Zuivering van HLA-G⁺ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Dit protocol is ontworpen om primaire menselijke trofoblasten te zuiveren uit menselijke placentaweefsels om hun functionele en immunologische eigenschappen te bestuderen bij een gezonde zwangerschap en onder pathologische omstandigheden. Dit protocol biedt dus een reproduceerbaar platform om enkele eerdere beperkingen bij het werken met primaire menselijke extravilleuze trofoblasten te overwinnen, namelijk hun levensvatbaarheid. Dit protocol is dus echt geoptimaliseerd om hun levensvatbaarheid en zuiverheid te verbeteren.

Om te beginnen neem je een monster van een menselijke placenta. Plaats de placenta met de foetale zijde naar boven zodat de navelstrenginbrengplek zichtbaar is. Trek het amnion handmatig van het laterale membraan naar de navelstrenginbrengplek en verwijder het.

Gebruik dan een schaar om de amnion te knippen en weg te gooien. Snijd het choriodeciduale membraan in stroken van twee inch, beginnend vanaf de basis van de placenta omhoog, terwijl elke strip aan de placenta blijft bevestigd. Plaats de choriodeciduale membraanstrook over twee vingers, met de deciduale zijde naar boven gericht.

Schraap met een paar steriele, gebogen pincetten voorzichtig de maternale decidua parietalis van het chorion. Verzamel de decidua parietalis in een 50 milliliter conische buis met 20 milliliter PBS voor lymfocytenisolatie. Verzamel vervolgens het chorionmembraan in een aparte 50 milliliter conische buis met 20 milliliter wasmedium A. Met een schaar snijd je het chorionmembraan binnenin de 50 milliliter buis in stukken kleiner dan twee vierkante millimeter.

Gooi wasmedium A uit de tube. Was het tissue herhaaldelijk met PBS totdat het supernatant helder is. Voor de placentadissectie plaats je de placenta met de moederzijde naar boven gericht en verwijder je bloedstolsels.

Knip met een steriele schaar stukken van de basale plaat van de placenta door terwijl je necrotische, verkalkte of ischemische gebieden vermijdt. Plaats het decidua basalis stuk op de vingers met de villi naar boven gericht. Gebruik vervolgens een schaar om de villi voorzichtig te verwijderen en zo een membraan van twee tot drie millimeter te krijgen, met slechts een dunne villuslaag over.

Verzamel het decidua basalis-weefsel in een 50 milliliter conisch buisje met 20 milliliter PBS. Snijd het weefsel vervolgens in stukjes kleiner dan twee vierkante millimeter. Vervolgens gooi je de PBS uit de buis.

Was de decidua basalis herhaaldelijk met PBS totdat het supernatant helder is zonder zichtbaar bloed. Vervolgens splitst je 15 milliliter weefselsuspensie in twee conische buizen van 50 milliliter. Vul alle buizen met PBS.

Centrifugeer de buizen op 200G gedurende één minuut en giet het supernatant eraf. Voeg 150 milliliter warm weefsel digestie-enzymcocktail toe aan een glazen fles van 300 milliliter. Voeg 30 milliliter chorionmembraan toe aan de fles.

Voeg 20 milliliter warme DMEM/F-20 en 80 milliliter warme weefseldigestie-enzymcocktail toe aan twee aparte glazen flessen van 300 milliliter. Voeg vervolgens 7,5 milliliter decidua basalis toe aan elke fles. Breng de flessen uit in een waterbad.

Schud alle flessen elke drie tot vier minuten tijdens de 15 minuten durende incubatie. Na de spijsvertering filter je het weefsel door metalen zeefjes met een maasgrootte van 40. Voeg dan wasmedium B toe om de weefsels te spoelen en het gelatineuze materiaal op te lossen.

Doe het onverteerde weefsel terug in de glazen flessen en herhaal de vertering. Vervolgens filteren we de celsuspensies door een 100 micrometer filter in gelabelde 50 milliliter conische buizen. Houd cellen van de eerste en tweede verteringsfase gescheiden.

Centrifugeer vervolgens de celsuspensie op 650G gedurende acht minuten. Gooi het supernatant weg. Combineer pellets van hetzelfde weefseltype en verteringspercentage in één buis.

