Een efficiënte en snelle HPLC-QQQ-MS-methode voor de kwantificatie van tropaanalkaloïden in medicinale planten

We hebben een HPLC-QQQ-MS-methode ontwikkeld om drie belangrijke tropaanalkaloïden in Anisodus tanguticus snel te kwantificeren. Conventionele HPLC mist gevoeligheid voor tropaanalkaloïden. Deze methode gebruikt zeer gevoelige massaspectrometrie om dit probleem op te lossen.

Om te beginnen weeg nauwkeurig 10,0 milligram hyoscyamine, anisodaminehydrobromide- en scopolaminehydrobromide-referentiestandaarden. Plaats ze in een aparte 10 milliliter volumetrische kolf. Voeg chromatografisch methanol toe aan de gemarkeerde lijn in elke volumetrische kolf.

Lost de standaarden grondig op met ultrasone behandeling om enkelvoudige standaardoplossingen te bereiden met een concentratie van 1,0 milligram per milliliter. Vervolgens doe je de bouillonoplossingen over in bruine reagensflessen en bewaar je deze vier graden Celsius in het donker. Om een gemengde standaard tussenoplossing van 10 microgram per milliliter te bereiden, pipetet 100 microliter van elke eerder bereide voorraadoplossing in een volumetrische kolf van 10 milliliter.

Voeg vervolgens chromatografische methanolkwaliteit toe aan de gemarkeerde lijn om de oplossing te verdunnen. Vervolgens voer je vriesdroog uit van vers materiaal van Sophora flavescens. Vervolgens maalt u met een hogesnelheidsmolen het gedroogde materiaal tot een homogeen poeder.

Zeef het poeder door een standaard testzeef van 0,25 millimeter. Nauwkeurig 20 milligram van het gezeefde poeder wegen. Doe het over in een volumetrische kolf van 100 milliliter en voeg chromatografische methanol net onder de gemarkeerde lijn toe.

Voer vervolgens 30 minuten ultrasone extractie uit bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de volumetrische kolf en laat deze afkoelen tot 25 graden Celsius bij kamertemperatuur. Voeg chromatografische methanol toe aan de 100 milliliter gemarkeerde lijn en vortex om twee minuten te mengen.

Pipetteer vervolgens één milliliter van het voorbereide extract in een volumetrische kolf van 100 milliliter. Voeg methanol toe aan de gemarkeerde lijn. Schud goed om goed te mengen en verkrijg de moederoplossing voor HPLC-injectie.

Voor de monsterfiltratie bereid een een-milliliter wegwerpspuit zonder naald en een 0,22 micrometer organisch-fase microporeus membraan voor. Aspireer 1,2 milliliter van de moederoplossing voor injectie in de spuit en filter de oplossing door deze langzaam door het membraan te duwen. Verzamel het filtraat in een buisje van twee milliliter met een binnenste insert en sluit het flesje stevig af met een dop.

Bereid mobiele fase A voor door 1000 milliliter ultrazuiver water te meten. Voeg 1,0 milliliter chromatografisch mierenzuur toe en meng gelijkmatig met een magnetische roeraar gedurende 10 minuten. Bereid vervolgens mobiele fase B voor door chromatografische methanol direct te gebruiken zonder extra behandeling.

Degas mobile fasen A en B op 40 kilohertz gedurende 15 minuten met behulp van afzonderlijke ultrasone ontgassingsunits. Verbind de ontgassde mobiele fasen in aparte oplosmiddelflessen met de overeenkomstige A- en B-leidingen van het HPLC-systeem. Gebruik een C18-kolom voor chromatografische scheiding.

Breng de kolom in evenwicht met methanol en water in een verhouding van 80 tot 20 gedurende 30 minuten met een debiet van 0,3 milliliter per minuut. Stel de kolomoventemperatuur in op 30 graden Celsius en verwarm 10 minuten van tevoren. Stel vervolgens de debiet in op 0,60 milliliter per minuut, het injectievolume op twee microliter, en de detectiegolflengte op 210 nanometer.

Daarna stel je het gradiënt-elusieprogramma in met de gepresenteerde voorwaarden. Voer massaspectrometrische detectie uit met een drievoudige quadrupool-massaspectrometer uitgerust met een elektrospray-ionisatiebron die in positieve ionisatiemodus werkt. Stel de druk van de vernevelaar in op 15 pond per vierkante inch, capillairspanning op 4.000 volt, gastemperatuur op 300 graden Celsius en de gasstroom op 11 liter per minuut.

Stel vervolgens de parameters in voor meerdere reactiemonitoring-ionparen. Om voorloperionen te identificeren, infuseer je direct individuele standaardoplossingen in MS2-scanmodus. Na methodevalidatie wordt de gegevensverzameling uitgevoerd in de meervoudige reactiemonitoringmodus.

Gebruik de geoptimaliseerde parameters, waaronder precursorion, productionovergangen, fragmentorspanning en botsingsenergie voor elke analyte zoals hier gepresenteerd. Start de kwalitatieve analysesoftware. Selecteer bestand en kies importeren data om alle verzamelde databestanden te importeren.

Controleer de pieksymmetrie en de consistentie van de retentietijd van de doelpieken in elk geëxtraheerd ionenchromatogram. Selecteer in de kwantificatiemodule MRM-transitie. Voer de voorloperion- en productionparen voor elk onderdeel in en extraheer de bijbehorende geëxtraheerde ionchromatogrammen.

Bereken het piekgebied voor kwantitatieve analyse. Alle drie de doel-tropaanalkaloïden werden binnen 20 minuten succesvol gescheiden onder de geoptimaliseerde HPLC-omstandigheden. De resolutie tussen scopolamine en anisodamine was 8,67.

Hoewel die tussen anisodamine en hyoscyamine 11,58 bereikte, overschreden alle resolutiewaarden aanzienlijk het basisscheidingscriterium van 1,5. Alle analyten vertoonden een goede lineariteit over een concentratiebereik van 0,014 tot 0,320 microgram per milliliter met correlatiecoëfficiënten groter dan 0,99. De gemiddelde herstelpercentages waren 101,44% voor scopolamine, 100,25% voor anisodamine en 99,56% voor hyoscyamine, met relatieve standaarddeviaties van respectievelijk 1,85%, 2,35% en 1,9%.

Kwantificering van drie tropaanalkaloïden in 10 Anisodus tanguticus-monsters toonde aan dat het scopolaminegehalte varieerde van 0,3667 milligram per gram in monster zes tot 1,0356 milligram per gram in monster zeven. Het anisominegehalte varieerde van 0,0269 milligram per gram in monster zes tot 0,3590 milligram per gram in monster 10. Het hyoscyaminegehalte varieerde van 0,2930 milligram per gram in monster twee tot 1,4989 milligram per gram in monster 10, met hogere niveaus waargenomen in monsters vier, zeven, negen en tien.

Dit protocol maakt snelle, nauwkeurige kwantificering van drie belangrijke tropaanalkaloïden mogelijk. De belangrijkste uitdaging is het waarborgen van instrumentprocedures en gestandaardiseerde monstervoorbereiding voor nauwkeurige metingen. Deze methode kan worden uitgebreid om andere metabolieten in Anisodus tanguticus te onderzoeken en te kwantificeren.