Name: Bead-based Multiplex Flow Cytometry assay voor functionele profilering van CAR T-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: Leer een bead-based multiplex flow cytometry assay voor functionele profilering van CAR T-cellen. Deze methode detecteert meerdere effectormoleculen tegelijk uit beperkte monsters voor onderzoek en kwaliteitscontrole.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>Kralengebaseerde multiplex cytokine assay voor flowcytometrie</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Webgebaseerd hulpmiddel voor geautomatiseerd gating en analyse van MACSPlex-gegevens</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>Flow cytometrie-instrument voor multiplex datameting</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>Flow cytometrie-instrument voor multiplex datameting</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>Software voor geautomatiseerd gating en analyse</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>Geoptimaliseerd serumvrij celkweekmedium ontwikkeld voor de cultivering en expansie van humane en muis T-cellen</td></tr></tbody></table>

bead-based multiplex flow cytometry assay voor functionele profilering van car t-cellen

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

Bead-based Multiplex Flow Cytometry assay voor functionele profilering van CAR T-cellen

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

Ons onderzoek richt zich op de functionele karakterisering van CAR T-cellen en we hebben een flowcytometrie-compatible multiplex-assay ontwikkeld voor het profileren van de secretie van effector-moleculen. Deze procedure kan worden toegepast in CAR T-celonderzoek voor functionele karakterisering, mechanistische onderzoeken, QC-testen en potentiebeoordeling.Begin met het voorbereiden van celculturen van gemanipuleerde menselijke chimere antigeenreceptor T-cellen, of CAR T-cellen, met doelcellen die het cognate antigeen wel of niet tot expressie brengen, bij een ratio van effector- naar doelcel van 2,5 op 1. Bepaal één of meerdere tijdspunten voor het verzamelen van het supernatant, om uitgescheiden cytokines te analyseren of de kinetiek van cytokines over een gedefinieerd tijdsbestek te monitoren.Reconstitueer de analytestandaard door 200 µL buffer of celcultuurmedium aan het pellet toe te voegen en meng dit voorzichtig. Bereid zes reagensbuisjes voor en voer een verdunningsreeks van één op vijf uit van de gereconstitueerde standaard tot 3,2 pg/mL of 0,6 pg/mL. Bereid een blanco monster voor. Centrifugeer de co-cultuur op vastgestelde tijdstippen na co-cultuur bij 300 g gedurende vijf minuten bij 21 °C. Gebruik de supernatanten direct of verdun ze om binnen het bereik van de standaardcurve te passen.Bevocht een MACSPlex-filterplaat voor met 200 µL MACSPlex-buffer per well en gebruik een vacuümmanifold of centrifuge om te aspireren tot de wells leeg zijn. Vortex de capture bead-mix om de beads volledig te resuspenderen. Voeg 50 µL van de standaard of het monster en 20 µL vooraf verdunde beads toe aan de wells van een 96-well filterplaat. Incubeer de plaat twee uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 450 rpm in het donker. Was de wells twee keer met 200 µL buffer met behulp van een vacuümmanifold. Voeg 100 µL van 1 tot 50 vooraf verdund detectiereagens 1 toe aan de wells. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur onder schudden bij 450 rpm, in het donker. Was de wells twee keer. Voeg 100 µL van 1 tot 50 vooraf verdund detectiereagens 2 toe aan de wells. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden bij 450 rpm in het donker. Was de wells één keer en suspendeer de monsters opnieuw in 200 µL buffer.Gebruik de 2D-barcode op het flaconnetje met capture beads om de acquisitie-instellingen in de MACSQuant flowcytometer te laden. Selecteer na het inloggen in de software de MACSPlex filterplaat als monsterrek. Klik op de knop Barcode in de werkbalk om de 2D-codereader te activeren. Houd het flaconnetje voor de reader met de barcode naar het knipperende licht gericht op een afstand van 0,5 tot 2,5 centimeter. Wijs in het tabblad Autolabel de Capture Beads toe als MPx human cytotoxic T, and natural killer cell en selecteer Nolabel. Definieer de groepsposities voor de seriële verdunningen van de standaard voor cytotoxische T- en natural killer-cellen. Selecteer in het tabblad Settings de Express Mode. Stel het type in op Analysis en de modus op MACSPlex_Standard. Pas vervolgens een milde menging toe. Wijs het onbekende monster op dezelfde wijze toe en definieer de posities hiervan. Optioneel kunnen de monsters worden gegroepeerd en kunnen monsteridentificaties en beschrijvingen worden ingevoerd. Selecteer in het tabblad Settings opnieuw de Express Mode. Stel het type in op Analysis en de modus op MACSPlex_Sample. Controleer in de experimententabel of de rekdefinities correct zijn. Zorg voor juiste vloeistofniveaus in de putjes van de filterplaat en start de meting. Acquireer gegevens op een flowcytometer uitgerust met blauwe en rode lasers met behulp van de fycoerythrine of PE, fluoresceïnisothiocyanaat of FITC en allofycyaniline of APC kanalen. Bevestig dat de express mode templates worden gebruikt voor geautomatiseerde gating en data-analyse in de MACSQuant flowcytometer. Upload alternatief FSC- of MQD-databestanden naar de webgebaseerde InspectoR-tool voor geautomatiseerde kwantitatieve cytokinemetingen en resultaten die klaar zijn voor export. Verifieer de correcte scheiding van de 12 verschillende capture bead-populaties in het FITC- versus PE-kanaal. Pas de standaardcurve toe om de cytokineconcentraties te berekenen. Exporteer en visualiseer tot slot de resultaten.Door gebruik te maken van multiplex bead-codering werden in de biaxiale plot duidelijk verschillende bead-clusters opgelost die individuele analyten vertegenwoordigen. Na co-cultuur met tumor-doelcellen secreteerden de CAR T-cellen hoge niveaus van granzyme B, interferon gamma of INF-gamma, tumornecrosefactor alfa of TNF-alpha, en granulocyt-macrofaag koloniestimulerende factor of GM-CSF, wat duidt op een krachtige activatie en cytotoxische effectorfunctie. De niveaus van interleukine-2 of IL-2 overschreden de bovenste detectielimiet, wat consistent is met sterke proliferatieve signalering. Cytokinen die geassocieerd zijn met regulatoire of alternatieve helper-T-celresponsen, waaronder IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 en monocyten-chemoattractant proteïne 1 of MCP-1, waren aanwezig op lage of bijna ondetecteerbare niveaus. CAR T-cellen vertoonden een snelle en robuuste cytokinevrijgave bij herkenning van antigeen-positieve doelen, met een sterke upregulatie van granzyme B, IFN-gamma, TNF-alpha, GM-CSF en IL-2 binnen 8 tot 24 uur, waarbij piekwaarden werden bereikt na 48 uur. Er werden ook matige stijgingen in IL-6, IL-17A, IL-21 en perforine waargenomen. IL-4, IL-10 en MCP-1 bleven laag of matig verhoogd. Co-culturen met antigeen-negatieve doelen vertoonden minimale cytokine-inductie voor alle analyten.Dit protocol maakt kwantificering mogelijk van cytokinen, chemokinen en cytotoxische mediatoren die CAR T-celactivatie en effectorfunctie weerspiegelen. De belangrijkste overwegingen in dit protocol zijn de duur van de co-cultuur, de effector-tegen-target-ratio, monsterverdunning en het behouden van kwantificeerbare analytenniveaus. Na deze procedure kan supernatantprofilering worden gecombineerd met flowcytometrische analyses, CAR T-cel-fenotypering of cytotoxiciteitsassays.

