Ontwikkeling van een nieuw intern fixatiemodel voor radiale rattenfracturen: fractuurgenezing en isolatie van dorsale wortelganglionen

Radiale fracturen komen wereldwijd zeer vaak voor en zijn een belangrijke oorzaak van lange botbreuken in extremiteiten. Het rat radiale fractuurmodel is cruciaal voor het bestuderen van fractuurgenezing, geneesmiddelscreening en biomateriaalevaluatie in orthopedisch onderzoek. Omdat de radius van ratten relatief dun is, zijn de stalen platen en schroeven die momenteel in de klinische praktijk worden gebruikt niet geschikt voor de behandeling van radiale fracturen bij ratten.

Om deze beperking te overwinnen, combineert het protocol op innovatieve wijze hechting en titanium naaldfixatie, waarmee een stabiel radiaal fracturmodel wordt gecreëerd voor onderzoek naar interne fixatie. In het protocol presenteerden we ook het gebruik van het micro-CT-beeldvormingssysteem van levende dieren om de genezing van de breuk bij ratten te verduidelijken. We toonden ook de extractie en kweek van de DRG in het ratfracturemodel, dat zal worden gebruikt om het mechanisme van zenuwletsel en herstel bij fracturen te bestuderen.

De chirurgische instrumenten voor rattenbreuk omvatten een scalpelmes, het scalpelhandvat, een bedieningsschaar, een naaldhouder, een hemostatische tang en een tandweefselpincet. De mannelijke Sprague Dawley-rat, ongeveer 8 weken oud en ongeveer 200 gram zwaar. Verdoof de rat met een isofluranegas-anesthesiemachine en houd de beademingsanesthesie gedurende de hele operatie.

Houd de temperatuur van de operatiekamer op 28 °C. Plaats de rat in de laterale positie. Laat het rechter voorpoot bloot en skeer het haar af met een knipper. Leg een steriel laken over en wikkel een tourniquet om het proximale rechtervoorbeen om chirurgisch bloedverlies te verminderen.

Bereid de huid voor door drie keer alcohol en betadine-scrubs af te wisselen. Maak een lengtesnede van 1,5 cm aan de dorsale radiale zijde van de rechter onderarm. Scheid de spierruimtes en leg de radius van de rechter voorpoot volledig bloot.

Gebruik een bedieningsschaar om de straal af te knippen en zo een transversale breuk te creëren. De richting van de schaar vormt een hoek van 90 graden ten opzichte van de straal. Neem een titanium naald van 0,8 mm diameter en 10 mm lang en steek deze in de radiale breuk langs de lengteas.

Bevestig de radius en de titanium naald met hechting. De hechting werd met drie opeenvolgende knopen vastgemaakt en de titanium naald werd met vier onderbroken hechtingen aan de radius bevestigd. Naai de huidkleur van de overtollige hechting en sluit het hout.

Desinfecteer de huid met betadine-scrubs. Bedek de wond met steriel gaas en maak het vast met verband. De rat kwam na de narcose weer bij bewustzijn en de toestand herstelde goed.

Verdoof de rat met een isoflurane gas-anesthesiemachine. Plaats de rat in een buikligging binnen de scankamer. Pas de positie van ledematen en hoofd aan om het doelgebied in het gezichtsveld te centreren en handhaaf continue ventilatie en anesthesie gedurende de procedure.

Duw het vaste dierenbed in de scankamer en sluit de kamerdeur. De micro-CT scanparameters werden als volgt ingesteld: scanmodus: standaard, belichtingstijd: twee minuten, gezichtsveld: 72 mm, voxelgrootte: 144 m, kilovolt: 90; micro-ampère:88, filter:3D-zacht. De scangegevens worden automatisch naar de software verzonden en er wordt een driedimensionale CT-afbeelding gegenereerd.

Scheid de doelweefsels. Exporteer de bewerkte afbeeldingen. Snijd de wervelkolom door, verwijder de C1 tot C7 wervellichamen.

