Name: Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Leer een protocol voor de isolatie en karakterisering van primaire humane extravilleuze trofoblasten uit placentaweefsels. Deze methode optimaliseert viabiliteit en zuiverheid voor immunologisch onderzoek naar zwangerschapscomplicaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Papuchova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+that+have+distinct+immune+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Three types of HLA-G+ extravillous trophoblasts that have distinct immune regulatory properties.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (27), 15772-15777 (2020).</li>
<li>Hamilton, I., Ikumi, N. M., Kshirsagar, S., Goodman, W. A., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+primary+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts+and+HLA-G%2B+EVT-like+cell+lines+to+study+maternal-fetal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Utilizing primary HLA-G+ extravillous trophoblasts and HLA-G+ EVT-like cell lines to study maternal-fetal interactions.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102276(2023).</li>
<li>Tilburgs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+HLA-G%2B+extravillous+trophoblasts%3A+Immune-activating+cells+that+interact+with+decidual+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human HLA-G+ extravillous trophoblasts: Immune-activating cells that interact with decidual leukocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7219-7224 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progestogen-driven+B7-H4+contributes+to+onco-fetal+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Progestogen-driven B7-H4 contributes to onco-fetal immune tolerance.</a> Cell. 187 (17), 4713-4732.e19 (2024).</li>
<li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+first+trimester+villous+and+extravillous+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of first trimester villous and extravillous human trophoblast cells.</a> Placenta. 32 (1), 33-43 (2011).</li>
<li>Apps, R., Gardner, L., Hiby, S. E., Sharkey, A. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+human+leucocyte+antigen-C+molecules+at+the+surface+of+human+trophoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Conformation of human leucocyte antigen-C molecules at the surface of human trophoblast cells.</a> Immunology. 124 (3), 322-328 (2008).</li>
<li>Moffett, A., Loke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+placentation+in+eutherian+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunology of placentation in eutherian mammals.</a> Nat Rev Immunol. 6 (8), 584-594 (2006).</li>
<li>Papúchová, H., Meissner, T. B., Li, Q., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dual+role+of+HLA-C+in+tolerance+and+immunity+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The dual role of HLA-C in tolerance and immunity at the maternal-fetal interface.</a> Front Immunol. 10, 2730(2019).</li>
<li>Vander Zwan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+signature+of+activation+and+dysfunction+allows+human+decidual+CD8%2B+T+cells+to+provide+both+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed signature of activation and dysfunction allows human decidual CD8+ T cells to provide both tolerance and immunity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (2), 385-390 (2018).</li>
<li>Salvany-Celades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+types+of+functional+regulatory+T+cells+control+T+cell+responses+at+the+human+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Three types of functional regulatory T cells control T cell responses at the human maternal-fetal interface.</a> Cell Rep. 27 (9), 2537-2547.e5 (2019).</li>
<li>Mahajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+decidual+CD8%2B+T+cells+include+distinct+effector+memory+and+tissue-resident+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific decidual CD8+ T cells include distinct effector memory and tissue-resident memory cells.</a> JCI Insight. 8 (17), e171806(2023).</li>
<li>Crespo, ÂC., Strominger, J. L., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+KIR2DS1+by+decidual+natural+killer+cells+increases+their+ability+to+control+placental+HCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of KIR2DS1 by decidual natural killer cells increases their ability to control placental HCMV infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 15072-15077 (2016).</li>
<li>Burton, G. J., Redman, C. W., Roberts, J. M., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-eclampsia%3A+Pathophysiology+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Pre-eclampsia: Pathophysiology and clinical implications.</a> BMJ. 366, 12381(2019).</li>
