Name: Single-kanaal elektrofysiologie met behulp van een geminiaturiseerd Montal-Mueller planair lipide bilaagsysteem voor het registreren van een synthetisch K2P-kanaal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Leer single-kanaal elektrofysiologie met een geminiaturiseerd planair lipide bilaagsysteem voor ionkanaalonderzoek. Deze methode reduceert reagentiaverbruik en vereenvoudigt experimenten met synthetische K2P-kanalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Sofia Diletta Guzzeloni voor de hulp bij de celtransfectieprocedure. Wij zijn dankbaar aan de medewerkers van Elements, Dr. Leon Juarez en Dr. Michelangelo Paci. Dit werk werd ondersteund door het Department of Molecular Medicine van de Universiteit van Pavia, Italië, onder het initiatief Dipartimenti di Eccellenza (2023–2027), door de Cariplo Foundation (#2019-1809) en door het PNRR Research Programme CN00000013 “National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing” aan M.L.

F.T. en A.P. zijn respectievelijk de CEO en een werknemer van Elements S.r.l. Alle andere auteurs verklaren geen concurrerende belangen te hebben.

In deze studie hebben we de PLB-techniek gebruikt om de elektrofysiologische eigenschappen van een synthetisch K2P-kanaal op single-molecule niveau te evalueren. Van de verschillende planaire lipidemodellen die in de wetenschappelijke literatuur worden beschreven, hebben we uns gericht op de vorming van BLM's, die over een opening met een diameter tussen 50 en 140 µm worden aangebracht, geboord in een verticaal apolair oppervlak dat twee waterige compartimenten scheidt. Deze configuratie maakt simulatie van de celmembraanomgeving mogelijk, terwijl er controle behouden blijft over experimentele parameters, waaronder de preparatie van het lipidemembraan en de elektrolytensamenstelling (bijv. ionsterkte en pH)3. We hebben BLM's gerecreëerd met behulp van de Montal–Mueller (vouwings)methode5, waarbij het membraan spontaan assembleert wanneer twee lipidemonolagen, die eerder zijn verspreid op de lucht-waterinterface van de twee waterige oplossingen, zich over de opening verenigen door het waterniveau te verhogen.
Het hier gepresenteerde protocol voor membraanvorming is zeer intuïtief; desalniemeer beïnvloeden verschillende kritieke stappen het experimentele succes sterk. Om een goede elektrische verbinding tussen de BLMchipMM en de versterker te garanderen, is het essentieel om chlorering van de Ag/AgCl-draaduiteinden die in de PCB-sockets worden geplaatst, te vermijden. Tijdens de assemblage van de BLMchipMM kan een onjuiste positionering van de draden leiden tot contact met de behuizing van de versterker, wat resulteert in kortsluitingen en signaalverzadiging. De procedure voor de voorbehandeling van de opening is een andere kritieke factor: overmatige kracht bij het aanbrengen van de voorbehandelingsoplossing kan het polyimide septum beschadigen, terwijl onjuist gebruik van de elektrolytoplossing — in het bijzonder het weken van het gebied rond de opening — de membraanvorming kan belemmeren. Bovendien is een zorgvuldige reiniging van de registratiekamer van de BLMchipMM essentieel voor de reproduceerbaarheid. Het gebruik van 100% isopropylalcohol, gevolgd door grondig spoelen en volledig drogen, zorgt ervoor dat residuen volgende experimenten niet verstoren.
Verschillende modificaties van het protocol zijn mogelijk. Hoewel chlorering door weken in bleekmiddel een praktische en veelgebruikte aanpak is, kunnen alternatieve methoden zoals galvaniseren ook worden toegepast43. Op dezelfde manier zijn variaties in de voorbehandeling en lipidepreparatie haalbaar. Standaard voorbehandelingsoplossingen bestaan doorgaans uit langketenalkanen opgelost in vluchtige koolwaterstofoplosmiddelen36; hoewel een 1% hexadecaanoloplossing in n-hexaan algemeen wordt gebruikt, kunnen andere oplosmiddelen geschikt zijn. De lipidensamenstelling kan ook worden aangepast afhankelijk van de experimentele vereisten. Hoewel DPhPC-lipiden een optimale membraanstabiliteit bieden, kunnen alternatieve lipidemengsels, inclusief natuurlijke of synthetische samenstellingen, worden gebruikt36. Een belangrijk voordeel van verticale lipide-dubbellagen gevormd via de vouwmethode is de mogelijkheid om asymmetrische membranen te genereren, waarbij elke laag uit verschillende lipidesoorten bestaat5,22, een kenmerk waarvan bekend is dat het de functie van membraaneiwitten beïnvloedt.
Het oplossen van problemen bij de membraanvorming omvat over het algemeen aanpassingen van de niveaus van de waterfase. Als de membraanvorming aanvankelijk niet plaatsvindt, kan het herhaaldelijk verlagen en verhogen van het bufferniveau in één compartiment de assemblage van de dubbellaag faciliteren. Indien dit niet succesvol is, kan het aanbrengen van een luchtbel over de opening de redistributie van lipiden en de membraanvorming bevorderen. Aanhoudende mislukking duidt doorgaans op problemen met betrekking tot de voorbehandeling of contaminatie, in welk geval het reinigen van de opnamekamer en het opnieuw starten van het experiment wordt aanbevolen.
De kerncomponenten van deze opstelling bestaan uit de eNPR 100 kHz compacte versterker en de BLMchipMM. De versterker is een compact, ruisarm voltage-clamp systeem dat de noodzaak voor extra externe apparatuur, waaronder externe Faraday-kooien, wegneemt, aangezien de behuizing van de versterker zelf effectieve elektromagnetische afscherming biedt. De BLMchipMM is een vooraf geassembleerde, geminiaturiseerde registratiekamer die is geïntegreerd met een printplaat (PCB) voor directe verbinding met de versterker. Deze bestaat uit twee C-vormige compartimenten die gescheiden worden door een polyimideseptum met een taps toelopende, lasergeboorde opening waar het kunstmatige membraan wordt gevormd. De gereduceerde afmetingen van het systeem, met compartimentvolumes van ongeveer 110 µL, verminderen het reagensverbruik aanzienlijk en verlagen de intrinsieke capaciteit, waardoor de signaalkwaliteit wordt verbeterd. Bovendien kan het apparaat meerdere malen worden hergebruikt zonder demontage mits de juiste reinigingsprocedures worden gevolgd, wat de variabiliteit vermindert en de experimentele reproduceerbaarheid verhoogt.
Ondanks deze voordelen moeten enkele beperkingen in overweging worden genomen. De huidige opstelling bevat geen geïntegreerde modules voor temperatuur-, druk- of perfusiecontrole. Er is gemeld dat intrinsieke membraanspanning mechanosensitieve kanalen zoals TREK1 beïnvloedt44,45,46; echter bevat de huidige opstelling geen gecontroleerde manipulatie van de membraanspanning, en er worden hier geen mechanistische conclusies getrokken. Over het algemeen biedt dit platform een robuust en toegankelijk systeem voor het registreren van ionkanaalactiviteit in kunstmatige membranen. In deze studie hebben we het synthetische K2P-kanaal ancTREK1 onderzocht, een computationeel afgeleid ancestraal kanaal van de TREK-subfamilie. De geregistreerde gegevens tonen aan dat gezuiverd ancTREK1, gereconstitueerd in PLB's, een single-channel gedrag vertoont dat consistent is met de gerapporteerde TREK1-achtige conductantie-eigenschappen. Onder Mg2+-vrije symmetrische 200 mM kaliumcondities vertoont het kanaal de meetbare I–V relatie, met amplitudewaarden van ongeveer 13 pA bij 80 mV en −19 pA bij −80 mV. Daarnaast vertoont ancTREK1 de karakteristieke modus van hoge conductantie die wordt waargenomen in TREK1-kanalen, met een hogere conductantie bij negatieve potentialen (~205,6 pS) vergeleken met positieve potentialen (~112,8 pS). Opvallend is dat ancTREK1 een verhoogde NPo vertoont bij positieve potentialen (0,78 bij 80 mV) en een verlaagde NPo bij negatieve potentialen (0,53 bij −80 mV en 0,28 bij −120 mV), wat verschilt van waarnemingen in excised patch-configuraties42. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van dit systeem voor proof-of-principle single-channel registratie van gereconstitueerde membraaneiwitten.