Daarna maak je het volume samen met wash medium B tot 25 milliliter. Voeg 12 milliliter ficoll toe aan vier 50 milliliter conische buizen met het weefseltype en het verteringsgetal. Laag de celsuspensie voorzichtig op de ficoll.

Centrifugeer dan op 800G gedurende 20 minuten op kamertemperatuur zonder te breken. Aspireer voorzichtig de cellaag bij de interface van het ficollmedium en breng deze over in schone gelabelde buizen. Vul daarna buizen met wash medium B, centrifugeer op 650G gedurende acht minuten, en suspendeer de pellets opnieuw.

Plaats de geresuspendeerde pellets in steriele, door fluorescentie geactiveerde celsorteerbuizen met het gelabelde weefseltype en het verteringsnummer. Voeg anti-CD45 BV785, anti-HLA GAPC en anti-EGFR1 BV711 antilichamen toe. Incubeer 20 minuten op kamertemperatuur in het donker.

Na het wassen en opnieuw suspenderen van de cellen in wasmedium B, haal je ze direct door een 40 micrometer celzeef. Sorteer CD45 negatieve HLAG positieve EGFR positieve extravillous trophoblast in buizen met één milliliter EVT-kweekmedium A. Flowcytometrie-analyse van lijnmarkers toonde een levensvatbare primaire extravilleuze trophoblast kweek tot dag vier. Representatieve lichtmicroscopiebeelden van primaire chorionische en decidua basalis HLAG positieve extravilleuze trofoblast werden vastgelegd na 24 uur, 48 uur en 72 uur kweek.

Extravilleuze trofoblast drukte polymorfe HLAC en immunosuppressieve co-inhibitiemoleculen uit. Extravilleuze trofoblast verhoogde de expressie van HLAC, PD-L1, PD-L2 en HLA-E, maar verhoogde de expressie van PVR en B7H3 niet wanneer deze 72 uur samen met geactiveerde lymfocyten werd gekweekt. Er werd geen toename waargenomen in de sterfte van extravilleuze trofoblasten na co-kweek met geactiveerde lymfocyten.

Dit protocol stelt wetenschappers in staat om primaire extravilleuze trofoblasten te gebruiken voor een breed scala aan assays. Het voordeel is de hoge levensvatbaarheid die analyse mogelijk maakt met celkweek, koude kweek, flowcytometrie, proteomics, transcriptomics, waarbij deze zeer levensvatbare extravilleuze trofoblasten met hoge opbrengst worden gebruikt. Een van de belangrijkste aspecten van ons protocol is dat je verse placentamaterialen moet gebruiken.

Je kunt ze niet in de koelkast zetten. Trofoblasten zijn dol op sterven, dus haal het placentaweefsel zo snel mogelijk na de bevalling, bij voorkeur binnen twee uur na de bevalling, en houd ze altijd op kamertemperatuur. Dit is cruciaal om een zeer levensvatbare extravilleuze trofoblast te verkrijgen.

Dus een van de meer aanvullende methoden en meer geavanceerde innovatieve methoden waarvoor je deze primaire trofoblasten kunt gebruiken, is langdurige celkweek. Je kunt ze dus gebruiken om primaire vierdaagse celculturen te vestigen. Dus cellen zijn tot 96 uur levensvatbaar, wat vrij lang is, en het stelt je in staat koude culturen te maken met immuuncellen, zoals T-cellen en NK-cellen.

De andere innovatie is ook dat je ze kunt gebruiken om trofoblastachtige cellijnen te vestigen met de methoden die Aoki voor het eerst beschreef, en die we ook op deze culturen toepasten om echt langdurige celtypen te vestigen die je kunt gebruiken voor genoombewerking en andere meer langdurige kweektests. Dus het gebruik van deze innovatieve methoden, waaronder de langetermijncelkweek, kan je echt helpen om langetermijn-mechanistische culturen te ontwerpen waarbij je genoombewerking, knock-out, knock-in genen, eiwitten kunt toepassen, sommige van deze trofoblasten overexpressief kunt maken om veel meer mechanistische details te krijgen over hoe deze trofoblasten tolerantie afdwingen, of immuniteit en meer cytotoxiciteit toestaan wanneer ze interactie hebben met immuunpopulaties.