De Nijmegen Hemostasis-assay: gelijktijdige fluorogene meting van trombine- en plasminegeneratie in één put
27 februari 2026
Dit protocol beschrijft de Nijmegen Hemostasis Assay, die gelijktijdige, tijdsgebonden meting van trombine- en plasmingeneratie mogelijk maakt om een geïntegreerde beoordeling van stolling en fibrinolyse te bieden. De assay heeft als doel de karakterisering van het hemostatische evenwicht in onderzoek en klinische omgevingen te verbeteren, buiten het bereik van conventionele hemostatische tests.
Mijn onderzoek richt zich op het samen meten van secundaire hemostase en fibrinolyse om het algehele hemostatische evenwicht te meten. De meeste huidige assays beoordelen geïsoleerde componenten van stolling of fibrinolyse. Deze assay meet beide processen gelijktijdig in één assay.
Schakel om te beginnen de fluorescentieplaatlezer aan en laat deze in evenwicht komen tot 37 graden Celsius. Configureer de filterinstellingen in de software door het aantal golflengteparen op twee te zetten. Stel de excitatiegolflengte in op 355 nanometer voor trombine en 485 nanometer voor plasmine.
Stel vervolgens de emissiegolflengte in op 460 nanometer voor trombine en 525 nanometer voor plasmine. Stel vervolgens het plaattype in op een 96 put Greiner flat bottom zwarte microplate. Navigeer naar Leesgebied en definieer de plaatindeling met maximaal 20 putten per plaat.
Configureer de PMT- en optische instellingen door de PMT-versterking op 200 volt te zetten en het aantal flitsen per leessignaal op zes. Navigeer vervolgens naar Timing om de timinginstellingen te bevestigen met een totale looptijd van één uur, negen minuten en 30 seconden, een interval van 30 seconden. Ga naar Shake om te bevestigen dat je drie seconden voor de eerste lezing hebt geschud.
Ga naar Meer Instellingen om ervoor te zorgen dat de Leesvolgorde op Kolommen staat. Configureer de instellingen Compound Transfer before Read door het aantal compound transfers op één en het initiële volume op 120 microliter te zetten. Controleer of de pipethoogte 130 microliter is, het volume 20 microliter, de snelheid één microliter per seconde en het tijdstip 14 seconden.
Bevestig onder Compound Source het 96 Well Compound Plate-formaat en kies specifiek de Beckman 96 2,3 milliliter optie. Bevestig de instellingen van de Pipettenopmaak door de juiste kolommen te selecteren. Navigeer nu naar Samengestelde Tips Kolommen en selecteer de juiste kolommen.
Stel de temperatuur van de microplaatshaker in op 37 graden Celsius en controleer de temperatuur voor gebruik. Stel daarna de schudintensiteit in op 1.100 omwentelingen per minuut. Vervolgens ontdooi je patiëntplasma en normaal opgehoopt plasma in een waterbad van 37 graden Celsius tot 10 minuten.
Meng de plasmamonsters grondig en controleer volledige ontdooiing zonder zichtbaar cryoprecipitaat. Voeg met een pipet 80 microliter patiëntplasma of normaal gepoold plasma toe aan de vooraf geselecteerde putjes, waarbij voor elk monster een verse pipettip wordt gebruikt. Bereid vervolgens het substraatmengsel voor door 48 microliter cephaline te mengen met 48 microliter weefselfactor.
Voeg hieraan 240 microliter trinatriumchloridebuffer toe, daarna pipette je 96 microliter trombinesubstraat en 48 microliter plasminsubstraat. Pipetteer 20 microliter van het substraatmengsel in elke put. Schud daarna.
Plaats nu de microplaat in de fluorescentieplaatmeter en laat deze enkele minuten in evenwicht komen bij 37 graden Celsius. Combineer trinatriumchloridebuffer, trinatriumchloride calciumchloridebuffer en weefselplasminogenactivator om het startreagens te bereiden. Vortex grondig om te mengen.
Pipetteer het startreagensmengsel in alle rijen van de compoundkolom. Plaats het plaatje met het startreagensmengsel in de bronlade en start de fluorescentiemeting. Neem fluorescentiesignalen elke 30 seconden op gedurende 70 minuten.
Houd de plaat gedurende de meting op 37 graden Celsius. Voor data-analyse exporteert u de kinetische fluorescentiegegevens als een tabel met tijdspunten en fluorescentiewaarden per put. Bereken de eerste afgeleide en zet de enzymgeneratiecurves voor elke put in kaart om de generatie van trombine of plasmine over de tijd te visualiseren.
