Name: Principes van site-specifieke recombinase (SSR) Technologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-29T12:11:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Leer de principes van site-specifieke recombinase-technologie voor geavanceerde genoomengineering met het Cre/lox-systeem. Deze methode maakt conditionele mutagenese mogelijk voor gerichte genmanipulatie in onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

principes van site-specifieke recombinase (ssr) technologie

Principles of Site-Specific Recombinase (SSR) Technology

Site-specific recombinase (SSR) technologie maakt de manipulatie van gen structuur te verkennen genfunctie en is uitgegroeid tot een integraal instrument van de moleculaire biologie. Site-specifieke recombinasen zijn eiwitten die zich binden aan verschillende DNA-doelsequenties. De Cre / lox systeem werd het eerst beschreven in bacteriofagen in de jaren 1980. Cre-recombinase is een type I topoisomerase die site-specifieke recombinatie van DNA katalyseert tussen de twee loxP (locus van de X-over P1) sites. De Cre / lox systeem vereist geen co-factoren. LoxP sequenties bevatten verschillende bindingsplaatsen voor Cre recombinases dat een directionele kernsequentie waar recombinatie en herschikking plaats omringen. Wanneer de cellen loxP sites bevatten en die de Cre recombinase, een recombinatie gebeurtenis plaatsvindt. Dubbelstrengs DNA wordt geknipt op beide loxP sites door het Cre recombinase, herschikt, en geligeerd (&quot;schaar en lijm&quot;). Producten van de recombinatie gebeurtenis is afhankelijk van de relatieve oriëntatie van de asymmetrische sequenties. SSR-technologie wordt vaak gebruikt als een instrument om genfunctie te verkennen. Hier is het gen van belang wordt geflankeerd door Cre doelsites loxP (&quot;floxed&quot;). Dieren worden vervolgens gekruist met dieren uiting van de Cre recombinase onder de controle van een weefsel-specifieke promotor. In weefsels die het Cre recombinase uitdrukken bindt aan doelsequenties en accijnzen van de floxed gen. Gecontroleerde gendeletie maakt het onderzoek naar gen-functie in specifieke weefsels en op verschillende tijdstippen. Analyse van de genen functie gebruik SSR-technologie --- voorwaardelijke mutagenese - heeft belangrijke voordelen ten opzichte van de traditionele knock-outs, waar gendeletie is vaak dodelijk.

De komst van site-specific recombinase (SSR) technologie en het Cre / lox systeem heeft geleid tot tal van ontwikkelingen in de moleculaire biologie, en heeft zichzelf bewezen als een waardevol instrument voor de beoordeling van gen-functie in transgene dieren. Dit interview bespreekt het mechanisme van de site van de specifieke recombinatie door cyclisatie recombinase (Cre) en hoe het gebruik van dit enzym heeft geleid tot de ontwikkeling van voorwaardelijke mutagenese, hetgeen aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele knock-out strategieën heeft.

Principes van site-specifieke recombinase (SSR) Technologie

Site-specifieke recombinase-technologie (SSR) maakt de manipulatie van de genstructuur mogelijk om genfuncties te onderzoeken en is een integraal instrument geworden binnen de moleculaire ...

