Isolatie van pericyten uit muiscorticaal weefsel met FACS voor single-cell sequencing
30 januari 2026
Om muishersencorticale pericyten te verkrijgen die voldoen aan de eisen van scRNA-seq, presenteren we een kritisch geoptimaliseerd FACS-protocol gebaseerd op CD13/CD31⁻-selectie. Onze belangrijke verfijningen verbeteren de levensvatbaarheid van cellen en de integriteit van RNA aanzienlijk, waardoor betrouwbare transcriptomische profilering mogelijk wordt.
Ons onderzoek onderzoekt hersenparasieten met de nadruk op hun vasculaire rollen en hun interacties binnen de neurovasculaire eenheid om de cerebrale functie te begrijpen. Lage beeldvorming en ruimtelijke FACS in een darmproces die de parasietfunctie in hersenvaaten in kaart brengen en de locatie-specifieke rollen en therapeutische doelen onthullen. Om te beginnen spuit je het hoofd- en nekgebied van een geëuthanaseerde muis met 75% ethanol.
Maak met een scalpel een middenlijninsnijding van de hoofdhuid van het occipitale deel naar het frontale gebied om de schedel bloot te leggen. Voer een transversale incisie uit vóór de bilaterale oogcellen, gevolgd door laterale incisies langs de onderste randen van het cerebellum om de schedelbasis los te maken. Incèreer het calvarium longitudinaal langs de sagittale naad van achterste naar voorzijde.
Til samen met een duramater de schedelflap op om de hersenen bloot te leggen. Met een chirurgische schaar verhoog je de hersenen voorzichtig terwijl je de oogzenuwen en de verbinding van het ruggenmerg van de medulla oblongata doorsnijdt. Plaats het intacte brein voorzichtig in een schaaltje van 10 centimeter met 10 milliliter ijskoude PBS, zodat schade wordt voorkomen.
Breng de hersenen over op aluminiumfolie. Leg de subarachnoïdale ruimte bloot. Na het verwijderen van de dura met een tang, spoel je hem af met Hank's gebalanceerde zoutoplossing.
Overbreng het tissue naar filterpapier en verwijder de piamater door te rollen. Snijd met een scheermesje de reukbol en de meeste caudale delen af en verwijder de hersenen, en snijd de hersenen coronaal in plakjes van twee tot drie millimeter dik. Isoleer de hersenschors langs het corpus callosum.
Overbreng het corticale weefsel naar ampullen met drie milliliter ijskoude weefselverzamelbuffer. Met chirurgische scalpels snijd je het weefsel en de ampullen in fragmenten van ongeveer één bij één millimeter, en voltooi je het hakken binnen vijf minuten om de versheid van het weefsel te behouden. Spoel pipettips vooraf met een tissue collection buffer.
Vervolgens aspireer je langzaam de gehakte fragmenten richting de top van de punt terwijl je de pipet verticaal vasthoudt. Druk de fragmenten voorzichtig uit in voorgekoelde 15 milliliter centrifugebuizen. Was de originele ampullen met 2% FBS in PBS-zoutoplossing.
Plaats de wash in dezelfde centrifugebuizen en centrifugeer op 300G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg na centrifugatie. Susselt elke pellet opnieuw in drie milliliter CD-enzym werkoplossing.
Verdeel de suspensie gelijkmatig in drie buizen en voeg extra enzymoplossing toe om een eindvolume van vijf milliliter per buis te bereiken. Incubeer de buizen in een hybridisatieoven bij 37 graden Celsius gedurende 100 minuten met orbitale schuddingen bij 100G. Voeg tijdens de incubatie één milliliter dnase één oplossing toe aan 10 milliliter 2% FBS in PBS.
Beëindig de vertering door te centrifugeren op 300G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Suspendeer vervolgens elke pellet opnieuw in één milliliter weefseldissociatieoplossing. Pipette de oplossing 100 keer om mechanische dissociatie te bevorderen.
Vervolgens verzamel je alle suspenties in één enkele 50 milliliter centrifugebuis. Spoel elke tube af met twee milliliter buffer en meng de washes. Na centrifugatie op 300G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en het weggooien van de bovenste laag, voeg je 12,5 milliliter van 20% BSA toe en keer je om om te mengen.
Centrifugeer op 1000 G bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel nu de onderste pellet en doe het supernatant over in een nieuwe 50 milliliter centrifugebuis. Voorzichtig opnieuw ophangen voordat je opnieuw centrifugeert.
Suss elke pellet opnieuw in twee milliliter van 2% FBS in PBS. Combineer vervolgens beide ophangingen tot één buis. Centrifugeer de gecombineerde suspensie op 300G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.