De reconstitutie van ionkanalen in kunstmatige lipide dubbellagen, ook wel bekend als black lipid membranes (BLMs), is een van de gevestigde technieken voor de elektrofysiologische karakterisering van ionkanalen op het niveau van individuele moleculen1. De voordelen van BLMs vloeien voort uit hun structuur. Een planaire lipide dubbellaag (PLB) wordt namelijk gecreëerd in een porie van een apolair oppervlak, waardoor twee vloeistofoplossingen van elkaar worden gescheiden. Door een biologisch membraan na te bootsen, maakt dit de registratie van ionkanaalactiviteit mogelijk onder strikt gecontroleerde omstandigheden, waaronder de lipidensamenstelling van het membraan en de concentraties van elektrolyten of chemische verbindingen, terwijl het membraan vanaf beide zijden toegankelijk blijft. Deze toegankelijkheid maakt het ook mogelijk om ionkanalen direct in te brengen, bijvoorbeeld vanuit een micellaire oplossing of via liposoom-gestuurde fusie2,3.
Het eerste beschreven kunstmatige membraansysteem werd gemaakt met behulp van de schildermethode4, waarbij een druppel lipiden opgelost in een niet-vluchtig organisch oplosmiddel met een penseel op een kleine opening wordt aangebracht. De toevoeging van een waterige oplossing aan beide zijden van de opening leidt vervolgens tot de spontane vorming van een lipide dubbellaag. Een aanzienlijk nadeel van deze methode is echter het behoud van sporen van het oplosmiddel, wat de eigenschappen van het membraan kan beïnvloeden. Om de hoeveelheid residu van organisch oplosmiddel binnen lipide dubbellagen te verminderen, is de vouwmethode5 ontwikkeld, waardoor de vorming van "oplosmiddelvrije" BLM's mogelijk werd. Bij deze benadering wordt een lipide-oplossing in een vluchtig oplosmiddel over het wateroppervlak verspreid om twee monolagen te vormen; door het niveau van de waterige fase boven de opening geleidelijk te verhogen, vouwen deze lipide monolagen zich over de opening om een dubbellaag te vormen. Hoewel de resulterende BLM als oplosmiddelvrij wordt gedefinieerd, vereist een succesvolle vorming van de dubbellaag echter een voorbehandeling van de opening met een dunne laag niet-vluchtig oplosmiddel. Het kernelement dat nodig is voor deze experimenten bestaat uit een registratiekamer met twee waterige compartimenten (meestal aangeduid als cis en trans), gescheiden door een lipofiel septum met een kleine opening (50–250 µm in diameter) (Figuur 1). Zilver/zilverchloride (Ag/AgCl) elektroden worden in elk compartiment geplaatst. Wanneer ze in de elektrolytoplossing worden ondergedompeld, stellen deze elektroden de elektrochemische verbinding tussen de lipide dubbellaag en het registratieapparaat vast. Dat laatste bestaat uit een voltage-clamp versterker, die een nauwkeurige controle van het transmembraanpotentiaal en een gelijktijdige meting van de ionenstromen die door ingebedde porievormende eiwitten passeren, mogelijk maakt.
<img alt="Diagram van ionkanaal in lipide dubbellaag; elektrofysiologische opstelling; analyse van gesloten/open kanaaltoestanden." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1: Schema van de elektrofysiologische opstelling voor planaire lipide dubbellaagen (PLB). Een schema van de essentiële componenten die nodig zijn voor PLB-experimenten. De meetkamer bestaat uit twee waterige compartimenten (cis en trans) gescheiden door een lipofiel septum met een opening waarin een lipide dubbellaag wordt gevormd. Zilver/zilverchloride (Ag/AgCl) elektroden zijn ondergedompeld in de elektrolytoplossing in elk compartiment. Eén elektrode brengt spanningsstimuli aan (bijv. sinus-, blok- of driehoeksgolven), terwijl de andere, die op massa is gehouden, is verbonden met een stroom-spanningsomvormer die ionenstroom omzet in een proportioneel spanningssignaal. Het signaal wordt versterkt, optioneel gefilterd, gedigitaliseerd en geregistreerd voor monitoring en analyse in realtime. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Er zijn ook andere methoden ontwikkeld om BLM's te vormen. Een veelvoorkomende aanpak bestaat uit het creëren van lipidedubbellagen die gesuspendeerd zijn op de punt van een patch-clamp pipette. Zo maakt de tip-dip methode6 de vorming mogelijk van een gesuspendeerde, oplosmiddelvrije lipidedubbellaag op de opening van een glazen micropipet met een diameter van ~4 µm door de punt herhaaldelijk door een lipidemonolaag aan het lucht-watergrensvlak te dppen, waarbij tijdens elke passage een enkele leaflet wordt gevangen. De patch-clamp techniek is ook gebruikt voor single-channel metingen in lipidedubbellagen. Bij de punch-out methode7 wordt bijvoorbeeld een glazen pipet met een diameter tussen 10 en 80 µm gebruikt om een groot membraan te patchen dat oorspronkelijk over een opening in een registratiekamer is aangebracht. Alternatief houdt de liposoom-patch methode in dat een vooraf gevormd nano- tot microschalig blaasje als oplosmiddelvrije BLM wordt gebruikt8,9. In het bijzonder zijn giant unilamellar vesicles op grote schaal gebruikt voor single-channel registraties via verschillende patch-clamp configuraties, waaronder cell-attached en excised patch modi10,11.
Er zijn ook verschillende platforms ontwikkeld voor de parallelle en geautomatiseerde vorming van meerdere dubbellagen. Een van deze benaderingen is de droplet interface bilayer (DIB)-techniek12, waarbij waterige druppels in een lipide-oplosmiddelmengsel worden geplaatst. Bij deze methode assembleren lipidemonolagen zich spontaan rond de druppels, en dubbellaagvorming vindt plaats wanneer twee druppels met elkaar in contact komen. In sommige opstellingen kunnen DIB's op hydrogelen worden gevormd om de membraanstabiliteit te verbeteren13. Een alternatieve benadering, gebaseerd op DIB-vorming aan de punt van een glaspipet, is de contact bubble bilayer (CBB)-methode14, waarbij waterige bellen met behulp van twee micropipetten in een oliefase worden geïntroduceerd. Net als bij de DIB-benadering vormt zich spontaan een lipidendubbellaag wanneer twee lipide-gecoate bellen met elkaar in contact worden gebracht. Een ander platform wordt vertegenwoordigd door arrayed BLM-systemen, die bestaan uit arrays van goed gedefinieerde micro- tot nanometrische poriën die in een rasterpatroon zijn gerangschikt. In deze systemen kunnen gesuspendeerde lipidendubbellaagen handmatig worden gevormd — met behulp van schilder- of vouwtechnieken, of via liposoomvesikelruptuur15,16,17 — of automatisch door sequentiële injectie van lipide- en bufferoplossingen wanneer ze gekoppeld zijn aan microfluïdische kanaalstructuren18,19.