<li>Inada, K., Shima, T., Nakashima, A., Aoki, K., Ito, M., Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+regulatory+T+cells+in+decidua+of+miscarriage+cases+with+abnormal+or+normal+fetal+chromosomal+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content.</a> J Reprod Immunol. 97 (1), 104-111 (2013).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+decidual+effector+regulatory+T+cells+increase+in+late+gestation+of+normal+pregnancy+but+not+in+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded decidual effector regulatory T cells increase in late gestation of normal pregnancy but not in preeclampsia.</a> Front Immunol. 9, 1934(2018).</li>
<li>Tsuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+heterogeneity+in+gestational+age+and+preeclampsia+using+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell heterogeneity in gestational age and preeclampsia using single-cell RNA sequencing.</a> Front Immunol. 15, 1401738(2024).</li>
<li>Pique-Regi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+signatures+of+the+human+placenta+in+term+and+preterm+parturition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional signatures of the human placenta in term and preterm parturition.</a> eLife. 8, e52004(2019).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+developmental+deficiencies+in+placentation+and+decidualization+in+late-onset+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals developmental deficiencies in placentation and decidualization in late-onset preeclampsia.</a> Front Immunol. 14, 1142273(2023).</li>
<li>Morita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+TCR+repertoire+and+PD-1+expression+in+decidual+and+peripheral+CD8%2B+T+cells+reveals+distinct+immune+mechanisms+in+miscarriage+and+preeclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of TCR repertoire and PD-1 expression in decidual and peripheral CD8+ T cells reveals distinct immune mechanisms in miscarriage and preeclampsia.</a> Front Immunol. 11, 1082(2020).</li>
<li>Sasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proportion+of+peripheral+blood+and+decidual+CD4%2B+CD25bright+regulatory+T+cells+in+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Proportion of peripheral blood and decidual CD4+ CD25bright regulatory T cells in pre-eclampsia.</a> Clin Exp Immunol. 149 (1), 139-145 (2007).</li>
<li>Sasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decidual+and+peripheral+blood+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells+in+early+pregnancy+and+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy and spontaneous abortion.</a> Mol Hum Reprod. 10 (5), 347-353 (2004).</li>
<li>Shannon, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+assessment+of+primary+and+stem+cell-derived+human+trophoblast+organoids+as+placenta-modeling+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell assessment of primary and stem cell-derived human trophoblast organoids as placenta-modeling platforms.</a> Dev Cell. S1534-5807, 00043-00051 (2024).</li>
<li>Apps, R., Murphy, S. P., Fernando, R., Gardner, L., Ahad, T., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">HLA expression of primary trophoblast cells and placental cell lines.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li>
<li>Okae, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+trophoblast+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of human trophoblast stem cells.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 50-63.e6 (2018).</li>
<li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+screening+in+human+trophoblast+stem+cells+reveals+shared+and+distinct+aspects+of+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CRISPR screening in human trophoblast stem cells reveals shared and distinct aspects of placental development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (51), e2311372120(2023).</li>
<li>Hori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophoblast+stem+cell-based+organoid+models+of+the+human+placental+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Trophoblast stem cell-based organoid models of the human placental barrier.</a> Nat Commun. 15 (1), 962(2024).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+multi-omic+profiling+of+human+placental+syncytiotrophoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus multi-omic profiling of human placental syncytiotrophoblasts.</a> Nat Genet. 56 (2), 294-305 (2024).</li>