Na het weggooien van het supernatant, suspendeer je de laatste pellet opnieuw in twee milliliter PBS met 2% FBS. Bereid vier centrifugebuizen van 15 milliliter voor met vier milliliter 22% per oproepoplossing. Laag voorzichtig 0,5 milliliter aliquot van de celsuspensie op elke gradiënt en centrifugeer op 560G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius.
Na het aspireren van het supernatant wordt elke pellet opnieuw opgehangen in één milliliter HBSS BSA-glucosebuffer. Trek dan de ophangingen in een nieuwe 15 milliliter buis. Spoel de percolbuizen af met twee milliliter buffer en meng de washes voordat je ze centrifugeert op 300G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Voor flowcytometrie wordt de pellet opnieuw opgehangen in één milliliter HBSS BSA-glucosebuffer na het aspireren van de supernadant. Voeg vijf microliter FC-receptorblokkerend reagens toe en incubeer vijf minuten bij vier graden Celsius. Daarna pipetteerde hij fluorescentie-geconjugeerde antilichamen aan de suspensie voordat het werd incuberend.
Was de cellen met zes milliliter HBSS BSA glucosebuffer. Centrifugeer de suspensie vervolgens op 300G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Na het aspireren van het supernatant wordt de pellet opnieuw opgehangen in één milliliter buffer.
Voeg 200 microliter van zeven amino-actinomycine D-oplossing toe en incubeer 10 minuten op ijs. Stel daarna het eindvolume aan naar twee milliliter met een HBSS-buffer aangevuld met BSA en glucose. Spoel het binnenoppervlak van de sorteer-verzamelbuizen af met 1% BSA-oplossing.
Aspireer de overtollige oplossing, zodat er precies één milliliter oplossing in elke buis overblijft. Bewaar de buizen op ijs om gesorteerde cellen te ontvangen. Cellen die van hersenweefsel losliepen, werden sequentieel geschakeld door het voorwaartse verstrooiingsgebied en het zijdelingse verstrooiingsgebied om cellulair afval uit te sluiten tijdens het sorteren van flowcytometrie.
CD45-positieve en CD41-positieve dubbele positieve gebeurtenissen werden uitgesloten om hematopoëtische cellen en bloedplaatjesverontreinigingen te verwijderen. CD13 positieve vaatwandcellen werden verrijkt. En apoptotische cellen werden uitgesloten met zeven amino-actinomycine D negatieve gating, gevolgd door CD31 negatieve selectie om parasieten te isoleren.
Flowcytometrie-sortering toonde aan dat nucleaire cellen 59,8% van alle gebeurtenissen uitmaakten. CD13-positieve cellen waren goed voor 1% van alle gebeurtenissen. En de laatste CD13-positieve CD31-negatieve parasietpopulatie was goed voor 0,7% van alle gebeurtenissen.
De dimensionaliteitsvermindering van de gesorteerde cellen in UMAP bracht zes verschillende hoofdclusters aan het licht die wijzen op cellulaire heterogeniteit binnen de geïsoleerde populatie. Z-score genormaliseerde heat map-analyse toonde aan dat parasietmarkergenen sterk en overwegend tot expressie kwamen in clusters nul tot en met drie. Analyse van clusterproportie toonde aan dat clusters nul tot en met drie 87,1% van de totale bevolking uitmaakten.
Terwijl gladde spiercelmarkers verrijkt waren in cluster vier met 10,14% en fibroblastmarkers in cluster vijf met 2,77%. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om draagbare parasieten met hoge zuiverheid te isoleren die geschikt zijn voor downstream single-celsequencing en functionele analyse. De grootste uitdaging is het ontbreken van zeer specifieke parasietmarkers, de complexe isolatie en het toenemende risico op seculiere besmetting. Toekomstige studies kunnen zich richten op het identificeren van parasietspecifieke markers, wat verbeterde isolate, diepere functionele karakterisering en gerichte therapeutische onderzoeken mogelijk maakt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd en reproduceerbaar protocol voor het isoleren van pericyten uit de hersenen van muizen, geschikt voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq). Door de gevestigde CD13+/CD31- sorteerstrategie te verfijnen en belangrijke verbeteringen te introduceren, maakt deze methode een robuuste isolatie van levensvatbare pericyten mogelijk, wat de studie naar hun heterogeniteit en hun rol bij neurovasculaire ziekten vergemakkelijkt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Pericyten zijn essentieel voor het behoud van de integriteit van de bloed-hersenbarrière.
- Ze reguleren de cerebrale hemodynamische homeostase door de microvasculaire tonus te moduleren.
- Disfunctie van pericyten is gekoppeld aan diverse neurologische aandoeningen.
