Vestiging van zone-verrijkte primaire culturen uit de bijnierschors van de muis

Mijn onderzoek onderzocht de regulatie van de bijniermicro-omgeving, met de nadruk op ACM- en Wnt-signalering in de differentiatie van zona glomerulosa en zona fasciculata, en de ontwikkeling van tumoren. Bestaande methoden kunnen bijnierzones niet duidelijk onderscheiden. Dit protocol verrijkt ZG en ZF, waardoor de studie van verschillende celtypen mogelijk wordt.

Dit protocol kan worden toegepast om adrenofysiologie in ZG en ZF te bestuderen, inclusief zonatie en celdifferentiatie. Om de bijnier te isoleren voor een zone-verrijkte primaire kweek, gebruik je 10 tot 15 jonge volwassen mannelijke muizen, ongeveer zes tot zeven weken oud. Na het inslapen van de muis plaats je hem in een dorsale decubituspositie op een steriel vlak oppervlak en desinfecteer je de dierenvacht met 70% alcohol.

Maak met een schaar een eerste incisie in het liesgebied van de buik. Verleng de incisie lateraal naar de thorax aan beide zijden om het buikvlies bloot te leggen. Trek de huid voorzichtig terug.

Trek vervolgens voorzichtig de buikspieren terug om de holte bloot te leggen, waarbij schade aan de bloedvaten wordt voorkomen en een duidelijk zicht op de bijnieren blijft. Vervang chirurgische instrumenten om microbiële besmetting te minimaliseren. Identificeer de linkerbijnier die zich mediaal en boven de linkernier bevindt in het retroperitoneum, met een ovale vorm en roze kleur, omgeven door wit vetweefsel.

Gebruik een stompe pincet om de aangrenzende organen voorzichtig te verplaatsen om de visualisatie van de bijnier te verbeteren. Verwijder met een schaar het grootste deel van het omliggende vetweefsel met korte, gecontroleerde knipjes om de bijnier te isoleren. Vermijd het direct grijpen van de bijnier om schade aan de capsule te voorkomen.

Plaats de geïsoleerde bijnier onmiddellijk in een P60-kweekschotel met 10 milliliter voorverwarmde DMEM F-12 medium totdat alle monsters zijn verzameld. Identificeer vervolgens de rechterbijnier die zich lateraal en boven de rechternier bevindt in het retroperitoneum, waarbij je opmerkt dat de nabijheid van de lever, de opstijgende dikke darm en de nabijgelegen bloedvaten het visualiseren moeilijker kan maken. Behandel voorzichtig de nieraders en nierslagaders om per ongeluk snijwonden en bloedingen te voorkomen.

Na het isoleren van de rechterbijnier, met dezelfde procedure als bij de linkerbijnier, plaats je beide klieren samen in hetzelfde schaaltje. Maak de kweekschaal schoon met 70% alcohol voordat je de klieren naar de laminaire flow hood overbrengt. Was vervolgens de bijnieren drie keer door ze achtereenvolgens door schaaltjes met PBS te verplaatsen bij 25 graden Celsius.

Na de laatste wasbeurt verzamel en bewaar je de gescheiden weefsels in een vierde schaaltje met voorverwarmde DMEM om de levensvatbaarheid tijdens de bereiding van meerdere klieren te behouden. Breng de bijnieren over naar een filterpapier voor dissectie. Vervolgens grijp je met fijne tangen de bijnier bij het hechtende vetweefsel.

Ontleed het vet op het filterpapier zorgvuldig met gecontroleerde bewegingen om schade aan de capsule te voorkomen. Zorg ervoor dat de klier glad en intact is, en vrij van overtollig vet- en bindweefsel. Breng de bijnieren voorzichtig over op vers filterpapier om een nauwkeurige microdissectie te vergemakkelijken.

Met fijne pincetten knijp je voorzichtig in de capsule van de bijnier. Maak met een scalpelblad een radiale incisie in de klier zonder het weefsel volledig te doorsnijden. Oefen lichte mechanische druk uit om de binnenste inhoud van de cortex via de incisie naar buiten te duwen.

Leg het binnenste kliermateriaal bloot terwijl de capsule en de zona glomerulosa verbonden blijven met de punt van de tang. Identificeer het uitgestoten binnenste kliermateriaal als de zona fasciculata en medulla. Start de enzymatische spijsvertering pas nadat alle klieren zijn verwerkt, om een goede mechanische scheiding van de buiten- en binnenzone te waarborgen.

Na centrifugatie worden de verzamelde cellen opnieuw opgehangen in kweekmedium. Na het vaststellen van de bijniercelkweek voer je moleculaire karakterisering uit van gekweekte cellen met genexpressie-analyse en immunokleuring. Primaire bijniercelculturen werden met succes vastgesteld uit de buitenste fractie die verrijkt was voor zonaglomerulosecellen en de binnenste fractie die verrijkt was voor zona fasciculatacellen.

Het lineage tracing muismodel maakte visualisatie mogelijk van zona glomerulosa-specifieke mGFP-expressie, aangedreven door de Cyp11b2-promotor. mGFP-expressie werd voornamelijk waargenomen in zonaglomerulosa-verrijkte culturen, terwijl zona-fasciculata-verrijkte culturen voornamelijk mTomato tot expressie brachten. Hogere relatieve expressieniveaus van Cyp11b2, Dab2 en Sonic hedgehog werden waargenomen in buitenste fractieculturen vergeleken met binnenste fractieculturen.

Binnenfractieculturen vertoonden een hogere relatieve expressie van Cyp11b1 en Akr1b7 vergeleken met buitenste fractieculturen. De afscheiding van aldosteron was hoger in culturen met een verrijking van zonaglomerulosa dan in culturen met een fasciculata. In buitenste fractieculturen nam de aldosteronsecretie verder toe bij stimulatie met angiotensine II, kalium en adrenocorticotrop hormoon.

De corticosteronsecretie was hoger in met zona fasciculata verrijkte culturen vergeleken met zona glomerulosa. Zona-fasciculata-verrijkte culturen toonden een verhoogde corticosteronsecretie als reactie op adrenocorticotrope hormoon- en forskolinestimulatie. Dit protocol maakt het mogelijk zone-specifieke fysiologie en differentiatie te bestuderen, inclusief hormoonproductie, signaalroutes en extracellulaire matrix.

Toekomstige studies kunnen bijnierzonatie en differentiatiemechanismen onderzoeken en deze cellen gebruiken om een 3D-model te bouwen en ECM-interacties te bestuderen.