Name: Beeldvorming van levende cellen van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-11-14T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Leer live-cell beeldvorming van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose met fluorescentieprobes. Deze methode volgt pH-veranderingen en lysosomale integriteit in real-time.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Shan, B., Pan, H., Najafov, A., Yuan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+in+development+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Necroptosis in development and diseases.</a> Genes Dev. 32, 327-340 (2018).</li>
<li>Kang, K., Park, C., Chan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Necroptosis at a glance.</a> J Cell Sci. 135 (17), jcs260091(2022).</li>
<li>Ai, Y., Meng, Y., Yan, B., Zhou, Q., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+pathways+of+apoptotic%2C+necroptotic%2C+pyroptotic%2C+and+ferroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The biochemical pathways of apoptotic, necroptotic, pyroptotic, and ferroptotic cell death.</a> Mol Cell. 84, 170-179 (2024).</li>
<li>Zhang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIP3%2C+an+energy+metabolism+regulator+that+switches+TNF-induced+cell+death+from+apoptosis+to+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis.</a> Science. 325, 332-336 (2009).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-α.</a> Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).</li>
<li>Cho, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-driven+assembly+of+the+RIP1-RIP3+complex+regulates+programmed+necrosis+and+virus-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation.</a> Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+is+a+key+receptor+interacting+protein+3+downstream+component+of+TNF-induced+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like is a key receptor interacting protein 3 downstream component of TNF-induced necrosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (14), 5322-5327 (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+to+plasma+membrane+leads+to+necrotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Translocation of mixed lineage kinase domain-like protein to plasma membrane leads to necrotic cell death.</a> Cell Res. 24 (1), 105-121 (2014).</li>
<li>Cai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+translocation+of+trimerized+MLKL+protein+is+required+for+TNF-induced+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane translocation of trimerized MLKL protein is required for TNF-induced necroptosis.</a> Nat Cell Biol. 16, 55-65 (2014).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, E7450-E7459 (2017).</li>
<li>Lawrence, R. E., Zoncu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lysosome+as+a+cellular+centre+for+signalling%2C+metabolism+and+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control.</a> Nat Cell Biol. 21, 133-142 (2019).</li>
<li>Ballabio, A., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomes+as+dynamic+regulators+of+cell+and+organismal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 21, 101-118 (2020).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cell+death+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cell death at a glance.</a> J Cell Sci. 126, 1905-1912 (2013).</li>
<li>Repnik, U., Hafner Cesen, M., Turk, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+cell+death%3A+concepts+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in cell death: concepts and challenges.</a> Mitochondrion. 19 (Pt A), 49-57 (2014).</li>
<li>Alu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+lysosome+in+regulated+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm+Sin+B%22%5BJournal%5D)">The role of lysosome in regulated necrosis.</a> Acta Pharm Sin B. 10 (10), 1880-1903 (2020).</li>
<li>Werneburg, N. W., Guicciardi, M. E., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1-associated+lysosomal+permeabilization+is+cathepsin+B+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α-associated lysosomal permeabilization is cathepsin B dependent.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, G947-G956 (2002).</li>
<li>Vanden Berghe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis%2C+necrosis+and+secondary+necrosis+converge+on+similar+cellular+disintegration+features%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Necroptosis, necrosis and secondary necrosis converge on similar cellular disintegration features.</a> Cell Death Differ. 17, 922-930 (2010).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+polymerization-induced+lysosomal+membrane+permeabilization+promotes+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">MLKL polymerization-induced lysosomal membrane permeabilization promotes necroptosis.</a> Cell Death Differ. 31, 40-52 (2024).</li>
<li>Guicciardi, M. E., Miyoshi, H., Bronk, S. F., Gores, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+B+knockout+mice+are+resistant+to+tumor+necrosis+factor-%CE%B1-mediated+hepatocyte+apoptosis+and+liver+injury%3A+implications+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cathepsin B knockout mice are resistant to tumor necrosis factor-α-mediated hepatocyte apoptosis and liver injury: implications for therapeutic applications.</a> Am J Pathol. 159, 2045-2054 (2001).</li>
