Multiplexed Immunofluorescentietest voor ruimtelijke beoordeling van senescence-markers in vivo
24 juli 2026
Multiplexed immunofluorescentie maakt sequentiële labeling van meerdere antilichaammarkers binnen één weefselsectie mogelijk om ruimtelijke analyse van weefselarchitectuur en celpopulaties te ondersteunen. Hier wordt een workflow gepresenteerd voor multiplexdetectie van senescentie-geassocieerde, structurele en immuunmarkers, inclusief handmatige en geautomatiseerde preparat, iteratieve beeldvorming en single-cell analyse met behulp van digitale pathologiesoftware.
De ruimtelijke analyse van senescente cellen is belangrijk om hun bijdrage aan processen zoals veroudering, kanker, immuniteit en normale weefselhomeostase te begrijpen. De detectie van verouderde cellen is afhankelijk van het profileren van meerdere biomarkers. Multiplex-immunofluorescentiebeeldvorming maakt het mogelijk om deze met hoge doorvoer binnen één weefselsnede te profileren.
Om te beginnen verifieer dat de 5 micrometer dikke formaline-gefixeerde, paraffine-ingebedde of FFPE-weefselsecties met een maximale grootte van 4 x 2 centimeter vierkant centraal zijn gemonteerd op positief geladen microscopie-glaasjes en duidelijk zichtbaar zijn binnen het kijkvenster van de coverslipless glaashouder. Voer de monstervoorbereidingsstappen uit, hetzij handmatig met een ontmaskeringskamer, hetzij automatisch met een geautomatiseerde kleuring. Plaats de voorbereide slides in de dekselloze schuifhouder.
Lijn de bovenste en rechter randen uit tegen de metalen stoppen. Vergrendel de slede met beide handen tegelijk om de plastic cams naar de gesloten hangslot te draaien. Controleer of de slede volledig plat zit en niet in de houder wiegt.
Plaats de ClickWell, plaats de kamer over de slede en knijp met twee handen in de zijbalken om de druk te beperken en breuken te voorkomen. Laad de klikput met 2 milliliter montagemedium met 50% glycerol in fosfaatgebuffte zoutoplossing via de inlaatpoort. Voeg een barcodelabel toe aan de linkerkant van de slide in beide richtingen, en ga dan verder met beeldvorming.
Voor regioselectie en autofluorescentie-analyse, open de Mx Workflow versie 4204, multiplex imaging acquisition software. Klik op Tools om Protocol Publisher te selecteren. Voer in de Multiplex Protocol Publisher-pop-up de protocolnaam in.
Klik op Create Setup Round, gevolgd door Voeg Next Protocol Round toe om meerdere rondes biomarker-labeling te maken. Klik op Publiceren en selecteer vervolgens OK in het pop-upvenster. Verkrijg het Cy3-kanaal voor virtuele H&E-beelden.
Klik op Slide en maak vervolgens een nieuwe batch aan. Na het selecteren van de protocolnaam voer je de dia-ID in. Klik op Voeg Dia toe en selecteer vervolgens Create Batch voor het creëren van een multiplex-experimentworkflow. Open de Cell DIVE acquisitiesoftware.
Klik op Laden om de preparaat in de microscoop te laden. Klik onder het keuzemenu Tools op het rasterpictogram om de gewenste gebieden te definiëren en gebruik de Verplaatsingstool om de gedefinieerde regio's te verplaatsen. Gebruik vervolgens de Teken-tool om velden die niet nodig zijn te deselecteren, zodat elk gezichtsveld minstens twee aangrenzende gezichtsvelden heeft om bordelproblemen te voorkomen, en klik op Regio's opslaan.
Klik in het Mx Workflow-venster op Viewer QC om de Cell DIVE-viewerpagina te openen en het weefselbeeld in 10x vergroting te visualiseren. Klik op het pictogram voor beeldcorrectie om de beeldhelderheid aan te passen en klik op Submit QC om 'Pas en Herlaad Dia' te kiezen in het pop-upvenster. Zodra de afbeelding opnieuw geladen is, klik je op Add ROI om de interessegebieden te tekenen en aan te passen.
