Single Cell Elektroporatie in vivo binnen de Intact ontwikkeling van de hersenen

Elektroporatie van enkele cellen is een gespecialiseerde techniek waarmee DNA of andere macromoleculen in individuele cellen kunnen worden gebracht binnen intact weefsel, inclusief in vivo preparaties wanneer dit wordt gecombineerd met geavanceerde in vivo beeldvormingstechnieken. Elektroporatie van fluorescentiemarkers in enkele cellen maakt directe visualisatie van de cellulaire morfologie, celgroei en intercellulaire gebeurtenissen mogelijk over tijdsperioden variërend van seconden tot dagen. In deze video beschrijven we gedetailleerd de procedure voor elektroporatie van een fluorescerende kleurstof of plasmide-DNA in neuronen binnen de intacte hersenen van de XUS-kikkervisje, en tonen we voorbeelden van live imaging van fluorescentielabelled neuronen.

Hallo. Mijn naam is Eth Haa en ik werk in het laboratorium van Dr. Kurt Haass in het Brain Research Center aan de University of British Columbia. Vandaag zal ik demonstreren hoe u gerichte electroporatie van individuele cellen van neuronen kunt uitvoeren in het intacte brein van de albino XUS Lavis-kikkerlarve.

Het duidelijke voordeel van deze techniek is dat experimentele manipulaties op individuele cellen kunnen worden uitgevoerd terwijl het omliggende weefsel ongewijzigd blijft, waardoor celautonome effecten kunnen worden onderscheiden van effecten die voortvloeien uit globale behandelingen. De eerste stap omvat het vervaardigen van micropipetten met de juiste tipdiameter en taps-hoek, gevolgd door het laden van transfermateriaal in de micropipet. Vervolgens moeten de TA-pools worden geanestheseerd en overgebracht naar de fixatiekamer, waarna de micropipet in de hersenen wordt ingebracht en een reeks spanningspulsen wordt toegediend.

Ten slotte worden de gelabelde neuronen gevisualiseerd met behulp van tweefotonmicroscopie. Deze techniek wordt aan u gedemonstreerd in kikkervisjes. Cel-specifieke labeling kan ook worden toegepast in andere modelsystemen en in ex vivo preparaten.

Met dat in het achterhoofd kunnen we beginnen. Single-cell electroporatie richt zich op een individuele cel door gebruik te maken van een getrokken glazen micropipet-elektrode, die het elektrisch veld beperkt tot één enkele cel die in contact staat met de pipetpunt. De fysieke geometrie van de pipetpunt is een kritisch kenmerk dat direct invloed heeft op het succes van de techniek.

Een solder model P 97 puller wordt gebruikt om micropipetten te maken van borosilicaatglas met een buitendiameter van 1,5 millimeter en een binnendiameter van 0,75 millimeter, voorzien van een intern filament om het vullen van de tip zonder luchtbellen te vergemakkelijken. Pipetpunten die het meest effectief zijn gebleken voor electroporatie van enkelvoudige cellen, zijn die met een tipdiameter van 0,5 tot 1 micron en tapshoek van meer dan 10 graden. Na het trekken van een glazen micropipet kan het materiaal in oplossing in de pipet worden geladen door middel van back-filling of door gebruik te maken van een laadspuit.

Voor deze demonstratie zullen we individuele neuronen fluorescent labelen met een fluorescerende kleurstof, zoals hier getoond, of met een plasmide dat GFP (groen fluorescerend eiwit) codeert. Oplossingen van GFP moeten kortstondig op hoge snelheid worden gecentrifugeerd om de hoeveelheid particulate debris die de pipet binnenkomt te verminderen. Aangezien dit de kans op verstopping van de tip voor nieuwe gebruikers vergroot, is het raadzaam om te beginnen met fluorescerende kleurstoffen, aangezien deze gemakkelijk zichtbaar zijn onder epifluorescentie.

Dit maakt het mogelijk om de tip in het monster te visualiseren en geeft directe feedback over het feit of de apparatuur correct is ingesteld en of de pipetpunt geschikt is. Goed gedaan. Nu we de micropipet hebben voorbereid, kunnen we overgaan naar het uitvoeren van de procedure voor electroporatie van enkelvoudige cellen.

De elektrische apparatuur die nodig is voor deze techniek bestaat uit een stimulator en een oscilloscoop, en een pipethouder die is voorzien van een zilverdraad om in de pipet te worden ingebracht. Hier maken we gebruik van een Axon Instruments Ax Separator 800 A, hoewel gangbare stimulatoren zoals een Grass SD9 kan worden gebruikt. De Ax Separator is verbonden met de headstage, die fungeert als interface tussen de Ax Separator en de zilverdraadelektrode.