Hallo, mijn naam is Frank Buchholz. Ik ben een groepsleider hier bij het Max PL Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. En ons werk wordt onderhouden.Ons werk bestaat uit twee aspecten. Het ene aspect heeft betrekking op RNA I-screening. Het andere aspect richt zich op de ontwikkeling van site-specifieke recombinasen voor geavanceerde genoommodificatie.Mijn achtergrond is dat ik een bioloog ben, een moleculair bioloog, en ik heb biologie gestudeerd. Vervolgens heb ik een PhD behaald aan de European Molecular Biology Laboratories in Heidelberg en daarna een postdoc gedaan in San Francisco aan de UCSF met Mike Bishop, waarbij ik werkte aan diermodellen voor leukemie. Het Max Planck Institute hier in Dresden probeert, laten we zeggen, ten minste twee verschillende aspecten te combineren, namelijk ontwikkelingsbiologie en celbiologie, in de poging om — ik denk dat men zou kunnen zeggen — als basis thema te begrijpen hoe cellen weefsels vormen.Dat is in wezen het algemene doel van het instituut hier in Ston. We werken in feite op twee gebieden. Het ene gebied betreft het uitvoeren van RNAi-screens om nieuwe functies van voorheen ongekarakteriseerde genen in biologische processen te identificeren.De andere richt zich op genomische engineering om technologieën te ontwikkelen die geavanceerde manipulatie van genomen mogelijk maken met behulp van site-specifieke recombinasen in het bijzonder. Hoewel site-specifieke recombinasen werden ontdekt, zou ik zeggen in de jaren tachtig — bijvoorbeeld werd de cre-recombinase waarmee wij werken in het begin van de jaren tachtig ontdekt. Het is feitelijk een bacteriofaageiwit. Het is dus oorspronkelijk afkomstig van een bacteriofaag, in feite een virus dat bacteriën infecteert.Het is dus zeer ver verwijderd van wat er nu wordt gebruikt, maar het werd zeer snel erkend dat deze enzymen zeer interessante functies kunnen vervullen die ook in andere organismen kunnen worden benut. Site-specifieke recombinases zijn eiwitten die aan DNA binden; ze binden specifiek aan een bepaalde DNA-sequentie, en wanneer ze aan deze doelsequenties binden, zijn ze in staat het DNA te knippen en vervolgens de sites te herindelen, waardoor ze in feite ook het proces van ligatie uitvoeren. Met deze site-specifieke recombinatie kunt u dus DNA-sequenties herindelen, vergelijkbaar met een schaar en lijm, waarmee u DNA-sequenties op een manier kunt samenvoegen die voorheen niet mogelijk was.Deze site-specifieke recombinasen, zoals ik al zei, werden oorspronkelijk ontdekt in bacteriën of bacteriofagen. Vervolgens werd getest of ze ook in andere organismen werkten. En interessant genoeg voerden ze hun functie ook in andere organismen uit.Als u bijvoorbeeld een site-specifieke recombinase-doelplaats in een organisme heeft ingebouwd, zullen deze enzymen hun functie vervullen. Een zeer prominente toepassing van deze site-specifieke recombinases is met name die van de enzymen die geen cofactoren nodig hebben, zoals de flp-recombinase of de cre-recombinase, die wij als uitgangspunt hebben gebruikt voor het werk waar we het vandaag over hebben. Zij werken zonder cofactoren.En als u deze tot expressie brengt in, in een, in een dier, bijvoorbeeld, of in cellen van een dier, dan kunnen ze de sequenties die ze herkennen in dit organisme vinden en daar ter plekke in feite knippen en plakken, en bepaalde sequenties excideren. Dus wat er is gedaan, of waar dit enzym waar is, is dat het zeer succesvol is gebruikt in zogenaamde conditionele mutagenese van muizen, bijvoorbeeld. Stel dat u een gen heeft waarvan u weet dat het een, een interessant gen is, en u wilt weten wat de functie van dit gen is.Een zeer prominent experiment is het maken van een zogenaamde knockout-muis. Voor degenen die dit onlangs hebben gezien: deze technologie is dit jaar zelfs beloond met de Nobelprijs, om in feite een gen-deletie in een muis uit te voeren. Soms stel je echter vast dat wanneer je een gen in een dier uitschakelt, dit een essentieel gen is en de muis zeer vroeg tijdens de embryogenese zal sterven.Nu geeft dit aan dat uw gen zeer belangrijk is, maar het vertelt u nog niet echt wat de functie is. Een zeer gangbare methode om dit tegenwoordig uit te zoeken, is het uitvoeren van een zogenaamde conditionele knockout. Hierbij flankeert u het gen van belang met targetlocaties voor deze site-specifieke recombinases.Dit betekent dat in deze muizen het gen tot expressie zal komen, net als bij wild-type muizen. Maar wanneer u deze muizen kruist met een muis die de CRE-recombinase tot expressie brengt, bijvoorbeeld onder een weefselspecifieke promoter, kunt u het gen van interesse verwijderen in alleen specifieke cellen die u vooraf kunt definiëren op basis van waar de recombinase tot expressie komt. Uit deze experimenten weten we ook dat deze recombinaties zeer efficiënt kunnen zijn in het verwijderen van sequenties uit volledige organismen.En dit was een voorwaarde voor ons idee om een recombinase te ontwikkelen die knipt op de locatie die wij vooraf hadden bepaald, wat tot nu toe een van de belangrijkste beperkingen was bij de verdere ontwikkeling van de site-specifieke recombinase: men moest de herkenningsdoelsequentie in het genoom van een cel of organisme engineeringen dat men wilde gebruiken. Daarom vroegen we ons af of we deze barrière konden doorbreken.In essentie wordt er gebruikgemaakt van moleculaire evolutie. Op dit moment worden site-specifieke recombinasen, naar mijn weten, niet gebruikt voor therapie. Omdat, zoals ik al zei, er in de mens geen targetsite aanwezig is die herkend zou worden door een van de recombinasen die in de natuur voorkomen.Ze moeten dus eerst worden aangepast om bruikbaar te zijn in een therapeutische setting. We staan nu pas aan het begin van het onderzoek naar de vraag of dit überhaupt mogelijk is. De tijd zal uitwijzen of we deze enzymen daadwerkelijk kunnen ontwikkelen voor therapeutisch gebruik en of dat haalbaar is of niet.