Hoewel er veel methoden zijn ontwikkeld om oplosmiddelvrije BLM's te vormen, richten we ons in dit werk op de vouwmethode die is geïmplementeerd binnen een geminiaturiseerd en geïntegreerd platform om het enkelkanaalgedrag van membraaneiwitten ingebed in een kunstmatige lipide dubbellaag te onderzoeken. Experimenten werden uitgevoerd met de Elements-opstelling, die uit twee componenten bestaat: de Elements Nanopore Reader (eNPR-amplifier) en de BLMchipMM (Figuur 2A en Figuur 2B). De eerste is een compacte voltage-clamp amplifier met lage ruis die de werkruimte vereenvoudigt door een complete en onafhankelijke eenheid te vormen, waardoor extra externe apparaten overbodig zijn. De BLMchipMM is een vooraf geassembleerd en geminiaturiseerd systeem dat is ontworpen voor de Montal–Mueller-techniek en dient als experimentele interface. Het bestaat uit een transparante polymethylmethacrylaat (PMMA) registratiekamer geïntegreerd met een printplaat (PCB), die twee sockets bevat die zijn ontworpen voor Ag/AgCl-draden die dienen als elektroden voor directe aansluiting op de amplifier. De kernstructuur van de kamer bestaat uit een polyimide septum dat is verzegeld tussen twee transparante PMMA-componenten. Het septum is 50 µm dik, behalve in een klein centraal gebied (3,78 mm2), waar de dikte is verminderd tot 25 µm om de vorming van de dubbellaag te vergemakkelijken. In het centrum van dit dunnere gebied is via laserboren een taps toelopende opening gemaakt, wat de mechanische stabiliteit van de lipide dubbellaag verbetert20,21. Er zijn vier openingsdiameters beschikbaar (50, 75, 100 en 140 µm), waardoor de membraancapaciteit kan worden afgestemd (Tabel 1). Elk PMMA-component is voorzien van een C-vormige holte met een volume van 110 µL, die twee vloeistofcompartimenten aan weerszijden van het polyimide septum vormt om de elektrolytoplossing vast te houden. In elk PMMA-blok zijn aan tegenovergestelde zijden twee schuine vloeistofkanalen geboord: één kanaal wordt gebruikt om de Ag/AgCl-elektrode in te brengen, terwijl het andere kanaal handmatige aanpassing van het bufferniveau in het reservoir via pipetteren mogelijk maakt.
<img alt="Microfluïdisch apparaat met modulair compartiment; schema toont PMMA-zijde, elektroden, PCB voor analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figuur 2"> 
Figuur 2: Integrated Elements Nanopore Reader en BLMchipMM-systeem. (A) Foto waarop de BLMchipMM is ingevoegd in de speciale sleuf van de Elements Nanopore Reader (eNPR) versterker. (B) Schematische weergave van de BLMchipMM-componenten, inclusief de registratiekamer van polymethylmethacrylaat (PMMA), het polyimideseptum met de opening op microschaal, en de printplaat (PCB) met sockets voor Ag/AgCl-elektroden en een sleuf voor de uitlijning van de kamer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gatdiameter (µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gatdikte (µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typische membraancapaciteit (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Kenmerken van beschikbare BLMchipMM-apertuurformaten. Gatdiameter, septumdikte bij de apertuurregio en typische waarden voor membraancapaciteit voor BLMchipMM-apparaten met aperturen van 50, 75, 100 en 140 µm. De waarden voor membraancapaciteit worden getoond voor dubbellagen gevormd uit 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine lipiden.
Meestal zijn opnamekamers die in laboratoria worden gebruikt ofwel zelfgebouwde eenheden of commercieel verkrijgbare apparaten. In het eerste geval omvat de constructie van het systeem het assembleren van diverse componenten en het ontwikkelen van een betrouwbare methode om de opening in het septum te maken, wat de toegankelijkheid voor veel laboratoria kan beperken. Zelfs bij het gebruik van commerciële apparaten is vaak handmatige integratie van meerdere componenten vereist voorafgaand aan elk experiment. In tegenstelling hiermee is de BLMchipMM voorgemonteerd en is demontage tussen experimenten niet nodig voor routinematige reinigingsprocedures. Dezelfde eenheid kan worden gewassen en voor meerdere experimenten worden hergebruikt zonder de kwaliteit van de membraanvorming aan te tasten, mits de gebruikte oplosmiddelen compatibel zijn met de materialen van het apparaat. Dit vermindert de gebruikersafhankelijke variabiliteit en minimaliseert het risico op lekkages geassocieerd met handmatige afdichtingselementen. Het gebruik van externe, vervangbare en renoveerbare zilverdraadelektroden verlengt bovendien de bruikbare levensduur van het systeem, vooral onder experimentele omstandigheden die het verbruik van elektroden versnellen.
Bovendien hebben zelfgemaakte apparaten vaak grote compartimentvolumes, waardoor de hoeveelheid biologische en chemische componenten die voor experimenten nodig zijn, toeneemt. In tegenstelling hiermee maakt de miniaturisering van de BLMchipMM het mogelijk om experimentele volumes te minimaliseren, waardoor het verbruik van reagentia, eiwitten en andere verbindingen aanzienlijk wordt verminderd. Dit is bijzonder voordelig bij het werken met membraaneiwitten die moeilijk tot expressie komen of een lage opbrengst hebben, of wanneer de hoge kosten voor de synthese van testverbindingen de totale kosten van de experimenten verhogen. Belangrijk is dat de BLMchipMM de vorming van oplosmiddel-geminimaliseerde dubbellagen mogelijk maakt en asymmetrische membraanconfiguraties ondersteunt, waarbij elke leaflet kan bestaan uit verschillende lipidensoorten5,22, wat de studie van membraaneiwitfuncties onder gecontroleerde omstandigheden vergemakkelijkt.
Traditioneel worden stroommetingen uitgevoerd met versterkers die zijn ontworpen voor patch-clamp experimenten, waarbij vaak verbinding met een aparte digitalizer nodig is voor gegevensverwerving en aansturing via grafische interfaces. Deze systemen zijn niet alleen volumineus en duur, maar houden vaak ook niet-intuïtieve configuratieprocedures in voor niet-experts. Daarnaast is, vanwege de omvang van de opnamekamer en het ontwerp van standaardversterkers — die doorgaans geen ingebouwde afscherming hebben om de headstage-ingang tegen elektrostatische interferentie te beschermen — het gebruik van een externe kooi van Faraday vaak noodzakelijk. De kwaliteit en aarding van een dergelijke kooi kunnen de ruisprestaties van het systeem aanzienlijk beïnvloeden. De BLMchipMM, wanneer gebruikt met een compacte geïntegreerde versterker, vereenvoudigt deze configuratie door de behoefte aan externe componenten te verminderen. Signaaldigitalisering vindt plaats binnen het apparaat, en de behuizing van het systeem biedt afscherming die de gevoeligheid voor omgevingsmatige elektromagnetische interferentie verlaagt.
Om de toepasbaarheid van dit platform aan te tonen, werd het K2P-achtig kanaal ancTREK1, een computationeel afgeleid ancestraal lid van de TREK-subfamilie (Aanvullende figuur 1), gebruikt als testeiwit om een succesvolle reconstitutie en single-channel registratie te valideren. K2P-kanalen vormen dimere kaliumlekkagekanalen die het rustmembraanpotentiaal en de cellulaire exciteerbaarheid reguleren, waarbij TREK-kanalen een goed gekarakteriseerde subfamilie vertegenwoordigen.