<li>Aits, S., Jaattela, M., Nylandsted, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+quantification+of+lysosomal+membrane+permeabilization%3A+a+hallmark+of+lysosomal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the quantification of lysosomal membrane permeabilization: a hallmark of lysosomal cell death.</a> Methods Cell Biol. 126, 261-285 (2015).</li>
<li>Barral, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+to+analyze+lysosome+morphology%2C+positioning%2C+motility+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Current methods to analyze lysosome morphology, positioning, motility and function.</a> Traffic. 23, 238-269 (2022).</li>
<li>Huang, K., Jiang, X., Du, J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+detecting+lysosome+quantity+and+membrane+permeability+in+acute+myeloid+leukemia+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for detecting lysosome quantity and membrane permeability in acute myeloid leukemia cell lines.</a> STAR Protoc. 5, 103309(2024).</li>
<li>Ferrari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosome+quality+control+in+health+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+Lett%22%5BJournal%5D)">Lysosome quality control in health and neurodegenerative diseases.</a> Cell Mol Biol Lett. 29, 116(2024).</li>
<li>Otoda, T., Aihara, K. I., Takayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+stress+in+cardiovascular+diseases%3A+therapeutic+potential+of+cardiovascular+drugs+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Lysosomal stress in cardiovascular diseases: therapeutic potential of cardiovascular drugs and future directions.</a> Biomedicines. 13, (2025).</li>
<li>Cao, M., Luo, X., Wu, K., He, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lysosomes+in+human+disease%3A+from+basic+research+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting lysosomes in human disease: from basic research to clinical applications.</a> Signal Transduct Target Ther. 6, 379(2021).</li>
<li>Fisher, T. LysoTracker and LysoSensor probes. Thermo Fisher Scientific. , https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp07525.pdf (2013).</li>
<li>Wang, Z., Jiang, H., Chen, S., Du, F., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+phosphatase+PGAM5+functions+at+the+convergence+point+of+multiple+necrotic+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways.</a> Cell. 148 (1-2), 228-243 (2012).</li>
<li>Kiepas, A., Voorand, E., Mubaid, F., Siegel, P. M., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+live-cell+fluorescence+imaging+conditions+to+minimize+phototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Optimizing live-cell fluorescence imaging conditions to minimize phototoxicity.</a> J Cell Sci. 133 (4), jcs242834(2020).</li>
<li>Eriksson, I., Vainikka, L., Persson, H. L., Ollinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+lysosomal+membrane+permeabilization+using+acridine+orange%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of lysosomal membrane permeabilization using acridine orange.</a> Methods Protoc. 6 (4), 72(2023).</li>
<li>Aits, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+lysosomal+membrane+permeabilization+by+lysosomal+galectin+puncta+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay.</a> Autophagy. 11, 1408-1424 (2015).</li>
<li>Hoyer, M. J., Swarup, S., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+controlling+selective+elimination+of+damaged+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms controlling selective elimination of damaged lysosomes.</a> Curr Opin Physiol. 29, 100590(2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>HT-29 cellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Colonkankercellen</td></tr><tr><td>35 mm glazen bodemschaal</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-14-C-GRD</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>PHCBI</td><td>MCO-170AICUVL</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscoop</td><td>Leica</td><td>SP8WLL</td><td></td></tr><tr><td>Dextran groene kralen</td><td>ThermoFisher</td><td>D1820</td><td>Dextran, Fluorescein, 10.000 MW, Aanionisch, Lysine Fixable</td></tr><tr><td>Dulbecco`s Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Cytiva&nbsp;</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>Invitrogen</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Olie-immersie type HF</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16915-01</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline en Streptomycine (P/S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer oplossing (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Smac mimetic (S)</td><td>BV6, ApexBio, Catalog</td><td>B4653</td><td>Eindconcentratie, 1 mM</td></tr><tr><td>The Brick&nbsp;</td><td>Life imaging services</td><td>13685</td><td>Gas Mixer CO2 Controller</td></tr><tr><td>The Cube</td><td>Life imaging services</td><td>CBO2A</td><td>Temperatuurregeling Kamer microscopen</td></tr><tr><td>Tumor Necrosis Factor alfa (TNF-&alpha; - T)</td><td>Peprotech</td><td>30001A100UG</td><td>Eindconcentratie, 20 ng/ml</td></tr><tr><td>z-VAD-FMK (Z)</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>Eindconcentratie, 20 mM</td></tr></tbody></table>