<li>Ikumi, N. M., Koenig, Z., Mahajan, S., Gray, C. M., Tilburgs, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+primary+human+placental+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of primary human placental leukocytes.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102277(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-238</td><td></td></tr><tr><td>-20&nbsp;&deg;C freezer</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C 5% CO2 Incubator</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 &deg;C fridge</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conical Centrifuge tubes</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-240</td><td></td></tr><tr><td>55 mM &beta;-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>6 &frac12;&rdquo; scissors</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-AAD Viability Staining Solution</td><td>Biolegend</td><td>420403</td><td></td></tr><tr><td>-80&nbsp;&deg;C freezer&nbsp;</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>REPROCELL</td><td>04-0014</td><td></td></tr><tr><td>AF700, mouse, IgG1 k Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400144</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7 Rat IgG2a, &kappa; Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400524</td><td></td></tr><tr><td>B7H3 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>351012</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A5 SE Cell Analyzer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bigfoot Spectral Cell Sorter</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>BSL2 biosafety cabinet</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV605 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Control</td><td>BD Biosciences</td><td>562652</td><td></td></tr><tr><td>BV750 Mouse IgG1, &kappa; isotype Control&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400105</td><td></td></tr><tr><td>BV785 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Cotrol</td><td>Biolegend</td><td>400170</td><td></td></tr><tr><td>CD45 BV785</td><td>Biolegend</td><td>304048</td><td></td></tr><tr><td>Cell dissociation sieve</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>CD1-1KT (mesh size 60)</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainers 40&micro;m, 70&micro;m, 100&micro;m</td><td>Thermo Fisher</td><td>22363547; 22363548; 22363549</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspase-3/7 Green Detection Reagent</td><td>invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021, 3mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML 1046-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Curved tip tweezers</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>VWR Life Science</td><td>97063-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>EGF, Human, Recombinant, Animal Free</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>EGFR1 BV711</td><td>Biolegend</td><td>352920</td><td></td></tr><tr><td>FACS DIVA software</td><td>BD Biosciences</td><td>https://www.bdbiosciences.com/ja-jp/products/software/instrument-software/bd-facsdiva-software</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll Paque Plus</td><td>Cytivia</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td>https://www.flowjo.com/</td><td></td></tr><tr><td>HLA-C PE</td><td>BD Biosciences</td><td>566372</td><td></td></tr><tr><td>HLA-E PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>342608</td><td></td></tr><tr><td>HLA-G APC</td><td>abcam</td><td>AB40915</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Corning</td><td>35060CI</td><td></td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin (hCG) (2500IU/mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1063</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin (1mg/mL)</td><td>Corning</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant IL-2</td><td>PeproTech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium, 100x (ITS-G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 APC/cy7</td><td>Biolegend</td><td>313627</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0278</td><td></td></tr><tr><td>magnet separator</td><td>promega</td><td>Z5342</td><td></td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum (NCS)</td><td>gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>PD-L1 AF700</td><td>invitrogen</td><td>56-5983-42</td><td></td></tr><tr><td>PD-L2&nbsp; BV750</td><td>Biolegend</td><td>345528</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 mouse, IgG1 k, Isotype Control</td><td>Biolegend</td><td>400126</td><td></td></tr><tr><td>PE/Dazzle594 Mouse IgG1, &kappa; Isotype Cotrol</td><td>Biolegend</td><td>400176</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline 10X Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PVR BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>748276</td><td></td></tr><tr><td>Research grade FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB12999102</td><td></td></tr><tr><td>RosetteSep Human CD8+ T Cell Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell</td><td>15023</td><td></td></tr><tr><td>SB431542. 10 mM</td><td>Apex-Bio</td><td>A8249</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath 37&nbsp;&deg;C</td><td>any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express 1x No Phenol Red</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>VPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 10 Serum-free Hematopoietic Cell Medium</td><td>Lonza</td><td>04-380Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688000-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