<table><tbody><tr><td>1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>Vorming van kunstmatige lipide dubbellagen</td></tr><tr><td>2-propanol (&amp;ge;99.5%)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>Reinigen van BLMchipMM-apparaat</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>Bereiding van agarosegels</td></tr><tr><td>Horizontaal agarosegelelektroforesesysteem</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>Scheiding van DNA-fragmenten</td></tr><tr><td>Ampicilline</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>Selectie van getransformeerde bacteriën</td></tr><tr><td>Anti-GFP nanobody Sepharose-hars (zelfgemaakt)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Affiniteitszuivering van GFP-getagde eiwitten</td></tr><tr><td>Anza Alkalische Fosfatase</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>Vector-defosforylering</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>Restrictiedigestie</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>Restrictie-digestie</td></tr><tr><td>Anza Rode Buffer (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>Restrictie-digestiebuffer</td></tr><tr><td>Aprotinine protease-remmer</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>Preventie van proteïnedegradatie</td></tr><tr><td>Benchtopcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>Celpelletvorming en monstervoorbereiding</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Vorming van planaire lipide dubbellagen</td></tr><tr><td>Cholesterylhemisuccinaat (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>Stabilisatie van membraaneiwitten</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>Eiwitkleuring</td></tr><tr><td>Gewone huishoudbleek</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Chlorering van Ag-draden</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>Reductie van de viscositeit van het lysaat</td></tr><tr><td>Dubbel gedestilleerd water</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Bereiding van buffers en oplossingen</td></tr><tr><td>Ethanol (zuiver, 99,9%)</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Reiniging van Ag/AgCl-draden</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>DNA-kleuring</td></tr><tr><td>Zeer fijn schuurpapier</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Verwijdering van de Ag/AgCl-coating van draden</td></tr><tr><td>eNPR 100 kHz versterker</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elektrofysiologische registraties</td></tr><tr><td>Gel-Out kit voor DNA-extractie uit agarose</td><td>A&amp;amp;Biotechnologie</td><td>023-250</td><td>DNA-zuivering</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNA-ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA-grootte referentie</td></tr><tr><td>Vrije stijl&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>Expressie van het ancTREK1-eiwit</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99.5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>Bufferingsmiddel</td></tr><tr><td>Hexadecaan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>Voorbehandeling van de apertuur</td></tr><tr><td>Hexaan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>Lipide-oplosmiddel</td></tr><tr><td>Zelfgemaakt 5&amp;times; DNA-laadkleurstof</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Voorbereiding van DNA-monsters</td></tr><tr><td>Zelfgemaakt 6&amp;times; Laemmli SDS-buffer (reducerend)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Voorbereiding van eiwitmonsters</td></tr><tr><td>Zelfgemaakte ontkleurolossing</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Ontkleuren van SDS-PAGE-gels</td></tr><tr><td>Zelfgemaakte HRV-3C protease</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Splitsing van fusie-eiwitten</td></tr><tr><td>Zelfgemaakte SDS-PAGE-runbuffer (10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>SDS-PAGE-elektroforesebuffer</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>Elutie van His-getagde eiwitten</td></tr><tr><td>In-batch zuiveringskolommen</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Workflows voor eiwitzuivering</td></tr><tr><td>Innova44 schudincubator</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>Celcultuurgroei</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>Bereiding van elektrolyt en buffer</td></tr><tr><td>LB-bouillon (Lennox)</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>Bacteriële kweek</td></tr><tr><td>Leupeptine protease-remmer</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>Voorkomen van proteïnedegradatie</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride-hexahydraat</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>Buffercomponent</td></tr><tr><td>Nanodrop-spectrofotometer</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>DNA- en proteïnekwantificering</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-&amp;beta;-D-maltoside (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>Solubilisatie van membraaneiwitten</td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance Resin</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>IMAC-zuivering</td></tr><tr><td>Notebook (computer)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Instrumentbeheersing en gegevensverwerving</td></tr><tr><td>Optima LE-80K ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>Isolatie van membraanfracties</td></tr><tr><td>Pentaan (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>Lipidoplosmiddel</td></tr><tr><td>Pepstatin A-proteaseremmer</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>Preventie van proteïnedegradatie</td></tr><tr><td>Phusion GC Buffer (5x)&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>PCR-buffer</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA-polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>PMSF-proteaseremmer</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>Eiwitbescherming tijdens lysis</td></tr><tr><td>Polyethylenimine (PEI)</td><td>Klinische wetenschappen</td><td>24765-100</td><td>Transfectiereagens</td></tr><tr><td>ProteinEle gegoten Tris-Glycine gel (4&amp;ndash;20%)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>Eiwitscheiding</td></tr><tr><td>SDS-PAGE-gelelektroforesesysteem</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>Proteïne-elektroforese</td></tr><tr><td>Natriumbutyraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>Versterker van eiwitexpressie</td></tr><tr><td>T4 DNA-ligase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>DNA-ligatie</td></tr><tr><td>T4 DNA-ligasebuffer (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>Ligatiebuffer</td></tr><tr><td>Thermocycler (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>PCR-amplificatie</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>Bufferbereiding</td></tr><tr><td>Tryptone-soja-agar met lecithine en polysorbaat 80</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>Bacteriële uitplating</td></tr><tr><td>Twee Ag-draden</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Elektroden voor elektrofysiologie</td></tr><tr><td>Ultra-spin concentrator (50 kDa cutoff)</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>Proteïneconcentratie</td></tr><tr><td>pEG BacMam-expressievector</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>Proteïne-expressie</td></tr><tr><td>USB-kabel</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Verbinding tussen versterker en computer</td></tr></tbody></table>