De externe aarding van de kikkervisje is simpelweg een zilverdraad die elektronisch contact houdt met de kikkervisje. Tijdens de elektroporatie zijn de headstage, de aardingskabel en de externe aarding van de kikkervisje beide aangesloten op de ingang van de oscilloscoop. Zodra de elektrische apparatuur is ingesteld, kan de pipet in de pipethouder worden geplaatst.

De pipethouder dient te worden gemonteerd op een drie-assige micromanipulator die fijne bewegingen mogelijk maakt. Electroporatie van enkele cellen vereist een microscoop met een goede werkafstand. Dit biedt meer manoeuvreerruimte en maakt het mogelijk om de pipet in een hoek van ongeveer 30 tot 45 graden in te brengen.

Zodra de apparatuur correct is aangesloten, kunnen we beginnen met de procedure voor electroporatie van een enkele cel. Eerst worden de kikkervisjes geanestheseerd door onderdompeling in 0,02% MS 222; de kikkervisjes zijn gewoonlijk volledig geanestheseerd. Na ongeveer vijf minuten wordt een enkele kikkervisje overgebracht naar de electroporatiekamer.

Met behulp van een plastic transferpipet kan de kamer eenvoudig in-house worden gemaakt door een kikkervisje-vormige holte uit te snijden in een klein siliconen blok en een zilveren aardingsdraad in te voegen, zodat deze in contact komt met de huid van het kikkervisje wanneer deze zich in de kamer bevindt. Vervolgens kan met een penseel het kikkervisje zodanig worden gepositioneerd dat de dorsale zijde naar boven is gericht. De micropipet wordt daarna naar beneden bewogen tot deze in contact is met de huid direct naast het gebied van interesse.

Door de pipet verder te laten zakken, zal de huid in eerste instantie indeuken en vervolgens worden doorboord naar het onderliggende weefsel. Hier richt ik me op de optic tum van de tide pole-hersenen. Ik mik specifiek op de regio van de cellichaamlaag.

Als u een xi gebruikt, kan de weerstand van de pipet in het weefsel worden gemonitord. Over het algemeen ligt de weerstand tussen de 10 en ongeveer 40. Megaohm werken goed.

De weerstand van de pipet is een goede indicator voor het bepalen of de diameter van de tip te klein is of of de tip verstopt is, in welk geval de weerstand hoog zal zijn. Aan de andere kant zal de pipetweerstand laag zijn als de diameter van de tip te groot is of als de tip gebroken is. Hoewel de absolute weerstand van de pipet niet gemeten kan worden bij gebruik van een conventionele stimulator.

De oscilloscoopmeting is een indirecte maat voor de weerstand van de pipet bij fluorescente dextraanklevers. De stimulus bestaat uit een reeks positieve blokgolfpulsen van 10 milliseconden, aangebracht bij een frequentie van 300 hertz. Individuele pulsen hebben een duur van 300 microseconden en worden afgegeven bij een spanning van 50 volt.

Met deze instellingen wordt de fluorescerende kleurstof uit de tip gestuwd, zoals te zien is bij het toepassen van een stimulus na elektroprobing. Op één locatie wordt de pipet teruggetrokken en het proces wordt op verschillende locaties binnen het weefsel herhaald om de opbrengst te verhogen. Tijdens het afgeven van een voltagepuls-trein dient men de amplitude van de resulterende pulsen op de oscilloscoop te bewaken en de amplitude indien nodig aan te passen naar een waarde tussen 1 en 1,5 microamps.

Als de pulsamplitude laag blijft na een aanzienlijke verhoging van de spanning, of als deze tijdens de procedure daalt, wijst dit er sterk op dat de tip verstopt is of dat de tipdiameter te klein is. Dit kan erg frustrerend zijn wanneer het gebeurt. Aan de andere kant, als de amplitude nog steeds hoog is na een aanzienlijke verlaging van de aangelegde spanning, of als deze tijdens de procedure stijgt, duidt dit er sterk op dat de tip óf te breed is, óf dat deze gebroken is, of dat tips breken.

Ik word vaak erg emotioneel en verdrietig. Zoals eerder vermeld, is het voordeel van het gebruik van fluorescerende kleurstoffen dat men onmiddellijk kan controleren of individuele cellen zijn geëlectroporeerd met de gegeven stimulusparameters. Als de cellen zeer zwak oplichten of als er geen cellen zijn gelabeld, zou men beginnen met het geleidelijk en onafhankelijk verhogen van elke stimulusparameter totdat de gelabelde cellen er helder gelabeld uitzien zoals hier; het zien van mooi gelabelde cellen maakt mijn dag.

Anderzijds, als er een groot aantal cellen gelabeld leek te zijn, zou men de stimulusparameters geleidelijk verlagen tot er leek dat slechts één enkele cel helder gelabeld was, zoals hier. Het zien van helder gelabelde cellen is zeer bevredigend. In het geval van plasmide-DNA zijn de gebruikte pulstreinen negatieve pulsen met een duur van 1 milliseconde, afgeleverd bij 300 hertz, en is de duur van de treinstroom 500 milliseconden.

