Ontwikkeling van mesenchymale stamcelmembraan-omhulde nanovesikels voor verbeterde genlevering

In dit protocol introduceren we een methode om mesenchymale stamcel-afgeleide nanovesikels te bereiden, die lijken op extracellulaire blaasjes en AV's inkapselen voor verbeterde genlevering. We noemen dit AAV-bevattende nanovesikels CME-AAV's. In vergelijking met de opkomende genafleveringsvector EV-AAAV bieden CME-AAV's meer flexibiliteit in celbronnen en een hogere opbrengst.

Om te beginnen verwijder je het kweekmedium uit een kweekschaal met menselijke mesenchymale stamcellen bij 70 tot 90% confluentie. Met een celschraper wordt de cellen losgemaakt van de kweekschaal en overgebracht in een conische buis met PBS. Centrifugeer de verzamelde cellen op 300g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om de cellen te pelleten.

Was daarna de celpellet twee keer met PBS en centrifugeer opnieuw. Susstend de eindcelpellet opnieuw in PBS, aangevuld met een proteaseremmer-cocktail. Vervolgens ondergaat u de celsuspensie aan drie vries-ontdooicycli om het plasmamembraan te verstoren en een grof lysaat te genereren.

Homogeniseer het lysaat grondig met een pipet. Centrifugeer vervolgens op 1.000g gedurende 20 minuten op vier graden Celsius om cellulair afval te verwijderen. Breng het supernatant over naar een nieuwe buis.

Centrifugeer op 18.000g gedurende een uur bij vier graden Celsius om de membraanfractie te pelleten. Verwijder het supernatant en suspendeer het membraanpelletje opnieuw in PBS om de ruwe mesenchymale stamcelmembraanfractie te verkrijgen. Homogeniseer nu de membraansuspension door deze achtereenvolgens door spuiten te laten lopen die zijn uitgerust met naalden van 20 tot 27 gauge.

Bepaal de eiwitconcentratie van de gehomogeniseerde membraansuspension met behulp van een bicinchoninezuurassay. Zet de ophanging in en bewaar bij min 80 graden Celsius totdat het nodig is. Homogeniseer de ophanging opnieuw met een 27 gauge spuit na elke dooicyclus.

Meng de voorbereide membraansuspension met adeno-geassocieerd virus, of AAV's, in een verhouding van 150 microgram eiwit per één keer 10 tot de macht van 10 genoomkopieën. Broed het mengsel 30 minuten uit bij 37 graden Celsius met voorzichtig schudden. Laad het membraan- en virusmengsel in een mini-extruder die is uitgerust met een polycarbonaatmembraan van 400 nanometer.

Laat het mengsel 20 keer door de extruder gaan om de inkapseling te bevorderen. Vervang het 400 nanometer membraan door een membraan van 200 nanometer en herhaal de extrusie. Verzamel de processuspension die het ingekapselde virus bevat, samen met het niet-ingekapselde virus en lege blaasjes.

Verzamel indien nodig meerdere batches en ga direct door met zuivering. Verdun de standaard iodixanoloplossing met 10x PBS en steriel gedeïoniseerd water om 40- en 25%-oplossingen te bereiden. Voeg met een pipet één milliliter 40%iodixanol toe aan de onderkant van een 13,2 milliliter open-boven, dunnewandige ultraheldere buis.

Vervolgens legt je drie milliliter 25% jodixanol boven de 40%-laag om een discontinue gradiënt te vormen. Leg voorzichtig zeven milliliter van de bewerkte suspensie bovenop de loop. Balanceer de buizen en laad ze in een schandbare emmer ultracentrifugerotor.

Centrifugeer op 150.000g gedurende drie uur bij vier graden Celsius, met snelle acceleratie en langzame vertraging. Verwijder vervolgens voorzichtig de buizen zonder de gradiënt te verstoren. Verzamel één milliliter fracties van boven tot onder in gelabelde 1,5 milliliter microcentrifugebuizen.