single-kanaal elektrofysiologie met behulp van een geminiaturiseerd montal-mueller planair lipide bilaagsysteem voor het registreren van een synthetisch k2p-kanaal

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

De functionele reconstitutie van ionkanalen in planaire lipide dubbellagen biedt een strategie om kanaalactiviteit op single-molecule niveau te onderzoeken. Conventionele Montal–Mueller dubbellaagsystemen vereisen echter doorgaans omvangrijke experimentele opstellingen, handmatige assemblage van de kamer en relatief grote opnamevolumes, wat het verbruik van reagentia verhoogt en extra bronnen van elektrische ruis kan introduceren als gevolg van uitgebreide bedrading en externe headstages. Hier presenteren wij een geminiaturiseerd, gebruiksklaar dubbellaagplatform (BLMchipMM) geïntegreerd met een compacte versterker, waarmee stabiele single-channel opnames mogelijk zijn met een verminderd verbruik van reagentia en een vereenvoudigde bediening. Dit protocol beschrijft het gebruik van dit systeem voor het uitvoeren van single-channel elektrofysiologische metingen. Met behulp van dit systeem hebben wij een synthetisch K2P-kanaal (ancTREK1) gereconstitueerd en dit gebruikt als proof-of-principle testeiwit om de reconstitutie en single-channel opname te valideren. Single-channel opnames tonen een stroom-spanningsrelatie in Mg2+-vrije symmetrische K+-oplossingen, met conductantie-waarden die consistent zijn met die gerapporteerd voor TREK1-kanalen. De succesvolle reconstitutie van dit K2P-achtig kanaal demonstreert het nut van dit systeem voor single-channel analyse in kunstmatige membranen.