- Inzicht in de heterogeniteit van pericyten is cruciaal voor het verduidelijken van hun rol bij neurovasculaire ziekten.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren van pericyten uit de hersenen van muizen, geschikt voor scRNA-seq.
- Het mogelijk maken van hoogwaardige single-cell analyse van pericyt-heterogeniteit.
- Het bieden van een instrument voor het onderzoek naar pericyt-mechanismen bij neurovasculaire aandoeningen.
Gebruikte methoden
- Het oogsten van hersenen van volwassen C57BL/6-muizen.
- Mechanische dissociatie en enzymatische digestie van hersenweefsel om enkelcel-suspensies te verkrijgen.
- Sequentiële centrifugatiestappen.
- Resuspenderen van de uiteindelijke celpellet in 20% bovine serumalbumine (BSA) om stress en aggregatie te minimaliseren.
- Fluorescence-activated cell sorting (FACS) met behulp van de CD13+/CD31- strategie.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol levert levensvatbare pericyten uit de hersenen van muizen op die geschikt zijn voor scRNA-seq.
- Het gebruik van 20% BSA verbetert de cellevensvatbaarheid en de RNA-kwaliteit.
- De methode is reproduceerbaar en robuust voor het isoleren van pericyten.
- Maakt gedetailleerde studie van de heterogeniteit van pericyten op single-cell resolutie mogelijk.
Conclusies
- Dit geoptimaliseerde protocol vergemakkelijkt de hoogwaardige isolatie van pericyten uit de muizenhersenen voor scRNA-seq.
- Het biedt een waardig instrument om de diversiteit van pericyten en hun pathologische rollen bij neurovasculaire aandoeningen te ontleden.
- Deze benadering kan het onderzoek naar pericyt-gerelateerde mechanismen bij neurologische stoornissen bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Robuuste isolatie van levensvatbare pericieten uit corticaal weefsel van muizen met behulp van FACS voldoet direct aan de behoefte aan getrouwe cellulaire inputs bij het ontdekken van neurovasculaire targets. Dit protocol vergroot het voorspellend vertrouwen in single-cell RNA-sequencingstudies door celstress en aggregatie te minimaliseren, wat een rigoureuze targetvalidatie en mechanische risicoreductie in de vroege fase van drug discovery voor het centraal zenuwstelsel ondersteunt. Deze aanpak maakt schaalbare, reproduceerbare workflows mogelijk die essentieel zijn voor portfoliotriage en de continuïteit van translationeel onderzoek.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt nauwkeurige analyse mogelijk van pericyt-heterogeniteit die relevant is voor mechanismen van neurovasculaire ziekten.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door hoogwaardige single-cell inputs te leveren voor transcriptomische profilering.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door reproduceerbare isolatie van gedefinieerde celpopulaties.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gevalideerde pericytenpopulaties voor downstream single-cell assays en moleculaire screening.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van assays door celaggregatie en stress te minimaliseren.
- Ondersteunt kwantitatieve read-outs die essentieel zijn voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen in CNS-georiënteerde pipelines.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante systeemmodellering door pericyten te isoleren die betrokken zijn bij neurovasculaire pathologie.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking naar preklinische validatie door de generatie van hoogwaardige single-cell data.
- Biedt een platform voor het identificeren van translationele biomarkers gekoppeld aan pericytdysfunctie.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit op FACS gebaseerde protocol voor de isolatie van pericyten bevindt zich op het grensvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek en levert hoogwaardig cellulair materiaal voor single-cell sequencing en daaropvolgende functionele studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door single-cell transcriptomische analyse van pericyten mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, levensvatbare celpopulaties voor assay-ontwikkeling en compound-screening.
- Analytics: Levert kwantitatieve single-cell RNA-outputs voor comparatieve conditie-analyse.
- Translationeel Onderzoek: Faciliteert de ontdekking van biomarkers en de elucidatie van ziekte mechanismen in neurovasculaire modellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerde workflow die aanpasbaar is aan andere CNS-celtypen met marker-optimalisatie.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neurovasculaire targets.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows voor single-cell isolatie.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go beslissingen en de kapitaalefficiëntie bij de verdere ontwikkeling van het CNS-portfolio.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van neurovasculaire targets en translationele programma's mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de bediening van FACS en de selectie van neurovasculaire celmarkers.
- Vraagt om toegang tot hoogwaardige infrastructuur voor flowcytometrie en single-cell sequencing.
- Noodzaak tot cross-team standaardisatie van protocollen voor weefselverwerking en cel sortering.
- Kan aanpassing van markerpanels vereisen voor andere CNS-celtypen of ziektemodellen.
- Celviabiliteit en RNA-integriteit zijn afhankelijk van nauwkeurige hantering en het voorkomen van aggregatie door middel van BSA.