Selecteer de gewenste gezichtsvelden en herhaal de toevoeging van ROI. Klik vervolgens op Verzenden naar laboratorium. Laad de dia om de 20x autofluorescentiebeeldopname te starten.
Selecteer onder het menu Imaging QC het selectievakje dat bij de specifieke dia-ID hoort en klik vervolgens op Viewer QC. Zoom in op de geladen afbeelding om te scannen op onscherpe gebieden of artefacten. Controleer de achtergrondbeelden van elk kanaal, die worden afgetrokken van het uiteindelijke biomarkersignaal. Klik op Submit QC, selecteer vervolgens Pass en Exit om achtergrondafbeeldingen te genereren.
Voor sequentiële biomarkerkleuring centrifugeer je de antilichamen op 13.000 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur om artefacten te beperken. Bereid de antistofoplossing voor met een verdunning van 1 op 200 in fosfaatgeboterde zoutoplossing, of PBS, die 0,3% bovine serumalbumine, of BSA, bevat. Verwijder het montagemedium door uit de ClickWell-poort te pipetteren.
En drie keer wassen met 2 milliliter PBS met 0,01% of PBST gedurende 5 minuten. Voeg 350 microliter antistofoplossing toe aan de poort om volledige monsterdekking binnen de kleuringskamer te garanderen. Broed een uur uit op kamertemperatuur.
Vervolgens pipetteer je de antistofoplossing uit de ClickWell-poort. En was drie keer met 2 milliliter PBST gedurende 5 minuten. Voeg 2 milliliter montagemateriaal toe.
Steek de ClickWell-houder in de microscoop en laad de dia, zodat je 20x biomarker-beeldvorming kunt starten. Voer de imaging QC uit met de blend editor en beeldcorrectieopties en dien de beeldkwaliteitscontrole in. Pipetteer het montagemedium uit de ClickWell-poort en spoel drie keer met 2 milliliter PBST gedurende 5 minuten.
Bereid de inactivatieoplossing voor de kleurstof vers voor gebruik. Voeg na het verwijderen van PBST 2 milliliter kleurstofinactivatieoplossing toe voor elke glaasje. Broed 15 minuten uit in de glaashouder.
Pipett de kleurstofinactivatieoplossing uit de ClickWell-poort en was 5 minuten met 2 milliliter PBST. Voeg 2 milliliter montagemedium toe en plaats de ClickWell-houder in de microscoop om automatische ronde-specifieke 20x autofluorescentiebeeldvorming te starten. Voer de workflow voort door QC-stappen zoals aangegeven op het scherm te laten doorlopen na voltooiing.
Herhaal de sequentiële kleuring, kleurstofinactivatie en multiplexbeeldvorming voor zoveel markers als nodig is, en ga door tot de voltooiing. Gebruik HALO-software om verschillende kanalen te selecteren voor het visualiseren van de lokalisatie van markers op verschillende gebieden van de weefselkern. Klik op Analyseren en selecteer Volledige afbeelding om de kwantitatieve metrics voor individuele markers te analyseren.
Klik op Resultaten om het totale aantal cellen in de geanalyseerde weefselkern en de subset cellen die specifieke markers uitdrukken te bekijken. In vergelijking met de geautomatiseerde dia-kleurmethode resulteerde de handmatige decloaking-kamermethode in een hogere frequentie van weefselartefacten die specifiek werden gekenmerkt door weefselloslating en verloren of verschoven kernen. Kwantificering uitgevoerd met digitale pathologiesoftware op representatief alvleesklierweefsel toonde aan dat p16-positieve cellen geassocieerd waren met lagere LB1-niveaus en omgekeerd, wat een profiel aantoonde dat consistent is met senescence-geassocieerde markerpatronen.
Een Z-score genormaliseerde warmtekaart illustreert de verdeling van het p16 positieve lamin-B1 negatieve senescentiefenotype over verschillende weefsels, waarbij hoge concentraties senescentiecellen in de long, bijnieren en hypofyse worden getoond, overeenkomend met verhoogde p16- en verlaagde LB1-niveaus. Omgekeerd vertoonden de appendix, lymfeklier en milt een lage senescentie, waarbij een hoge LB1- en lage p16-expressie behouden bleven. Dit protocol maakt het mogelijk om een combinatie van senescentie-, structurele en immuunbiomarkers binnen één microscopie-dias te onderzoeken.