Stroom-spanningskarakteristieken (I–V) van PLB-membranen
De intrinsieke hydrofobe aard van dubbellaags membranen maakt ze impermeabel voor geladen soorten. De toepassing van een extern elektrisch veld kan echter de vorming van tijdelijke poriën van nanometergrootte induceren, waardoor de permeabiliteit en conductantie van het membraan worden beïnvloed33. Om de kwaliteit van kunstmatige dubbellagen gevormd uit 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine lipiden te beoordelen, werden de membraancapaciteit, weerstand en I–V-karakteristieken geëvalueerd in afwezigheid van ingebouwde eiwitten. Er werd een reeks spanningsstappen toegepast variërend van ±20 tot ±200 mV (in stappen van ±20 mV), waarbij de resulterende transmembraanstromen werden geregistreerd. Gegevens werden gesampled op 5 kHz en laagdoorlaatgefilterd op 2,5 kHz.
Membraancapaciteit (Cm) en membraanweerstand (Rm) zijn sleutelparameters voor het evalueren van de kwaliteit van de dubbellaag. De PLB kan worden beschreven door een equivalent resistor–condensator (RC) circuit, waarin het membraan zich gedraagt als een condensator parallel aan een weerstand34. De capacitieve component weerspiegelt het vermogen van het membraan om lading op te slaan, terwijl de resistieve component de ionpermeabiliteit weerspiegelt. De toepassing van een driehoekige spanningsgolfvorm genereert een vierkante capacitieve stroomrespons, die proportioneel is aan de membraancapaciteit volgens:
<img alt="Capacitieve stroomformule I_c=C_m(dv/dt) vergelijking, ter illustratie van de elektrische schakelingsanalyse." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Vergelijking 1">    (1)
Hier is Cm de membraancapaciteit, V de aangelegde spanning en t de tijd. Na de membraanvorming kunnen de capaciteitswaarden in de loop van de tijd toenemen als gevolg van de progressieve verdunning van de dubbellaag35. Beschouwd wordt het membraan als een parallelplaatcondensator, waarbij de capaciteit gerelateerd is aan het membraanoppervlak en de dikte volgens:
<img alt="Capaciteitsformule met lipiden, vergelijking, educatief diagram, diëlektrische constante." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Vergelijking 2">    (2)
Hier is εlipids de diëlektrische constante van de lipidekern (~2), ε0 de permittiviteit van het vacuüm, A het membraanoppervlak en d de membraandikte36,37.
De membraanweerstand werd bepaald met behulp van de wet van Ohm33:
<img alt="Elektromotieve kracht vergelijking Ir=V/Rm formule, educatief diagram voor elektrische weerstand." src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Vergelijking 3">    (3)
Hierbij is V de aangelegde spanning en Rm de membraanweerstand. In afwezigheid van ionkanalen blijft de membraanstroom nabij 0 pA, wat overeenkomt met weerstandswaarden in het giga-ohm (GΩ) bereik33.
De I–V-relatie vertoonde een lineair (ohms) gedrag tussen 0 en ±200 mV voor BLMchipMM-apparaten met een apertuur van 75 en 100 µm. Lineaire fitting van de gegevens leverde membraanweerstandswaarden op van 847 ± 16 GΩ (n = 6) voor de apertuur van 75 µm (Figuur 8A, cirkels) en 980 ± 32 GΩ (n = 7) voor de apertuur van 100 µm (Figuur 8A, vierkanten). De RMS-ruiswaarden, gemeten over segmenten van 3 s van de stroomcurve, waren 3,1 ± 2 pA (n = 7) voor de apertuur van 100 µm en 2,6 ± 0,1 pA (n = 6) voor de apertuur van 75 µm. De membraanstabiliteit werd beoordeeld door de weerstand te meten met intervallen van ongeveer 2 min over een totale duur van 1 h (Figuur 8B). Goed gevormde membranen bleven consistent stabiel gedurende meer dan 1 h, wat voldoende is voor de meeste elektrofysiologische experimenten. Membranen tolereerden doorgaans aangelegde potentialen tot ±200 mV zonder tekenen van instabiliteit, terwijl breakdown optrad tussen ±220 en ±300 mV, afhankelijk van de individuele dubbellaag. Membranen werden als geschikt beschouwd voor eiwitinsertie wanneer de capaciteitswaarden varieerden van 40 tot 60 pF voor aperturen van 75 µm en van 60 tot 90 pF voor aperturen van 100 µm, met stroomwaarden van ≤0,5 pA bij 100 mV.
<img alt="Spannings-stroom- en weerstands-tijdgrafieken, studie naar dubbellaags membraanchip, resultaten van data-analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figuur 8"> 
Figuur 8: Elektrische karakterisering van PLB's. (A) Stroom-spanningsrelaties (I–V) van dubbellagen gevormd op openingen van 75 µm en 100 µm, die een lineair (ohms) gedrag vertonen tussen ±200 mV. Lineaire regressie levert membraanweerstandswaarden op van respectievelijk 847 ± 16 GΩ (n = 6) en 980 ± 32 GΩ (n = 7). (B) Membraanstabiliteit beoordeeld door de weerstand gedurende 1 h te monitoren met intervallen van 2 min. Membranen blijven stabiel tot ±200 mV en scheuren bij spanningen tussen ±220 en ±300 mV. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Initiële karakterisering van het single-channel gedrag van ancTREK1