zuivering van hla-g+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Purification of HLA-G+ Extravillous Trophoblasts from Human Term Placental Tissues for Phenotyping and Functional Analysis

Verwachte cel levert op
Van 15 mL decidua basalis levert de verwachte HLA-G+ EVT 0,1-0,3 × 106 cellen uit de eerste vertering en 0,1-0,6 × 106 cellen uit de tweede vertering (totaal 0,2-0,8 × 106 cellen). Van 30 mL chorionmembraan zijn de verwachte HLA-G+ EVT-opbrengsten 0,4-1,0 × 106cellen uit de eerste vertering en 0,4-1,5 × 106 cellen uit de tweede vertering (totaal 0,8-2,5 × 106 cellen). Het aandeel caspase 3/7-7-AAD- live EVT in de isolaten wordt verwacht 90-95% te bedragen.
Primaire HLA-G+ EVT-cultuur
De flowcytometrieanalyse van afstammingsmarkers (HLA-G, HLA-C, EGFR) en celsterftemarkers toonde aan dat dit protocol levensvatbare primaire EVT-kweek biedt tot dag 4 (96 uur na het plateren van de gesorteerde EVT) (Figuur 1B-D). Representatieve lichtmicroscopiebeelden van primaire chorion- en d.basalis HLA-G+ EVT worden getoond na 24, 48 en 72 uur kweek (Figuur 2A-F).
Co-kweek van primaire HLA-G+ EVT met T-cellen
Dit protocol verbeterde de levensvatbaarheid van primaire EVT 96 uur na isolatie van de placenta, een verbetering ten opzichte van ons vorige rapport 1,2,10. Hierdoor maakt het de analyse van EVT-responsen na co-kweek met voorgestimuleerde lymfocyten mogelijk, wat acute ontsteking op het moeder-foetale grensvlak nabootst. EVT expresseert polymorfe HLA-C evenals immunosuppressieve co-inhibitiemoleculen, zoals PD-L1, PD-L2, PVR (ook bekend als CD155), B7H3 en HLA-E, zoals bepaald door extracellulaire flowcytometriekleuring (Figuur 3A,B). EVT verhoogde de expressie van HLA-C, evenals PD-L1, PD-L2 en HLA-E, maar verhoogde de expressie van PVR en B7H3 niet wanneer deze 72 uur co-culturen met geactiveerde lymfocyten volgens protocolsectie 8 (Figuur 4A, B). Daarnaast werd geen toename van EVT-sterfte waargenomen, zoals aangetoond door 7AAD en caspase 3/7 kleuring (Figuur 4C,D).
<img alt="Figuur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figuur 1. De gatingstrategie voor EVT-celsortering en flowcytometrieplots na het cultiveren van gesorteerde EVT. (A) De representatieve gatingstrategie voor het sorteren van decidua basalis EVT en chorionische EVT. R1 is de live celpoort in de Forward-Side Scatter-plot. R2 is de poort voor uitsluiting van CD45+ leukocyten. R3 is de HLA-G+EGFR+EVT-poort. R4 is de 7-AAD-caspase3/7-live EVT. Hoewel de R4-poort niet per se nodig is voor sortering, wordt deze hier getoond om de levensvatbaarheid van primaire EVT aan te tonen. (B) Representatieve flowcytometrieplots van gesorteerde HLA-G+EGFR+EVT, na 96 uur in vitrokweek. (C,D) Frequenties van caspase 3/7-7-AAD- live EVT tijdens de sortatie (dag 0) en 96 uur kweek (dag 4). Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig1large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figuur 2. De morfologie van EVT tijdens in vitro kweek. Representatieve lichtmicroscopiebeelden van chorionische EVT na (A) 24 uur, (B) 48 uur, en (C) 72 uur kweek en decidua basalis EVT na (D) 24 uur, (E) 48 uur en (F) 72 uur kweek. Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figuur 3. Immunologische fenotypes van primaire EVT. (A) De representatieve flowplots van HLA's en co-inhibitiemoleculen op primaire EVT, zoals bepaald door extracellulaire flowcytometriekleuring (dag 0). (B) Gepaarde lijngrafieken tonen ruwe MFI van IgG-controle en volledige kleuring van elke marker van d. basalis EVT (blauw) en chorionische EVT (groen) op dag 0. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig3large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figuur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69545/69545fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figuur 4. Immunologische fenotypes van primaire EVT met of zonder geactiveerde lymfocyten (dag 4). (A) Vertegenwoordigende flowplots van EVT na de 72-uurs kweek (dag 4) met of zonder geactiveerde derde-partij lymfocyten. (B) Gepaarde lijngrafieken tonen MFI van EVT met of zonder geactiveerde lymfocyten van derden. Blauwe plots staan voor decidua basalis EVT, en groene plots voor chorionische EVT. (C) Vertegenwoordigende flowcytometrieplots voor caspase 3/7-7-AAD- live EVT met of zonder geactiveerde lymfocyten van derden op dag 4. (D) Gepaarde lijndiagrammen tonen frequenties van caspase 3/7-7-AAD- live EVT, met of zonder geactiveerde lymfocyten van derden. Blauwe plots staan voor decidua basalis EVT, en groene plots voor chorionische EVT. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/69545fig4large.jpg" target="_blank">hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1. Belangrijke reagentia voor de weefseldissectie en spijsvertering. Zie ook 1,2,24. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%201_final.xlsx" target="_blank">hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2. Belangrijke reagentia voor de EVT-kweek en co-kweek met T-cellen. Zie ook 1,2,24. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%202_v2_final.xlsx" target="_blank">hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3. Belangrijke antilichamen en reagentia voor sortering en flowcytometrieanalyse. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69545/Table%203_final.xlsx" target="_blank">hier om deze tabel te downloaden.</a>

