Name: Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-11T18:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 31 s
Description: Leer single-cell elektroporatie van fluorescerende kleurstoffen of plasmide-DNA in neuronen van de Xenopus laevis kikkervis in vivo. Deze methode maakt gerichte manipulatie en visualisatie van individuele cellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs danken Sharmin Hossain voor de time-lapse film vastleggen van de groei van een onvolwassen neuron en Derek Dunfield voor het elektron microscopie beelden van de SCE micromicropipette tips.

Apparatuur set-up: <ol><li> De elektrische uitrusting die nodig is voor deze techniek is een stimulator, een oscilloscoop en een micropipet de houder uitgerust met een zilveren draad te worden ingevoegd in de micropipet. We meestal een Axon instrumenten Axoporator 800A stimulator te gebruiken, maar andere gemeenschappelijke stimulatoren, zoals de Grass-instrumenten SD9 stimulatoren zijn ook geschikt voor single-cell elektroporatie. De stimulator wordt aangesloten op de headstage, die raakvlakken met de zilveren draad elektrode te worden geplaatst in de glazen micropipet met een interne geleidende oplossing. De andere stekker van de stimulator is aangesloten op de oscilloscoop input, die ook de inbreng ontvangt van de kikkervisje externe grond. Het kikkervisje externe grond is gewoon een zilveren draad die blijft elektrotone contact met de kikkervisje tijdens de elektroporatie. Het circuit is compleet als de micropipet wordt in contact gebracht met het kikkervisje. </li><li> Enkele cel elektroporatie vereist een microscoop met een goed werkende afstand (ten minste 5 cm), omdat dit geeft ruimte om te manoeuvreren en laat de micropipet worden gebracht in een hoek van ongeveer 30-45 graden. </li></ol> Fabricage van micropipetten: De voorbereiding van geschikte micropipetten is een cruciale stap in dit protocol. De moeilijkheid ligt in het evenwicht een smalle punt (minder dan 1 uM in diameter) met een die niet gemakkelijk breken wanneer aanprikken van de weefsel. We hebben ook geconstateerd dat tips met een tapse hoek van meer dan 10 graden voorkeur zijn. <ol><li> Bereid een getrokken glas micropipet met een tip diameter van minder dan 1 uM, en een tip taper hoek van meer dan 10 graden. <ol><li> Borosilicaatglas met een interne filament met een buitendiameter van 1,5 mm en de inwendige diameter van 0,75 mm is zeer geschikt voor dit doel. <ol><li> De relatief dik glas biedt een zekere mate van stijfheid van de tip. </li><li> De interne filament is van belang bij het opstellen back-gevulde vloeistof naar de micropipet tip. </li></ol></li></ol></li><li> Fabricage van geschikte tips zal het vaak nodig een aantal wijzigingen op grond van waargenomen resultaten. Verschillende weefsels kan een tip met een iets andere vorm of tip diameter. </li></ol> Single-cell elektroporatie protocol: Voor nieuwe gebruikers, is het raadzaam om te beginnen met fluorescerende kleurstoffen dextran omdat, in tegenstelling tot genetisch gecodeerd fluorescerende eiwitten, kunnen ze meteen te zien onder epifluorescentie. Het gebruik van fluorescente kleurstoffen kan de gebruiker direct de locatie van de micropipet tip binnen het weefsel, en op elektroporatie geeft direct feedback over de vraag of de apparatuur goed is opgezet en of de micropipet tip geschikt is. <ol><li> Vul micropipet met een oplossing van verbinding te geëlektroporeerd hetzij door middel van een laad-spuit of door back-vulling. <ol><li> Als met behulp van plasmide DNA, dat de steekproeven zijn endotoxine-vrij, en bij een concentratie tussen 1-2μg/ml, bereid in water. </li><li> De concentratie van fluorescerende kleurstoffen dextran moet empirisch