Synthetisch ancTREK1 werd gezuiverd en gereconstitueerd in PLB's, waarna de single-channel activiteit werd gemonitord met voltage-stap-protocollen variërend van −120 tot 120 mV in stappen van 20 mV. Single-channel opnames (Figuur 9A en Figuur 9B) toonden het karakteristieke flikkergedrag van K2P-kanalen38. Bij 80 mV was de gemiddelde stroomamplitude 13,02 ± 0,78 pA (n = 5), terwijl bij −80 mV de stroomamplitude toenam tot −18,72 ± 0,25 pA (n = 5) (Figuur 9C). De resulterende I–V-relatie vertoonde meetbare single-channel stromen bij zowel positieve als negatieve potentialen onder Mg2+-vrije symmetrische 200 mM kaliumcondities (Figuur 9D). Omdat stroomamplituden werden geschat op basis van all-point histogrammen van opnames verkregen bij 5 kHz en laagdoorlaatgefilterd op 2,5 kHz, wordt deze I–V-relatie gepresenteerd als een beschrijvend bewijs van het principe in plaats van als een uitputtende biofysische karakterisering.
<img alt="Analyse van ionkanaalactiviteit; grafiek van stroomsporen en amplitudehistogrammen bij +80mV, -80mV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figuur 9"> 
Figuur 9: Single-channel activiteit van synthetisch ancTREK1. (A en B) Representatieve single-channel stroomsporen geregistreerd bij respectievelijk 80 mV en −80 mV. Stippellijnen geven het niveau van het gesloten kanaal aan. (C) All-point amplitudehistogrammen voor positieve (links) en negatieve (rechts) potentialen. (D) I–V-relatie van ancTREK1 onder symmetrische 200 mM kalium (K+) condities zonder tweewaardige kationen. De curve is gefit met een vierde-orde polynoom, en conductantie-waarden zijn afgeleid van de helling bij ±80 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Hoewel ancTREK1 uitgebreidere N- en C-terminale regio's mist in vergelijking met mammalia TREK1-kanalen, bleef het functioneel actief na reconstitutie. In tegenstelling tot mammalia TREK1, dat hoge- en lage-geleidingsmodi vertoont ( respectievelijk 132 ± 5 pS en 41 ± 5 pS bij positieve potentialen)39, vertoonde ancTREK1 enkel de modus met een grote geleiding. De enkelkanaalgeleiding bij positieve potentialen was 112,8 ± 10,8 pS (80 mV, n = 5), wat consistent is met gerapporteerde waarden voor TREK-kanalen (85–130 pS onder symmetrische kaliumcondities)38,39,40,41. Bij negatieve potentialen nam de geleiding toe tot 205,6 ± 2,05 pS (−80 mV, n = 5), in overeenstemming met eerder gerapporteerd TREK1-gedrag39. Opvallend is dat ancTREK1 een hogere genormaliseerde openkans (NPo) vertoonde vergeleken met TREK1-metingen verkregen met excised patch-configuraties42. De NPo–spanningsrelatie toonde een verhoogde kanaalactiviteit bij positieve potentialen, met een waarde van 0,78 ± 0,02 (n = 5) bij 80 mV. In contrast hiermee nam de NPo af bij negatieve potentialen, met waarden van 0,53 ± 0,04 bij −80 mV en 0,28 ± 0,03 bij −120 mV (Figuur 10).
<img alt="Resultaten van ionkanaal elektrofysiologie, grafiek van NPo tegenover voltage (mV), staafdiagramvergelijking, data-analyse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figuur 10"> 
Figuur 10: Analyse van de spanningsafhankelijkheid van de single-channel activiteit van ancTREK1. Genormaliseerde openkans (NPo) als functie van het membraanpotentiaal (links) en vergelijking van NPo bij 80 mV en −80 mV (rechts), die een toename van de kanaalopening bij positieve potentialen laat zien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende Figuur 1. Aminozuursequentie van het synthetische ancestrale tweeporie-domein kalium- (K2P) kanaal (ancTREK1). De volledige aminozuursequentie van ancTREK1 die is gebruikt voor elektrofysiologische metingen. De sequentie is gereconstrueerd via ancestrale sequentie-inferentie op basis van een gecureerde dataset van TREK/TRAAK-familieleden, inclusief orthologe sequenties verzameld uit UniProt- en NCBI-databases, gefilterd op geconserveerde porie-motieven, uitgelijnd en geanalyseerd met behulp van maximum-likelihood fylogenetica.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft het gebruik van een geminiaturiseerd Montal–Mueller planair lipide dubbellaagsysteem met geïntegreerde amplificatie voor het uitvoeren van stabiele single-channel opnames. De methode wordt gedemonstreerd door het reconstitueren van een gezuiverd synthetisch K2P-kanaal om de prestaties van het systeem te valideren.