principles-of-site-specific-recombinase-ssr-technology

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De huidige HIV-1-strategieën handelen om de virale levenscyclus te onderdrukken, maar niet werkelijk uit te roeien infectie. Hier tonen we aan dat een aangelegde recombinase efficiënt kunnen accijnzen geïntegreerd HIV-1 proviraal DNA van het genoom van de geïnfecteerde cellen.

Interview: HIV-1 proviraal DNA Excisie Met behulp van een Evolved recombinase

De gist mitochondriale nucleoid eiwit, Mgm101, is een rad52-soort recombinatie eiwit dat grote oligomere ringen vormt. Een protocol wordt beschreven aan oplosbare recombinant Mgm101 bereiden met behulp van de maltosebindingseiwit (MBP)-tagging strategie in combinatie met kationuitwisseling en size exclusion chromatografie.

Bereiding van de Mgm101 recombinatie eiwit met MBP-based Tagging strategie

Gene targeting-methodologieën kunnen worden gebruikt om transgene muizen te genereren met knockout-, knock-in- en getaggede allelen. Hier beschrijven we een verbeterde methode van recombineren in E. coli, die we 'subklonen plus invoegen' noemen, en die kan worden gebruikt om snel aangepaste gene targeting-vectoren te genereren.

Subkloning Plus Insertion (SPI) - A Novel recombineering Methode voor de snelle bouw van gene targeting vectoren

De lineaire covalent gesloten (LCC) DNA-minivector (DNA-ministring) is een niet-viraal genoverdrachtsvector dat een hoge transfectie-efficiëntie biedt en relevant is voor elke DNA-overdrachtstoepassing. Het productiesysteem is eenvoudig, snel en schaalbaar in vivo. Het volgende protocol biedt visuele stapsgewijze instructies voor de productie van DNA-ministrings.

Productie van Dubbelstrengs DNA Ministrings

Hier melden wij een snelle en efficiënte gen-editing methode op basis van RMCE in de AAVS1 locus van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), die verbetert eerder beschreven systemen. Met deze techniek kan isogene lijnen snel en betrouwbaar worden gegenereerd voor goede vergelijkende studies vergemakkelijkt-gemedieerde transgenese onderzoek met hPSCs.

Snelle en efficiënte generatie van recombinant humaan pluripotente stamcellen door Recombinase-gemedieerde Cassette Exchange in de<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het identificeren van homologe recombinatie gebeurtenissen die hebben plaatsgevonden in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern blotting en/of PCR. Deze methode wordt geïllustreerd door de generatie van nonmuscle myosin II genetische vervanging Muismodellen met behulp van traditionele embryonale stamcel gebaseerde homologe recombinatie-gemedieerde targeting technologie.

Identificatie van homologe recombinatie gebeurtenissen in muis embryonale stamcellen met behulp van Southern Blotting en de Kettingreactie van de Polymerase

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Hier het verslag van de generatie van Tre recombinase door middel van gerichte, moleculaire evolutie. Tre recombinase herkent een vooraf gedefinieerde doelsequentie binnen het LTR-sequenties van het HIV-1 provirus, resulterend in de excisie en uitroeiing van de provirus van geïnfecteerde menselijke cellen. Terwijl het nog in de kinderschoenen staat, zal de gerichte moleculaire evolutie kan de creatie van aangepaste enzymen die zal dienen als instrument van de moleculaire chirurgie en...

Moleculaire evolutie van de Tre recombinase

Voordat u een operatie moet er een nieuwe chirurg zijn opleiding in basis chirurgische technieken en concepten. In dit artikel zal basic chirurgische overwegingen met een nadruk op knaagdieren.

Principes van Knaagdieren Chirurgie voor de Nieuwe Surgeon

Leer de principes van site-specifieke recombinase-technologie voor geavanceerde genoomengineering met het Cre/lox-systeem. Deze methode maakt conditionele mutagenese mogelijk voor gerichte genmanipulatie in onderzoek.

Principes van site-specifieke recombinase (SSR) Technologie

Meer video's verkennen