beeldvorming van levende cellen van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose

Live-cell Imaging of Lysosomal Membrane Permeabilization During Necroptosis

De procedures die in dit protocol worden beschreven, maken het mogelijk om live-celbeelden te verkrijgen met behulp van confocale microscopie om LMP in realtime te volgen. Figuur 1 illustreert een schematische weergave van het experimentele protocol, van celbeplating tot beeldacquisitie. Op dag 0 werden 5.000 HT-29-cellen geplateerd en gedurende 24 uur geïncubeerd bij 37 °C en 5% CO2. Na 24 uur (dag 1) werden de cellen geïncubeerd met fluoresceïne-gelabelde dextraankorrels (25 μg/ml) gedurende nog eens 24 uur onder dezelfde omstandigheden. Deze kralen worden geïnternaliseerd door endocytose en verkeer naar de lysosomen, waar ze zich ophopen en verschijnen als heldere puncta. Op dag 2 (experimentdag) werden de cellen gedurende 2 uur behandeld met pH-gevoelige LysoTracker-kleurstof (1 μM) bij 37 °C en 5% CO2. LysoTracker concentreert en vertoont sterke fluorescentie in zure compartimenten, zoals late endosomen en lysosomen. Dertig minuten voor de beeldvorming werd het confocale microscoopsysteem ingeschakeld en gestabiliseerd, inclusief temperatuur-, gas- en vochtigheidsregelaars, zoals beschreven in stap 4 van het protocol. De beeldkamer werd in elkaar gezet, zoals te zien is in figuur 2. Er werd gebruik gemaakt van de lasers van 488 nm (groen) en 555 nm (rood).
Na incubatie met LysoTracker werden de cellen drie keer zorgvuldig gewassen met PBS en werd 2 ml verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S toegevoegd. De plaat werd overgebracht naar de microscoop en een druppel dompelolie werd aangebracht op het 63x/1.40 NA olie-immersieobjectief. De laserintensiteit en achtergrondniveaus werden vervolgens aangepast om de beeldvormingsomstandigheden te optimaliseren, zoals beschreven in stap 5.5. van het protocol. Onze eerste beelden bevestigden de aanwezigheid van stabiele puncta van de Lysotracker en fluoresceïne-gelabelde dextran, wat wijst op intacte lysosomen (Figuur 3). De basislijnbeelden werden vóór T/S/Z verkregen en als controle gebruikt. Er werd geen voertuig toegepast.
Na het vaststellen van de eerste beeldvormings- en microscopie-instellingen, werd de plaat teruggebracht naar de laminaire stromingskap en werd 1 ml DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S, bevattende 100 ng/ml TNF-α (T), 500 nM SMAC-mimeticum (S) en 100 μM Z-VAD-FMK (Z) toegevoegd. De beeldvorming werd voortgezet op de confocale microscoop met behulp van de beeldvormingsacquisitieparameter die wordt beschreven in stap 6 van het protocol. Zoals te zien is in Figuur 3, Aanvullende film S1 en Aanvullende film S2, diende de progressieve afname van de LysoTracker-fluorescentie in met T/S/Z behandelde cellen als een vroege indicator van lysosomale verandering. Dit verlies werd gevolgd door, en trad af en toe gelijktijdig op, de uitstroom van fluoresceïne-gelabeld dextran van de lysosomen in het cytosol (punctaat-naar-diffuse verschuiving), wat wijst op LMP. Om 8 uur verdween bijna al het Lysotracker-signaal, maar veel cellen behielden nog steeds groene puncta met een cytosolisch groen signaal, wat suggereert dat verlies van lysosomale pH-gradiënt voorafgaat aan volledige LMP en vrijgave van lading.
<img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Schematische weergave van het experimentele protocol. (Gemaakt in BioRender.com) Aanvankelijk werden 5.000 cellen geplateerd (0 uur) en gedurende 24 uur geïncubeerd; daarna werden Dextran-korrels (25 μg/ml) toegevoegd en nog eens 24 uur geïncubeerd. Om 48 uur werd LysoTracker (1 μM) toegevoegd en gedurende 2 uur geïncubeerd. De cellen werden driemaal gewassen met PBS (stap 1), gevolgd door de toevoeging van 2 ml verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% P/S (stap 2). De microscopie-instellingen werden aangepast (stap 3) en de cellen werden behandeld met TNF-α (T), SMAC-mimetisch (S) en pan-caspaseremmer Z-VAD-FMZ (Z) (stap 4), voordat ze levende cellen beeldacquisitie (stap 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig2.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2: Schema van de opstelling van de beeldkamer. (A) De monsterhouder, (B) de gasincubatiekamer en (C) het bovenste deksel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69495/69495fig3.jpg" data-altupdatedat="1784005267000" data-alt="Figuur 3"> 
Figuur 3: Representatieve beelden van HT29-cellen voor en na T/S/Z-behandeling. De cellen werden gekleurd met rode en Dextran groene bolletjes van Lysotracker en behandeld met TNF-α (T), SMAC-mimeticum (S) en pan-caspaseremmer Z-VAD-FMZ (Z). Schaalbalk: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/69495fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
Aanvullende film S1: Time-lapse van HT29-cellen geïncubeerd met Dextran groene kralen en behandeld met T/S/Z. De cellen werden gedurende meer dan 6 uur gevolgd om de cellulaire respons te beoordelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S1_Dextran%20Green%20Beads.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>
Aanvullende film S2: Time-lapse van HT29-cellen geïncubeerd met LysoTracker rood en behandeld met T/S/Z. De cellen werden gedurende meer dan 6 uur gevolgd om de cellulaire respons te beoordelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69495/Movie%20S2_LysoTracker%20red.mp4" target="_blank">Klik hier om deze film te downloaden.</a>