De hemostasistest maakte gelijktijdige, tijdsgebonden meting van trombine- en plasmingeneratie mogelijk om een geïntegreerde beoordeling van stolling en fibrinolyse te bieden. Verschillende parameters kunnen worden afgeleid uit de trombinegeneratiecurve, waaronder vertragingstijd, piekhoogte en trombinepotentiaal. Langere vertragingstijden, lagere piekhoogtes en verminderde trombinepotentiaal duiden op verminderde trombinegeneratie.
De plasmingeneratiecurve biedt ook meerdere parameters, waaronder fibrine-lysetijd en plasminpiekhoogte. Kortere fibrine-lysetijden en hogere piekhoogtes weerspiegelen een verbeterde plasmageneratie. Trombine- en plasmageneratiecurves van drie gezonde controles en normaal gepoold plasma toonden reproduceerbare piekhoogte-eindtiming, wat diende als referentieprofielen voor normale hemostatische functie.
Bij een patiënt met een factor V-activiteit van 3% ontbrak de trombineproductie volledig. De plasmaproductie nam echter marginaal toe. De patiënt met een Factor V-activiteit van 44% vertoonde verminderde trombineproductie met een verlengde vertraging en een lagere piekhoogte, terwijl plasmaproductie binnen het normale bereik bleef.
Bij een alfa-2-antiplasmattekort nam de plasmaproductie toe met afnemende activiteit van alfa-2-antiplasma. De homozygote patiënt met 23% activiteit vertoonde een vroege aanvang van plasmingeneratie, een kortere fibrine-lysetijd en een hogere plasmapiek. Deze veranderingen werden ook waargenomen bij de heterozygote patiënt met 73% activiteit, hoewel ze minder uitgesproken waren.
De hemostase-assay is zeer geschikt voor onderzoek naar zeldzame tekorten aan stollingsfactoren, fibrinolytische aandoeningen en hemostatische geneesmiddeleffecten. De belangrijkste uitdagingen zijn standaardisatie van de techniek en normalisatie van resultaten om de vergelijkbaarheid tussen kamers en laboratoria te verbeteren. Toekomstig werk kan zich richten op het automatiseren van de assay en het ontwikkelen van aanpassingen voor compatibiliteit met volbloed of geplateerd rijk plasma.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert de Nijmegen Hemostasis Assay (NHA), een protocol dat gelijktijdige, tijdsongevoelige meting van trombine- en plasminegeneratie in een enkele microplate-put mogelijk maakt. Door zowel stolling als fibrinolyse parallel te kwantificeren, biedt de NHA een uitgebreide beoordeling van de hemostatische balans, waardoor de beperkingen van conventionele assays die zich richten op geïsoleerde componenten of fasen worden overschreden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Hematologie
- Onderzoek naar stolling en fibrinolyse
- Klinische laboratoriumdiagnostiek
Achtergrond
- Trombine en plasmine zijn centrale enzymen bij de hemostase die respectievelijk de stolling en fibrinolyse reguleren.
- Traditionele assays (bijv. aPTT, PT, factoractiviteitsassays) beoordelen slechts specifieke aspecten van de hemostase.
- Er is behoefte aan geïntegreerde assays die de dynamische wisselwerking tussen stolling en fibrinolyse vastleggen.
- De NHA vult dit gat op door gelijktijdige meting van beide processen mogelijk te maken.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen en demonstreren van een protocol voor het parallel meten van de generatie van trombine en plasmine.
- Het bieden van een uitgebreidere beoordeling van de hemostatische balans in plasmaproeven.
- Het evalueren van het nut van de assay bij het detecteren van tekorten aan stollingsfactoren en fibrinolytische aandoeningen.
Gebruikte methoden
- Bereiding van platelet-arme plasmaproeven van patiënten en controles.
- Gebruik van twee synthetische fluorogene substraten met verschillende excitatie-/emissiespectra voor trombine en plasmine.
- Initiatie van de hemostase met weefselfactor, calcium en weefseltype-plasminogeenactivator.
- Fluorescentiemeting elke 30 seconden gedurende 70 minuten bij 37°C met behulp van een microplate reader.
- Data-analyse om enzymactiviteitscurven te genereren en parameters af te leiden zoals de lag-tijd, piekhoogte, trombinepotentieel, fibrinolysetijd en de plasminepiekhoogte.