Snijd de halswervelkolom langs de voorste en achterste middenlijn, verdeeld in linker- en rechterhelft. Gebruik een tandeweefselpincet om de DRG op te pakken, til hem voorzichtig op en gebruik dan een bedieningsschaar om de zenuwvezels door te snijden. Overbreng geëxtraheerde DRG's naar een 1,5 mL centrifugebuis met extractiemedium.

Leg het op ijs. Aspireer langzaam en gooi het extractiemedium weg. Voeg 1 ml gemengde spijsverterings- en enzymwerkoplossing toe.

Digestie in een 37 °C waterbad gedurende 60 tot 70 minuten. Pipette een passende hoeveelheid van de fibronectine-werkoplossing in een petrischaal en bedek deze een uur in een 37°C incubator. Na de vertering aspireer en gooi de gemengde werkvloeistof weg.

Verzamel filtrat, centrifugeer op 70 x g gedurende 8,5 minuten. Na centrifugatie aspireer en verwijder je het supernatant in de centrifugebuis. Voeg 1 ml volledig medium toe om het neerslag opnieuw te laten ophangen.

Haal de petrischaal eruit. Gooi de fibronectine-werkoplossing weg en was twee keer met PBS. Inoculeer de cellen in een petrischaal en voeg 1 ml volledig medium toe.

Plaats ze 8-12 uur in een incubator bij constante temperatuur op 37°C met 5% kooldioxide. De micro-CT-beeldvorming bevestigde het succesvolle vestigen van radiale fracture-rattenmodellen en interne fixatiemodellen voor ratten-radiale fracturen. 20 dagen na de modellering toonde micro-CT-analyse van SD-ratten in de fracturemodelgroep een gunstige prognose.

Er werd een eeltvorming waargenomen die de uiteinden van de breuk oversloot, met progressieve fusie en geleidelijke uitwissing van de breuklijn, wat overeenkomt met de vroege fase van botvereniging. Beelden toonden een vage breuklijn in het gemodelleerde gebied, wat suggereert dat botweefsel op de breukplaats grotendeels was genezen. Op de 5e tot 6e dag na DRG-isolatie vertonen neuronale cellen uitgebreide cytoplasmatische blootstelling.

In dit stadium zijn de gehele neuronale cellichamen en hun omringende synapsen duidelijk te onderscheiden. Immunofluorescentiemicroscopie werd gebruikt om neuronale cellen te fotograferen op de zesde kweekdag. Zoals weergegeven in Figuur 9, werd Beta III-tubuline weergegeven als groene fluorescentie.

Beta III-tubuline-positieve cellen, inclusief zowel DRG-cellichamen als axonen, waren groen gekleurd, en de blauwe fluorescentie vertegenwoordigt de kernen van neuronen die door DAPI zijn gekleurd. Ratten zijn een klassiek model voor het bestuderen van het mechanisme van fractuurgenezing vanwege hun duidelijke genetische achtergrond en korte voortplantingscyclus. De kleine straaldiameter van ongeveer 1-1,5 mm maakt het echter onmogelijk om een klinisch intern fixatieapparaat te evenaren, wat het nut ervan in zenuwbotgenezingsonderzoek sterk beperkt.

Als reactie op dit probleem stelde deze studie op innovatieve wijze de interne fixatiemethode van gecombineerde hechting van titanium naalden voor. De kernlogica is om de starre fixatie van schroeven te vervangen door de flexibele ligaties van hechtingen, wat de iatrogene zenuwbeschadiging kan verminderen en een stabiele mechanische omgeving kan bieden. Dit protocol bood herhaalbaarheid en standaardisatie voor de constructie van het model.

De hechtingen en titanium naalden worden gebruikt voor interne fixatie in modellen van rattenradiale breuken. De genezing van de breuk wordt beoordeeld via micro-CT. De primaire DRG-neuronen worden geïsoleerd en gekweekt na geneeshezingsonderzoeken van de breuk.

In het protocol combineren we op innovatieve wijze hechtingen en titanium naalden voor stabiele interne fixatie in een rat radiale fractuurmodel. Fractuurgenezing werd beoordeeld via micro-CT, en primaire DRG-neuronen werden geïsoleerd en gekweekt voor verder onderzoek.