Houd alle fracties op ijs. Identificeer en voeg nu fracties zeven en acht met gezuiverde CME-AAV's samen in een nieuwe open ultracentrifugebuis. Beperk het volume tot 11 milliliter met PBS.

Meng daarna voorzichtig met een pipet van één milliliter. Met snelle versnelling en vertraging centrifugeer je de opgehoopte fracties op 150.000g gedurende drie uur bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant voorzichtig weg.

Susseer de pellet opnieuw in 50 tot 200 microliter steriele PBS, afhankelijk van de gewenste concentratie. Aliquot de gezuiverde preparat. Bewaar daarna bij 80 graden Celsius tot verder gebruik.

Bereid werkende oplossingen voor van ingekapseld virus en bestrijd virus in steriele PBS. Voeg gelijke genoomkopieën van het ingekapselde virus of controlevirus direct toe aan het kweekmedium in elke put. Neem negatieve controleputten op met een gelijk volume PBS of lege virusdeeltjes.

Draai de plaat voorzichtig om een gelijkmatige verspreiding te garanderen en incubeer 24 tot 72 uur, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Aspireer vervolgens voorzichtig het kweekmedium. Was de cellen twee keer met PBS zonder ze los te maken.

Kleurkernen met Hoechst 33342 volgens de instructies van de fabrikant. Voer fluorescentiebeeldvorming uit van levende cellen met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop met geschikte filtersets voor verbeterd groen fluorescerende eiwit en Hoechst. Selecteer 10x of 20x objectieven voor kwantificatie en 63x objectieven voor hoge-resolutie beeldvorming, indien nodig.

Neem minstens vijf gezichtsvelden per put op, met identieke beeldparameters. Bewaar alle afbeeldingen in raw- en grijswaardenformaten voor kwantitatieve analyse. Transmissie-elektronenmicroscopie toonde aan dat CME-AAV's grootteafmetingen en membraangebonden structuren vertoonden die vergelijkbaar waren met extracellulaire blaasjes.

De mesenchymale stamcelmembraanmarkers, CD73 en CD90, werden in CME-AAV gedetecteerd door Western blot-analyse. De drie belangrijkste adeno-geassocieerde viruscapside-eiwitten, VP1, VP2 en VP3, werden geïdentificeerd in CME-AAV door SDS-PAGE. NanoSight-analyse toonde aan dat CME-AAV9.

EGFP had een gemiddelde diameter van 128,6 nanometer en een totale deeltjesconcentratie van 1,32 keer 10 per milliliter. Fluorescentiemicroscopie toonde aan dat CME-AAV9. EGFP produceerde een aanzienlijk hoger niveau van verbeterde groene fluorescerende eiwitexpressie in HEK293T cellen.

Het membraanomhulde virus bereikte ongeveer 2,5 keer een hogere genexpressie, wat wijst op een verbeterde cellulaire opname en mogelijk verbeterde intracellulaire transport. In vivo bioluminescentiebeeldvorming toonde aan dat de lever het sterkste luminescente signaal vertoonde na toediening van CME-AAV. Kwantitatieve analyse van leverregio's toonde aan dat de toediening van CME-AAV leidde tot significant hogere genexpressieniveaus.

Deze protocollen beschrijven stappen om gezuiverde celmembraan-omhulde AAV's, of CME-AAV, te verkrijgen via extrusie en dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie. Twee belangrijke factoren vereisen zorgvuldige overweging: Preprocessing van celfragmenten voor extrusie en het optimaliseren van de membraanfragment-naar-AAV-mengverhouding om de CME-AAV-deeltjes-genoomverhouding te beheersen. Toekomstige studies kunnen celmembraanbehuizing verder onderzoeken om de immuunbescherming en functionele oppervlakte-eigenschappen te verbeteren, waardoor CME-AAV wordt geoptimaliseerd als een veelzijdig platform voor AAV-levering.