bead-based-multiplex-flow-cytometry-assay-for-functional-profiling

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Tregs zijn krachtige onderdrukkers van het immuunsysteem. Er is een gebrek van unieke oppervlakte markers om ze te definiëren, dus, de definities van Tregs zijn vooral functioneel. Hier beschrijven we een...

Menselijk In Vitro Onderdrukking als Screening Tool voor de erkenning van een vroege staat van Immune Imbalance

Flowcytometrie kan worden gebruikt om de toestand van chromatine in T-cellen te beoordelen. Dit protocol maakt wetenschappers bewijs van chromatine decondensatie tijdens T-celactivering aangetoond door een verhoging van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van fluorescente histon H3 antilichamen interpreteren...

Het gebruik van flowcytometrie om de staat van chromatine in T-cellen Assess

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Dit document beschrijft een werkwijze voor het meten van alloreactiviteit in een gemengde populatie van T-cellen met behulp van beeldvorming flowcytometrie.

Meting van de T-cel alloreactiviteit Met behulp van Imaging flowcytometrie

Analyse van de traanfilm cytokines helpt bij het bestuderen van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten. Kraal gebaseerd multiplex assays zijn eenvoudig en gevoelige en activeer het testen van meerdere doelen in monsters met kleine volumes. Hier beschrijven we een protocol voor scheur film cytokine profielen met behulp van een kraal gebaseerd multiplex assay.

Kraal gebaseerd Multiplex Assay voor analyse van Tear Cytokine profielen

Dit protocol beschrijft de kwantificering van meerdere cytokine doelen tegelijkertijd in weefselkweek supernatant gestimuleerd muis splenocytes met behulp van multiplex kraal gebaseerde immunoassay platform en een stroom cytometer verkregen.

Multiplex Cytokine profilering van gestimuleerd muis Splenocytes met behulp van een kraal cytometrische gebaseerde Immunoassay Platform

Deze mededeling beschrijft methodologieën voor isolatie en cultuur van de alveolaire macrofagen van mens en lymfkliertest modellen voor experimentele doeleinden.

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

Na virale infectie, nier herbergt een relatief groot aantal CD8+ T cellen en biedt een kans om niet-mucosale TRM cellen te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om muisnierlymfocyten te isoleren voor stromingscytometrieanalyse.

Isolatie van Mouse Kidney-Resident CD8+ T cellen voor Flow Cytometry Analysis

Leer een bead-based multiplex flow cytometry assay voor functionele profilering van CAR T-cellen. Deze methode detecteert meerdere effectormoleculen tegelijk uit beperkte monsters voor onderzoek en kwaliteitscontrole.

Bead-based Multiplex Flow Cytometry assay voor functionele profilering van CAR T-cellen

Meer video's verkennen