worden bepaald. We maken vaak gebruik van fluorescerende kleurstoffen in water verdund tot ongeveer 300μM. </li><li> Typisch zijn de volumes van 0,5-1μl zijn voldoende. </li><li> Voorafgaand aan het laden, even centrifuge oplossingen op hoge snelheid tot het bedrag van fijn puin getrokken in de micropipet, wat kan leiden tot verstoppingen te verminderen. </li><li> Luchtbellen in de top vaak van invloed op de stroom en dient te worden verdreven door krachtig flicking de micropipet voorafgaand aan de montage op de headstage. </li></ol></li><li> Plaats micropipet in de houder of headstage gemonteerd op een 3-assige micromanipulator. Zorg ervoor dat zilver draad elektrode wordt ingebracht in micropipet, en is in elektrotone contact met de interne oplossing. </li><li> Verdoven kikkervisjes door onderdompeling in 0,02% MS-222 (3-aminobenzoëzuur ethyl ester), opgesteld in kikkervisje fokken medium (Steinberg&#39;s oplossing, pH 7,4). <ol><li> We normaal gesproken gebruik van het podium 44-48 albino Xenopus laevis kikkervisjes in onze experimenten. </li><li> Kikkervisjes zijn meestal volledig verdoofd na ongeveer 5 minuten. </li><li> Meerdere kikkervisjes kunnen gelijktijdig onder narcose worden om te wachten-time te verminderen, maar vermijd blootstelling aan MS-222 voor de periode na 1 uur. </li></ol></li><li> De overdracht van een enkel verdoofd kikkervisje tot elektroporatie kamer met behulp van een plastic overdracht micropipet. <ol><li> De elektroporatie kamer kan gemakkelijk worden gemaakt in eigen huis door carving een kikkervisje-vormige holte in een kleine Sylgard ® siliconen te blokkeren, en het invoegen van een zilveren aardedraad in de ruimte zoals dat het in elektrotone contact met de kikkervisje in de kamer. </li></ol></li><li> Positie kikkervisje dorsale zijde naar boven met een vochtige kwast. </li><li> Laat de micropipet totdat het in contact komt met de huid, direct grenst aan de regio van belang. <ol><li> Targeting regio&#39;s met een dicht opeengepakte cellichamen sterk zal toenemen kans op een succesvolle elektroporatie.We meestal gericht op het kikkervisje optische Tectum. </li><li> Breng de micropipet in een hoek van 30 tot 45 graden. Ondiepere trajecten maken de huid doorboren moeilijker, terwijl de steilere hoek vaak belemmeren een te bekijken. </li></ol></li><li> Voortzetting van het verlagen van de micropipet zal in eerste instantie kuiltje van de huid, en dan door naar het onderliggende weefsel. <ol><li> Oppervlakkige cellen zijn voorkeur voor in vivo beeldvorming, en kunnen worden gericht door ervoor te zorgen dat de micropipet tip langzaam wordt verlaagd na kuiltjes van de huid. </li></ol></li><li> Men moet voortdurend de micropipet weerstand een keer geplaatst in het weefsel. Bij gebruik van een Axoporator 800A (Axon Instruments), weerstanden van ongeveer 10-40MΩ optimaal zijn. Weerstand is een goede indicator van de vraag of de tip diameter is geschikt voor single-cell elektroporatie. <ol><li> Hoge micropipet weerstanden (&gt; 100MΩ) zijn een indicatie van verstopt tips of micropipetten met tips die zijn te smal. </li><li> Lage micropipet weerstanden (&lt;10MΩ) zijn indicatief voor een tip diameter die te groot is, vaak een gevolg van een gebroken tip. </li><li> Als u een stimulator die niet voorziet in een directe weerstand te meten, kan micropipet weerstand indirect gemeten door het observeren van de amplitude van de spanning pulsen gemeten door de oscilloscoop (hieronder besproken). </li></ol></li><li> Van toepassing spanning trein. <ol><li> Voor plasmide DNA, treinen pols bleek te zijn het meest effectief bestaan ​​uit negatieve blokgolf pulsen 1ms in duur, afgeleverd op 300Hz met pulstrein duur van 500ms. <ol><li> De puls