Na de elektroporatie worden de TA-polen geplaatst in een verse kweekoplossing, waar ze snel herstellen van de anesthesie. Meestal kunnen we, nadat er 50 tot honderd TA-polen zijn geëlektroporeerd, overgaan tot het screenen ervan, wat ik u vervolgens zal laten zien. Voordat de beeldvormingsexperimenten beginnen, is het nuttig om de geëlektroporeerde kıggervisjes snel te screenen met een rechtopstaande epi-fluorescentiemicroscoop.

Om te bepalen welke kikkervisjes neuronen bevatten die geschikt zijn voor beeldvorming, worden de kikkervisjes geanestheseerd en vervolgens in een sigaarkamer geplaatst en afgedekt met een dekglas. De hersenen van individuele kikkervisjes worden vervolgens snel bekeken onder epi-fluorescentielicht om vast te stellen of er enkelvoudige fluorescentie-gelabelde neuronen aanwezig zijn. Let erop dat overmatige blootstelling aan het epi-fluorescentielicht zal leiden tot fototoxiciteit, waardoor de gelabelde cel kan afsterven. Probeer daarom de tijd dat cellen aan het fluorescentielicht worden blootgesteld te minimaliseren.

In het geval van dextraankleurstoffen kan de screening al 30 minuten na de elektroporatie plaatsvinden. We stellen echter vast dat langere intervallen gepaard gaan met lagere achtergrondfluorescentieniveaus. In het geval van plasmiden wordt de DNA-screening doorgaans minimaal 12 uur na de elektroporatie uitgevoerd.

Wij maken routinematig gebruik van elektroporatie van enkelvoudige cellen om neuronen in het optic tectum van de kikkervisje fluorescent te labelen. Onze tweefotonmicroscoop is op maat gebouwd, geconstrueerd uit een Olympus FV 300 confocale microscoop en een Chameleon XP laserlichtbron. Meestal gebruiken we een golflengte van 910 nanometer om groen fluorescentiebeeldmateriaal vast te leggen.

Zodra we een kikkervisje hebben gevonden met één enkel gelabeld AL-neuron en dit op onze tweefotonenopstelling hebben geplaatst, gaan we over tot time-lapse foton-imaging van tactiele neuronen over verschillende tijdsintervallen. Hiermee kunnen we de dynamische groeipatronen van de dendritische vertakkingen van AL-cellen observeren. Hier zien we een voorbeeld van een GFP-expresserend neuron dat is gelabeld middels single-cell elektroporatie.

Deze afbeelding is vastgelegd met behulp van in vivo tweefotonmicroscopie om neuronale groei te kwantificeren. Doorgaans worden geskeletiseerde driedimensionale reconstructies van elke neuronale afbeelding gegenereerd. Time-lapse imaging met verlengde intervallen biedt inzicht in de langetermijngevolgen van een experimentele manipulatie.

Hier zien we een onrijpe GFP-uitdrukkende neuron die gedurende vier dagen dagelijks is afgebeeld, wat de uitbreiding van de dendritische arbor beslaat. Deze beelden zijn vastgelegd met behulp van tweefotonenmicroscopie en worden gepresenteerd als Z-projecties. Snelle time-lapse-imaging stelt ons in staat om de aard van meer dynamische processen van neuronale groei te observeren, waaronder de vorming en retractie van dendritische filopodia.

Deze video toont een relatief volwassen GFP-expresserende neuron die gedurende een uur elke twee minuten in drie dimensies is afgebeeld. Dit is een voorbeeld van een onrijpe GFP-expresserende neuron die gedurende een uur elke vijf minuten is afgebeeld. Jongere neuronen zijn zeer dynamisch en vertonen uitgebreide takgroei en takretractie.

Een ingezoomd beeld van dit GFP-expresserende neuron toont de constante vorming en retractie van dendritische filopodia, wat kenmerkend is voor ontwikkelende neuronen in dit systeem. De transparantie van de albino tadpole en de toegankelijkheid van de hersenen maken dit modelsysteem bij uitstek geschikt voor het visualiseren van neuronale groei en intracellulaire processen binnen een levend organisme. Electroporatie van een enkele cel stelt ons in staat om de groei van één enkel neuron te visualiseren en celautonome manipulaties uit te voeren binnen een verder ongewijzigde hersenstructuur.

We hebben zojuist gedemonstreerd hoe u single-cell elektroporatie uitvoert in zap lavis tat-polen, hoewel we ons hier concentreren op elektroporatie in TA-polen. Deze techniek is toegepast bij andere organismen en is ook gebruikt in hippocampale coupes en gedissocieerde celculturen. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de pipetpunten en stimulatieparameters constant aan te passen om een hoge opbrengst te behouden.

Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.