Door meerdere markers binnen één monster te combineren, kan ruimtelijke analyse van weefselarchitectuur en senescente celverdeling worden uitgevoerd. Toekomstige toepassingen omvatten grootschalige profilering van senescentie-biomarkers over meerdere weefseltypen en integratie met ruimtelijke omics om cellulaire heterogeniteit beter op te lossen.
Overview
This article presents a comprehensive protocol for multiplexed immunofluorescence (IF) staining, enabling the simultaneous detection of multiple antibody markers within a single tissue section. The method is particularly suited for profiling senescent cells across diverse human tissue types, allowing for detailed spatial and quantitative analysis that surpasses traditional IF techniques.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Immunofluorescence imaging
- Digital pathology
- Tissue microarray analysis
Background
- Traditional IF imaging is limited in the number of markers that can be assessed simultaneously.
- Senescence lacks a universal biomarker; signatures vary by cell type, trigger, and time since induction.
- Multiplexed IF allows for the detection of multiple markers in a single tissue section, improving cell type and structure profiling.
- Spatial relationships between cell types and tissue structures are critical for understanding senescence in situ.
Purpose of Study
- To provide a detailed protocol for multiplexed IF staining and imaging of human tissue samples.
- To enable unbiased detection and spatial analysis of senescent cells using combinatorial biomarker approaches.
- To demonstrate the utility of multiplexed imaging for comprehensive tissue profiling.
Methods Used
- Tissue microarrays from 34 human tissue types were utilized.
- 10-plex immunofluorescence staining targeting structural, immune, and senescence biomarkers.
- Sequential staining, imaging, and dye inactivation cycles to build multiplex datasets.
- Image acquisition with a multiplex fluorescence slide scanner.
- Protocols for both manual and automated slide preparation.
- Single-cell segmentation and spatial analysis using digital pathology software.
Main Results
- Successful multiplexed detection of multiple biomarkers within single tissue sections.
- Assessment of abundance and spatial distribution of senescent cells across diverse tissues.
- Generation of high-content multiplex datasets suitable for advanced spatial analysis.
- Protocols adaptable for both manual and automated workflows.
Conclusions
- Multiplexed IF provides a powerful, unbiased approach for senescent cell detection in situ.
- The described methods facilitate comprehensive spatial and quantitative analysis of tissue samples.
- This protocol serves as a general guide for multiplexed imaging in research and pathology applications.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Multiplexed immunofluorescence enables high-content spatial profiling of senescence markers across diverse human tissues, addressing the challenge of heterogeneous senescence signatures in drug discovery. This approach enhances predictive confidence in target validation and supports translational continuity by allowing simultaneous assessment of multiple biomarkers within a single tissue section. The method is positioned to improve decision-making at key inflection points in early discovery and preclinical research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive interrogation of senescence-associated pathways using combinatorial biomarker panels.
- Supports biological de-risking by revealing cell-type and context-specific senescence signatures.
- Facilitates predictive confidence in target selection through spatially resolved marker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Standardizes multiplexed assay workflows for reproducible and quantitative biomarker detection.
- Enables scalable imaging and analysis suitable for high-throughput tissue microarray studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial biomarker data with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting unbiased senescent cell detection.
- De-risks advancement decisions by quantifying abundance and distribution of senescent cells in situ.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed IF assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatially resolved, quantitative analysis of senescence markers in human tissue microarrays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multi-marker spatial profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated tissue contexts.
- Analytics: Provides high-content imaging datasets and digital pathology outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by aligning biomarker data with disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for multiplexed imaging across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence research.
- Operational Value: Standardizes multiplexed imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust spatial biomarker analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed immunofluorescence and digital pathology analysis.
- Needs access to multiplex slide scanners and compatible digital pathology software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and analysis protocols.
- Adaptable to both manual and automated slide preparation workflows.
- Dependent on tissue quality and marker panel optimization for reliable outputs.