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

The human maternal-fetal interface represents a unique immunological environment where maternal immune cells and fetal extravilllous trophoblasts (EVT) ...

purification-hla-g-extravillous-trophoblasts-from-human-term

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We hebben de placenta als een belangrijk hematopoietische organen tijdens de ontwikkeling. Wij vonden dat hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn beide gegenereerd en uitgebreid in de placenta in unieke microenvironmental niches. We beschrijven hier experimentele technieken die nodig zijn voor isolatie en visualisatie van HSC in de muis placenta.

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

In dit protocol beschrijven we de ontleding van placenta van de muis op zwangerschap d10.5, gevolgd door isolatie van trofoblast cellen door een Percoll-gradiënt. Vervolgens demonstreren het gebruik van de geïsoleerde cellen in een Matrigel invasie assay.

Isolatie van primaire Muis trofoblast cellen en Trofoblastinvasie Assay

We beschrijven het gebruik van de monoklonale antilichamen TG30 (CD9) en GCTM-2 voor de gecombineerde detectie van celoppervlakantigenen via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) voor de identificatie en verrijking van levende menselijke embryonale stamcellen (hESC) met behulp van positieve selectie en ook het gebruik van negatieve selectie om hESC's uit een gemengde celpopulatie te zuiveren.

Verrijking en zuivering van menselijke embryonale stamcellen door detectie van celoppervlakantigenen met behulp van de monoklonale antilichamen TG30 en GCTM-2

Beschreven hierin is een protocol om de infiltrerende leukocyten van de decidua basalis en decidua parietalis - de menselijke moeder-foetus interface - te isoleren en verder te bestuderen. Dit protocol handhaaft de integriteit van celoppervlaktemarkeringen en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream-toepassingen, zoals bewezen door flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het efficiënt siRNA transfectie van vers geïsoleerde menselijke villous cytotrofoblasten behulp microporatie en het identificeren van DNA-eiwitcomplexen in deze cellen. Getransfecteerde cellen kunnen worden gecontroleerd door Western blot en EMSA analyses gedurende de 4 dagen cultuurtijd.

siRNA Transfectie en EMSA Analyses op vers geïsoleerde Human Villous cytotrofoblasten

Dit manuscript presenteert een uniek in vitro model van immunogezuiverde humane villoze cytotrofoblastcellen gekweekt onder hypoxie/reoxygenatie. Dit model is geschikt om de beschermende effecten van veelbelovende behandelingen, zoals melatonine, op zwangerschapscomplicaties geassocieerd met verhoogde oxidatieve stress en veranderde placentafunctie te bestuderen.

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Deze studie geeft een protocol voor het omkeerbare weefsel clearing, immunokleuring, 3D-rendering en analyse van vasculaire netwerken in menselijke placenta villi monsters over de volgorde van 1-2 mm,3.

Driedimensionale weergave en analyse van Immunolabeled, verduidelijkt menselijke placenta Villous vasculaire netwerken

Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

Hier beschrijven we een methode voor het opwarmen van verglaasde menselijke blastocysten, die ze in vitro door de implantatieperiode kweekt, verteren tot enkele cellen en vroege trofoblastcellen verzamelen voor verder onderzoek.

Single Cell Collection van Trophoblast Cellen in Peri-implantatie Stage Human Embryo's

Dit protocol beschrijft de voorbereiding van menselijke placentaweefselexplants die worden gekweekt aan een lucht-vloeistofinterface voor de studie van virale infecties.

Ex vivo Kweek van menselijke placenta-explants voor de studie van virale overdracht over de maternale-foetale interface

Leer een protocol voor de isolatie en karakterisering van primaire humane extravilleuze trofoblasten uit placentaweefsels. Deze methode optimaliseert viabiliteit en zuiverheid voor immunologisch onderzoek naar zwangerschapscomplicaties.

Zuivering van HLA-G+ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse (Video) | JoVE Journal

Zuivering van HLA-G⁺ extravilleuze trofoblasten uit menselijke termische placentaweefsels voor fenotypering en functionele analyse

Meer video's verkennen