MS workflows.
- Improves assay reproducibility and standardization by minimizing operator-dependent variability.
- Supports scalable, user-friendly sample collection suitable for multi-site studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipidomic outputs with disease-relevant biomarker discovery and monitoring.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting consistent sample quality.
- Reduces risk of false negatives in translational biomarker studies due to sampling artifacts.
Pipeline & Workflow Integration
The PRT-based sampling protocol integrates into the biomarker discovery continuum, from early hypothesis testing to preclinical validation, by providing a standardized input for lipidomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven lipidomic profiling and pathway clarification in ocular and systemic disease models.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative tear lipid samples for high-throughput LC-MS/MS analysis.
- Analytics: Enables identification and comparison of over 700 unique lipid species across replicates and conditions.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease monitoring through robust, minimally invasive sampling.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, standardized protocol adaptable across research teams and clinical cohorts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biomarker studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of tear fluid collection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by reducing sampling-related risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires personnel trained in standardized PRT handling and sample processing.
- Needs access to high-resolution LC-MS/MS instrumentation and lipidomics software.
- Demands cross-team adherence to contamination control and storage protocols.
- Adaptable to subjects with low tear volume or sensitivity to traditional sampling methods.
- Potential limitations include storage-related lipid variability and need for further validation in large cohorts.