Beeldvorming van levende cellen van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose

Necroptosis, a form of regulated necrosis, culminates in cell membrane rupture. Our lab and others have discovered that lysosomal membrane ...

live-cell-imaging-lysosomal-membrane-permeabilization-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

Time-lapse microscopie van fluorescent gelabelde autofagie markers zorgt voor de opvolging van de dynamische autofagie respons met een hoge temporele resolutie. Met specifieke autofagie en organel markers in een combinatie van 3 verschillende kleuren, kunnen we de bijdrage van een eiwit autophagosome vorming in een robuuste ruimtelijke en temporele context volgen.

Live cell imaging van Vroege Autophagy Evenementen: Omegasomes en Beyond

Beeldvorming van levende cellen blootgesteld aan de lipofiele kleurstof FM1-43 maakt nauwkeurige bepaling van de kinetiek waarmee poriënvormende toxines worden verwijderd uit de plasmamembraan. Dit is een gevoelige test die kan worden gebruikt om vereisten voor Ca 2 +, sphingomyelinase en andere factoren plasmamembraan reparatie beoordelen.

Wonen Imaging Assay voor het beoordelen van de Rollen van Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; En sphingomyelinase in de Reparatie van Pore-vormende Toxine Wonden

Het genezingsproces beschadigde cellen omvat handel specifieke eiwitten en subcellulaire compartimenten aan de plaats van celmembraan schade. Dit protocol beschrijft assays deze processen volgen.

Imaging celmembraan letsel en Subcellulaire processen die betrokken zijn in reparatie

We beschrijven de detectie van NLRP3 inflammasome activering op cellulaire basis met behulp van fluorescentie microscopie en kleuring voor actieve caspase-1 en de adapter, ASC. Een lactaat dehydrogenase release assay wordt gepresenteerd voor het detecteren van lysis van de pyroptotic op basis van de bevolking. Deze technieken kunnen worden aangepast om te bestuderen van vele aspecten van inflammasome biologie.

Detectie van Inflammasome-activering en Pyroptotic celdood in lymfkliertest beenmerg-afgeleide macrofagen

Wij rapporteren methoden voor karakterisering van MLKL-gemedieerde plasmamembraan breuk in necroptosis met inbegrip van conventionele en confocal microscopie van live-cel imaging, scanning elektronen microscopie, en NMR gebaseerde lipide bindend.

Karakterisatie van MLKL-gemedieerde plasmamembraan Rupture in Necroptosis

Efferocytosis, de fagocytische verwijdering van apoptotic cellen, is nodig om de homeostase te handhaven en wordt vergemakkelijkt door de receptoren en signaalroutes waarmee voor de erkenning, de engulfment, en de internalisering van de apoptotic cellen. Hierin presenteren wij een fluorescentie microscopie protocol voor de kwantificering van efferocytosis en de activiteit van efferocytic signaalroutes.

Kwantificering van Efferocytosis door eencellige fluorescentie microscopie

AlPcS2a-gemedieerde chromofoor-geassisteerde laserinactivatie (CALI) is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van spatiotemporale schade van intracellulaire blaasjes (IV's) in levende cellen.

Een fotodynamische benadering om de functie van intracellulaire vesikelruptuur te bestuderen

Mitofagie is het primaire mechanisme van mitochondriale kwaliteitscontrole. De evaluatie van mitofagie in vivo wordt echter belemmerd door het gebrek aan betrouwbare kwantitatieve testen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de observatie van mitofagie in levende cellen met behulp van een celpermeant groen-fluorescerende mitochondriënkleurstof en een rood-fluorescerende lysosoomkleurstof.

Mitofagie visualiseren met fluorescerende kleurstoffen voor mitochondriën en lysosoom

Dit protocol geeft instructies voor het activeren en monitoren van Stub1-gemedieerde pexofagie in levende cellen.

Monitoring Stub1-gemedieerde Pexofagie

Dit protocol beschrijft een mechanisme voor het gebruik van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie om de interactie van mitochondriën en lysosomen, gelabeld met mEosEM en APEX2 respectievelijk, te visualiseren.

Dual-color correlatieve licht- en elektronenmicroscopie voor de visualisatie van interacties tussen mitochondriën en lysosomen

Leer live-cell beeldvorming van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose met fluorescentieprobes. Deze methode volgt pH-veranderingen en lysosomale integriteit in real-time.

Beeldvorming van levende cellen van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose

Meer video's verkennen