spanning wordt bepaald empirisch zodanig dat de amplitude van de pulsen gemeten op de oscilloscoop is tussen de 0,75 en 1.5μA. </li></ol></li><li> Voor fluorescerende kleurstoffen dextran, zijn positief blokgolf pulsen van 300μs duur geleverd op een frequentie van 300 Hz met een puls trein duur van 10ms. <ol><li> Net als bij het protocol voor DNA, is de puls spanning bepaald empirisch zodanig dat de amplitude van de pulsen gemeten op de oscilloscoop is tussen de 0,75 en 1.5μA. </li><li> Bijkomende aanpassingen aan de stimulus parameters kunnen worden gemaakt op basis van het observeren van de resultaten van elektroporatie onder epifluorescentie. <ol><li> Als geëlektroporeerde cellen blijken dim, moet pulsparameters geleidelijk worden verhoogd tot cellen helderder. </li><li> Aan de andere kant, als clusters van cellen gemarkeerd zijn, moeten pols parameters worden gereduceerd tot enkele cellen zijn gelabeld. </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Trek micropipet, opnieuw in te voegen in een andere plaats binnen het weefsel, en toe te passen spanning trein. <ol><li> Ter verbetering van opbrengst, we meestal electroporate meerdere sites in elk halfrond van het kikkervisje optische Tectum met voldoende afstand om ervoor te zorgen dat de gelabelde cellen elkaar niet overlappen. </li></ol></li><li> Breng de geëlektroporeerd kikkervisje in een container met opvoeding Steinberg oplossing. <ol><li> Kikkervisjes zal snel herstellen van anesthesie binnen een paar minuten. </li></ol></li><li> Hetzelfde micropipet kan gebruikt worden voor tal van kikkervisjes. Het is belangrijk om voortdurend te observeren de amplitude van de pulsen waargenomen op de oscilloscoop. <ol><li> Als de puls amplitude blijft laag na aanzienlijke verhoging van de puls intensiteit is dit waarschijnlijk een gevolg van de tip wordt verstopt, vaak gezien als electroporating veel kikkervisjes in een vergadering. <ol><li> Een methode om een ​​kleine tip klomp los is aan een enkele positieve puls toe te passen na het inbrengen van de micropipet in het weefsel. </li><li> Als de klomp niet kan worden verdreven, of verstopping regelmatig terugkomt, vervang dan de micropipet. </li></ol></li><li> Als de puls amplitude blijft zeer groot na een forse daling van de pols parameters, is dit een teken dat de tip heeft gebroken en moet worden vervangen. </li></ol></li></ol> Screening voor het succesvol geëlektroporeerde cellen: <ol><li> Na de elektroporatie, zijn kikkervisjes gescreend op gelabelde cellen met behulp van een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop. </li><li> In het geval van fluorescerende kleurstoffen, kan kikkervisjes worden gescreend na slechts 30 minuten na elektroporatie. <ol><li> Wij hebben echter gevonden dat langere tussenpozen worden geassocieerd met een lager achtergrond fluorescentie niveaus. </li></ol></li><li> Voor genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten, is screening meestal uitgevoerd ten minste 12 uur na de elektroporatie. <ol><li> Cellen die fluorescerende eiwitten zal blijven helderder te krijgen met de tijd, dus dim cellen kunnen opnieuw worden gescreend na een extra interval van 12-24 uur. </li></ol></li><li> Kikkervisjes verdoofd zoals hierboven beschreven, geplaatst in een Sylgard ® kamer en afgedekt. Individuele kikkervisjes worden vervolgens onderzocht in het kader epifluorescentie. <ol><li> Merk op dat overmatige blootstelling aan epifluorescentie het licht zal resulteren in fototoxiciteit dat de gelabelde cel kan doden. Daarom is het minimaliseren van de hoeveelheid tijd dat cellen worden blootgesteld aan het TL-licht. </li></ol></li><li> Keer terug naar kikkervisjes container met opvoeding Steinberg oplossing. </li></ol>