Single-kanaal elektrofysiologie met behulp van een geminiaturiseerd Montal-Mueller planair lipide bilaagsysteem voor het registreren van een synthetisch K2P-kanaal

De functionele reconstitutie van ionkanalen in planaire lipide dubbellagen biedt een strategie om kanaalactiviteit op single-molecule-niveau te onderzoeken. ...

Ons onderzoek richt zich op het begrijpen van de werking van ionkanalen en transporters middels geïntegreerde structurele biologie en elektrofysiologische technieken. Conventionele bilayer-opstellingen vereisen complexe instrumentatie en handmatige assemblage, terwijl dit een geminiaturiseerd, gebruiksklaar platform is waarin een compacte versterker is geïntegreerd.Begin met het voorbereiden van de elektrofysiologische opstelling door de instrumentkalibratie uit te voeren en de zilver- of zilverchloride-elektroden klaar te maken. Steek de niet-gechloreerde uiteinden van de twee zilverdraden in de sockets van de printplaat of PCB. Plaats de gechloreerde uiteinden van de draden in de vloeistofkanalen die zijn geboord in het polymethylmethacrylaat- of PMMA-component. Draai de black lipid membrane chip of BLMchipMM voorzichtig en monteer deze op de PCB door de onderste tand van de PMMA-registratiekamer in de daarvoor bestemde gleuf te passen. Controleer of de draad het uiteinde van de vloeistofkanalen bereikt. Bereid 100 µL van een 1% volume per volume hexadecaanoplossing in 100% n-hexaan voor de voorbehandeling van de septumopening. Resuspendeer 1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocho

single-channel-electrophysiology-using-miniaturized-montalmueller

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze video toont het proces van het whole-cell voltage clamp opnamen in de retinale deel van de in het water levende tijger salamander. Tonen we de voorbereiding van het stuk, alsook hoe de patch clamp opnames uit te voeren tijdens visuele stimulatie van het netvlies.

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

Membraaneiwit functie wordt geregeld door de celmembraan lipide samenstelling. Deze video-artikel wordt beschreven hoe u een patch met bilaag pleister elektroden, evenals het gebruik van gramicidine kanalen als verslaggevers van veranderde membraan eigenschappen te vormen.

Single Molecule methoden voor monitoring van veranderingen in bilaag elastische eigenschappen

Planar lipidendubbellagen, ook wel kunstmatige lipidendubbellagen, kunt u om te studeren ionengeleidende kanalen in een goed gedefinieerde omgeving. Hier tonen we de individuele stappen die nodig zijn om de bilaag kamer voor te bereiden, de elektroden en hoe om te testen dat de bilaag is geschikt voor single-channel metingen.

Voorbereiding van de Kunstmatige dubbellagen voor Elektrofysiologie Experimenten

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

Kv dysfunctie wordt geassocieerd met hartritmestoornissen. Om de moleculaire mechanismen die leiden tot dergelijke aritmieën we een systematische protocol gebruiken voor isolatie van atriale en ventriculaire hartspiercellen uit Kv kanaal bijkomende subunit knockout muizen. Geïsoleerde cardiomyocyten kan vervolgens direct worden gebruikt voor cellulaire elektrofysiologische studies, biochemische of immunofluorescentie (IF) testen.

Isolatie en Kv Channel Opnamen in Murine atriale en ventriculaire cardiomyocyten

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Het opnemen van Ca2+ stromen op het presynaptische afgiftevlak van het membraan is essentieel voor een nauwkeurig begrip van Ca2+-intrede en neurotransmitterafgifte. We presenteren een acute dissociatie van het rugsmerg van de kaakhaai die functionele geïsoleerde reticulospinale axonen oplevert, waardoor opname direct vanaf het afgiftevlak van het membraan van individuele presynaptische terminalen mogelijk is.

Acute Dissociatie van Lamprey Reticulospinal Axonen naar Opnemen inschakelen van de Release Gezicht Membraan van individuele functionele Presynaptische Terminals

Gesloten-lus protocollen worden steeds gebruikelijker in de moderne elektrofysiologie. We presenteren een eenvoudige, veelzijdige en goedkope manier om complexe elektrofysiologische protocollen uit te voeren in corticale piramidale neuronen in vitro, met behulp van een desktopcomputer en een digitale acquisitiekaart.

Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Kalium ionen bijdragen tot de rustpotentiaal membraan van cellen en extracellulaire K+ concentratie is een cruciale regulator van cellulaire prikkelbaarheid. We beschrijven hoe te maken, te kalibreren en te gebruiken monopolaire K+-selectieve microelectrodes. Deze elektroden, kunt de meting van elektrisch evoked K+ concentratie dynamiek in volwassen hippocampal plakjes.

Maken, testen en het gebruik van kalium-Ion selectieve Microelectrodes in weefsel plakjes van volwassen hersenen

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Leer single-kanaal elektrofysiologie met een geminiaturiseerd planair lipide bilaagsysteem voor ionkanaalonderzoek. Deze methode reduceert reagentiaverbruik en vereenvoudigt experimenten met synthetische K2P-kanalen.

Single-kanaal elektrofysiologie met behulp van een geminiaturiseerd Montal-Mueller planair lipide bilaagsysteem voor het registreren van een synthetisch K2P-kanaal (Video) | JoVE Journal

Single-kanaal elektrofysiologie met behulp van een geminiaturiseerd Montal-Mueller planair lipide bilaagsysteem voor het registreren van een synthetisch K_2P-kanaal

Meer video's verkennen