Belangrijkste resultaten
- De NHA meet betrouwbaar de gelijktijdige generatie van trombine en plasmine met een goede intra- en inter-assay precisie.
- Referentieprofielen van gezonde controles vertonen reproduceerbare piekhoogtes en timing.
- Patiënten met een Factor V-deficiëntie vertonen een afwezige of verminderde trombinegeneratie en veranderde plasmineprofielen.
- Alfa-2-antiplasmine-deficiëntie leidt tot een verhoogde plasminegeneratie, een kortere fibrinolysetijd en hogere plasminepieken.
- De assay detecteert de modulatie van de hemostase door effectoren zoals heparine, geactiveerd proteïne C en epsilon-aminocapronzuur.
Conclusies
- De NHA biedt een geïntegreerde, dynamische beoordeling van de stolling en fibrinolyse in plasma.
- Het is geschikt voor onderzoek naar zeldzame coagulatiefactordeficiënties, fibrinolytische stoornissen en effecten van geneesmiddelen.
- Standaardisatie en normalisatie zijn nodig voor een bredere klinische toepassing; toekomstig werk kan zich richten op automatisering en aanpassing voor volbloed of plaatjesrijk plasma.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De Nijmegen Hemostasis Assay (NHA) maakt gelijktijdige, kwantitatieve meting van thrombine- en plasminegeneratie mogelijk, waardoor een dynamische en geïntegreerde beoordeling van coagulatie en fibrinolyse wordt geboden. Deze profiling van dubbele enzymen vult een kritisch hiaat op in hemostase-onderzoek in de ontdekkingsfase door mechanische risicoreductie en voorspellende zekerheid te ondersteunen voor therapeutische targets die de hemostatische balans beïnvloeden. De uitgebreide read-outs van de NHA vormen een basis voor besluitvorming in vroege fasen van de portfolio en voor translationele risicobeoordeling in hematologie- en trombose-R&D.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar zowel de stollings- als de fibrinolytische routes mogelijk in één enkel assaysysteem.
- Ondersteunt functionele validatie van targets door de enzymgeneratiekinetiek en de respons op effectoren te kwantificeren.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie voor kandidaat-targets die de hemostatische balans moduleren.
- Biedt referentieprofielen voor normale en door ziekte gewijzigde hemostase, wat helpt bij de triage van de portfolio.
Screening & assayontwikkeling
- Levert gevalideerde, reproduceerbare biologische readouts voor zowel thrombine als plasmine in parallel.
- Standaardiseert assay-condities voor cross-vergelijking van compound-effecten op coagulatie en fibrinolyse.
- Maakt kwantitatieve, tijdopgeloste outputs mogelijk die geschikt zijn voor screening- en lead-optimalisatieworkflows.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van het platform en hergebruik binnen diverse hemostase-onderzoeksprogramma's.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante fenotypering voor zeldzame stollings- en fibrinolytische stoornissen.
- Biedt translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van hemostatische interventies.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van geïntegreerde hemostatische functieprofielen.
- Ondersteunt de ontwikkeling van biomarkers voor de beoordeling van bloedings- en thromboserisico's.
Integratie van pipeline & workflow
De NHA past binnen het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek en vormt een brug tussen vroege mechanistische studies en translationeel onderzoek naar hemostase en trombose.
- Discovery Biology: Kwantificeert de dynamische interactie tussen coagulatie en fibrinolyse, ter ondersteuning van hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en kwantitatieve enzymgeneratiecurves voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Genereert kinetische parameters zoals lag-time, piekhoogte en enzympotentieel voor een robuuste vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Maakt ziekte-relevante fenotypering en biomarker-afstemming mogelijk voor preklinische modellen.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar, schaalbaar assayplatform voor diverse behoeften op het gebied van hemostase-onderzoek en geneesmiddelenontwikkeling.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van hemostatische targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van hemostase-assays tussen verschillende teams.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door de integratie van coagulatie- en fibrinolysegegevens.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van hemostase-gerelateerde assets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de biologie van de hemostase en kinetische fluorescentie-data-analyse.
- Toegang tot dual-wavelength fluorescentie plaatlezers en gestandaardiseerde reagentia is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist voor interlaboratorium vergelijkbaarheid.
- Aanpassing aan volbloed of platelet-rich plasma kan verdere protocolontwikkeling vereisen.
- Normalisatie en referentieprofilering zijn essentieel voor een robuuste interpretatie over verschillende studies heen.