<ol><li>Bestman, J. E., Ewald, R. C., Chiu, S. L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+single-cell+electroporation+for+transfer+of+DNA+and+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo single-cell electroporation for transfer of DNA and macromolecules.</a> Nature Protocols. 1, 1267-1272 (2006).</li>
<li>Dunfield, D., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Neuroscience+%284th+Ed.%29%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation.</a> Encyclopedia of Neuroscience (4th Ed.). , Elsevier, Amsterdam. In press Forthcoming.</li>
<li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
</ol>

Single-cell elektroporatie (SCE) is een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van gen-functie en het uitvoeren van gerichte genetische manipulatie. De transparantie van de albino kikkervisje en de toegankelijkheid van de hersenen maken dit model systeem bij uitstek geschikt voor het visualiseren van neuronale groei en de intracellulaire gebeurtenissen binnen een levend organisme. SCE kan de visualisatie van de groei van een enkel neuron, en tot cel-autonome manipulaties uit te voeren binnen een anders ongewijzigd brein. Terwijl deze video ar...

single cell elektroporatie in vivo binnen de intact ontwikkeling van de hersenen

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell elektroporatie (SCE) is een gespecialiseerde techniek waardoor de levering van DNA of andere macromoleculen in individuele cellen in intact weefsel, ook in vivo preparaten. Het duidelijk voordeel van deze techniek is dat de experimentele manipulaties kunnen worden uitgevoerd op individuele cellen terwijl het omliggende weefsel ongewijzigd, waardoor onderscheid cel-autonome effecten van die welke voortvloeien uit de wereldwijde behandelingen. In combinatie met geavanceerde in vivo imaging technieken, SCE van TL-markers maakt directe visualisatie van de cellulaire morfologie, de celgroei, en intracellulaire gebeurtenissen van tijdschalen variërend van seconden tot dagen. Hoewel deze techniek wordt gebruikt in een verscheidenheid van in vivo en ex vivo de voorbereidingen, hebben we deze techniek geoptimaliseerd voor gebruik in Xenopus laevis kikkervisjes. In deze video artikel hebben we detail de procedure voor SCE van een fluorescente kleurstof of plasmide DNA in neuronen in de intacte hersenen van de albino Xenopus kikkervisje. We bespreken ook methoden om rendement te optimaliseren, en tonen voorbeelden van levende twee-foton fluorescentie beeldvorming van neuronen fluorescent gelabeld door SCE.

Single-cell elektroporatie (SCE) is een gespecialiseerde techniek waardoor de levering van DNA of andere macromoleculen in individuele cellen in intact weefsel, ook in vivo preparaten. Hier hebben we detail de procedure voor SCE van een fluorescente kleurstof of plasmide DNA in neuronen in de intacte hersenen van de Xenopus laevis kikkervisje.

Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen

Single-cell elektroporatie (SCE) is een gespecialiseerde techniek waarmee DNA of andere macromoleculen in individuele cellen binnen intacte ...

Elektroporatie van enkele cellen is een gespecialiseerde techniek waarmee DNA of andere macromoleculen in individuele cellen kunnen worden gebracht binnen intact weefsel, inclusief in vivo preparaties wanneer dit wordt gecombineerd met geavanceerde in vivo beeldvormingstechnieken. Elektroporatie van fluorescentiemarkers in enkele cellen maakt directe visualisatie van de cellulaire morfologie, celgroei en intercellulaire gebeurtenissen mogelijk over tijdsperioden variërend van seconden tot dagen. In deze video beschrijven we gedetailleerd de procedure voor elektroporatie van een fluorescerende kleurstof of plasmide-DNA in neuronen binnen de intacte hersenen van de XUS-kikkervisje, en tonen we voorbeelden van live imaging van fluorescentielabelled neuronen.Hallo. Mijn naam is Eth Haa en ik werk in het laboratorium van Dr. Kurt Haass in het Brain Research Center aan de University of British Columbia. Vandaag zal ik demonstreren hoe u gerichte electroporatie van individuele cellen van neuronen kunt uitvoeren in het intacte brein van de albino XUS Lavis-kikkerlarve.Het duidelijke voordeel van deze techniek is dat experimentele manipulaties op individuele cellen kunnen worden uitgevoerd

single-cell-electroporation-in-vivo-within-the-intact-developing-brain

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In utero elektroporatie is een waardevolle methode voor het transfecteren neuronale stamcellen in vivo. Afhankelijk van de plaatsing van de elektroden en de ontwikkeling meetpunt van elektroporatie, kunnen bepaalde subsets van corticale cellen worden gericht. Gerichte cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in vivo of in vitro voor de effecten van genetische manipulatie.

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Om een ​​snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen...

Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

De pial oppervlak is een uniek voorlopercellen zone in het CZS, die krijgt steeds meer aandacht. Hierin hebben we gedetailleerd een methode voor snelle genetische manipulatie van deze voorlopercellen zone met een aangepaste elektroporatiewerkwijze. Deze procedure kan worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire analyses van cellijnen en signaalwegen betrokken bij celdifferentiatie en het lot en de eigenschappen van dochtercellen helderen.

Neonatale Pial Surface Elektroporatie

Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.

In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Hier gepresenteerd is een protocol om genetische manipulatie uit te voeren in de embryonale fret hersenen met behulp van in utero elektroporatie. Deze methode maakt het mogelijk om neurale voorlopercellen in de neocortex in vivo te targeten.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex door In Utero Electroporation

Leer single-cell elektroporatie van fluorescerende kleurstoffen of plasmide-DNA in neuronen van de Xenopus laevis kikkervis in vivo. Deze methode maakt gerichte manipulatie en visualisatie van individuele cellen mogelijk.

Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen

Meer video's verkennen