Gestandaardiseerde methode om tunnelende nanobuisjes in menselijke huidcellen te detecteren voor toepassingen in weefseltechnologie

We ontwikkelden methoden om de tunnelende nanobuisjes tussen menselijke huidcellen betrouwbaar te detecteren en analyseren en hun potentiële rol bij huidregeneratie te bestuderen. Ons protocol is ontworpen voor vaste monsters of voor primaire menselijke huidcellen. Het is nuttig in onderzoek naar huidbiologie en weefselregeneratie.

Om te beginnen ontdooien en kweek je menselijke epidermale keratinocyten en dermale fibroblasten in schaaltjes van 60 millimeter met het juiste groeimedium. Vul de keratinocytkweken aan met Y-27632 tot een uiteindelijke concentratie van vijf micromolaren tijdens reanimatie. Houd alle culturen op 37 graden Celsius in een bevochtigde broedmachine totdat ze ongeveer 80% confluentie bereiken.

Verwijder daarna het medium uit het kweekschaaltje. Spoel de cellen kort af met één milliliter PBS om de fysiologische pH en osmolariteit tijdens het wassen te behouden. Aspireer de PBS volledig.

Voeg één milliliter 0,05% trypsine EDTA toe en verdeel het gelijkmatig over het celoppervlak. Incubeer het gerecht op 37 graden Celsius gedurende 1,5 tot 2,5 minuten. Suspendeer de cellen voorzichtig opnieuw door ze op en neer te pipetten.

Voeg twee milliliter groeimedium toe om het trypsine te neutraliseren. Breng de celsuspensie over in een buis van 15 milliliter en centrifugeer op 200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na de centrifugatie wordt het supernatant uit de centrifugebuis gegooid.

Suspendeer de celpellet opnieuw in één tot twee milliliter medium en tel de cellen met een automatische teller. Zaad vervolgens 12.000 dermale fibroblasten of 20.000 keratinozyten in elke put van een acht-put kamer-slide in een eindvolume van 400 microliter. Na het zaaien schud je de kamer goed om de cellen gelijkmatig te verdelen en incubeer je de cellen ongeveer 24 uur bij 37 graden Celsius.

Controleer na de incubatie of de celconfluentie onder een microscoop ongeveer 80% is. Wanneer de culturen 80% confluentie bereiken, voeg je voorzichtig enkele druppels fixatieve oplossing toe, één direct in de kamerput om de cellen vooraf te fixeren. Incubeer de cellen vier minuten op kamertemperatuur, zodat het fixatiemiddel zich gelijkmatig verspreidt zonder de cellen te verstoren.

Daarna aspireer je het prefixatief uit de put en voeg je 140 microliter verse fixatieve oplossing één toe, zodat het putoppervlak volledig wordt bedekt. Broed de preparaat 15 minuten uit op 37 graden Celsius. Verwijder vervolgens het fixatiemiddel uit de kamerput en voeg 140 microliter 100 millimolair ammoniumchloride toe om restaldehyden te verzachten.

Incubeer de preparaat op kamertemperatuur gedurende 10 tot 30 minuten. Spoel de monsters drie keer af met PBS gedurende 30 seconden op kamertemperatuur. Pipetteer de buffer bij elke spoeling voorzichtig langs de kamerwand om te voorkomen dat cellen worden weggespoeld of tunneling-nanobuizen beschadigd raken.

Incubeer de cellen met 140 microliter van een 1:300 volume-tot-volume verdunning van tarwe kiem agglutinine Alexa meel conjugaat in PBS. Voer de incubatie in het donker uit bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om plasmamembraanglycoproteïnen te labelen voor visualisatie van membraan-afgeleide tunneling-nanobuisjes. Was de cellen daarna drie keer met PBS gedurende elk 30 seconden.

Daarna incubeer je de cellen met 140 microliter falloïdineconjugaat, één tot 250 keer verdund in 1% BSA, gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Na drie keer te hebben gewassen met PBS, incubeer je ze vijf minuten lang met 140 microliter DAPI-oplossing op kamertemperatuur in het donker. Voeg tenslotte twee tot drie druppels montagemedium toe aan elke put en laat het monster 20 minuten op kamertemperatuur incuberen.

Bewaar de preparaten minstens 20 minuten in het donker bij vier graden Celsius tot de beeldopname. In dermale fibroblastkweken werden tunnelende nanobuisjes waargenomen als lange, dunne projecties die aangrenzende cellen verbonden met membranen die gekleurd waren met tarwekiemen agglutinine en F-actine, gelabeld met falloïdine. In epidermale keratinocytenculturen werden tunnelende nanobuisjes met karakteristieke F-actine-positieve uitsteeksels ook waargenomen die naburige cellen brugden.

In co-culturen van dermale fibroblasten en epidermale keratinocellen werden tunnelende nanobuisjes consequent gedetecteerd tussen dermale fibroblasten en epidermale keratinocyten, zichtbaar met membraan- en cytokeratine 5-kleuring. De tunnelende nanobuizen in de co-culturen vertoonden diverse cytoskeletale organisatie, met voorbeelden die alleen F-actine bevatten, zowel de filamenten F-actine met gedeeltelijk alfatubuline, als met lage alfatubulineniveaus. De grootste uitdaging is het behouden van de tunnel in nanobuisjes.

Dit vereist een voorzichtige fixatie, juiste timing en het gebruik van vers bereide vaste toevoegingen. Met ons protocol kunnen de tunnelende nanobuizen worden gemeten onder wisselende celcondities om hun potentiële functies te onderzoeken. In de toekomst zullen we mitochondriën fluorescerend labelen om hun overdracht via tunnelende nanobuisjes te bestuderen.