Beeldvorming van levende cellen van lysosomale membraanpermeabilisatie tijdens necroptose

Dit protocol beschrijft een live-cel beeldvormingsmethode voor het monitoren van de permeabolisatie van lysosomale membraan tijdens necroptose met behulp van fluorescerende probes die veranderingen in de integriteit en verzuring van het lysosomale membraan detecteren. De uitdaging in het veld is om de dynamiek van organelbeschadiging tijdens het celsterfproces te karakteriseren en precies te definiëren hoe deze schade celondergang zou moeten aandrijven of eraan bijdraagt. Om te beginnen plaats je 5.000 cellen in twee milliliter met antibiotica aangevuld DMEM-medium in een steriel schaaltje met glazen bodem.

Plaats de schaal in een broedmachine die op 37 graden Celsius staat met 5% kooldioxide, en laat de cellen een nacht incuberen. Voeg 20 microliter dextran groene kralen toe aan 25 microgram per milliliter in verse, met antibiotica aangevuld DMEM-medium om het te verdunnen. Verwijder het oude medium uit de schaal en vervang het door twee milliliter van het rundvleesbevatten DMEM-medium.

Plaats de schaal in een broedmachine die staat op 37 graden Celsius met 5% kooldioxide, en incubeer 24 uur om de kralen in lysosomen te kunnen internaliseren. Voeg nu twee microliter van één millimolar LysoTracker-voorraadoplossing toe aan twee milliliter verse DMEM-media. Vervang het oude medium door deze kleuroplossing.

Incubeer de cellen twee uur bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide. Schakel de componenten van het confocale systeem in door de personal computer, microscoop, scannervoeding, laservermogen, laseremissie en Leica-voeding aan te schakelen. Zet de omgevingsbediening aan, inclusief de temperatuurregelaar, de Cube genoemd, en de kooldioxidegasmengerregelaar, de Brick genoemd.

Open de toevoer van kooldioxide en zuurstof. Stel de temperatuurregelaar in op 37 graden Celsius. Stel de gas- en luchtvochtigheidsregelaar in op 5% kooldioxide en 95% luchtvochtigheid.

Stel de beeldkamer samen. Na het kleuren was je de cellen drie keer met twee milliliter PBS en voeg je vervolgens twee milliliter verse DMEM-media toe. Breng dompelolie aan op de objectieflens voordat je beelden neemt.

Bevestig de schotel op het microscooppodium. Stel de laserintensiteit aan tot 3% maar niet meer dan 5% en pas vervolgens de detectorversterking in de microscoopsoftware aan om het signaal te optimaliseren. Minimaliseer de achtergrond door de contrastbalk aan te passen.

Maak basisbeelden van onbehandelde cellen, die als controleconditie dienen. Plaats de plaat terug in de laminaire stroomkap en voeg één milliliter antibioticum DMEM toe, aangevuld met celdoodsinducers. In de acquisitiesoftware stel je de modus in op XYT, formaat op 512 bij 512, snelheid op 400, zoom op drie, lijngemiddelde op één, lijnaccumulatie op drie, frameaccumulatie op één, tijdinterval op drie minuten, duur op acht uur, en schakel autofocus in.

Klik op start om de time-lapse verzameling te starten. Eerste beeldvorming bevestigde de aanwezigheid van stabiele puncta van LysoTracker en fluoresceïne-gelabelde dextran, wat wijst op intacte lysosomen vóór behandeling. Vier uur na behandeling met TSZ was de fluorescentie van LyoTracker merkbaar verminderd, terwijl dextran een diffuse cytosolische distributie begon te vertonen, wat wijst op de initiële permeabilisatie van het lysosomale membraan.

Acht uur na de behandeling was het signaal van LysoTracker bijna volledig verdwenen, terwijl veel cellen groene dextran-puncta met een diffuse groene cytosolische signaal behielden. We tonen aan dat de permeabolisatie van het lysosomale membraan direct kan worden weergegeven in een levende cel die necroptotische inductie ondergaat. Dit protocol toont aan dat de combinatie van zowel LysoTracker als dextran-kralen gelijktijdige monitoring van lysosomale pH en ladingafgifte in realtime mogelijk maakt.

En belangrijk voor de vooruitgang van dit live-cel beeldprotocol is het vermogen om een kleine pH-verandering en lysosomale membraanpermeabilisatie in realtime te monitoren, waarbij dynamische gebeurtenissen worden vastgelegd die door eindpuntanalyse zoals flowcytometrie en monolaagkleuring worden gemist.