Name: Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Leer mitochondriale complexe activiteit analyseren in menselijke embryonale stamcellen met in-gel activiteitstests. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale functie en stamcelbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden momenteel ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken dr. Carla Koehler (UCLA) en leden van het Koehler laboratorium voor het verstrekken van advies en inzicht in deze en aanvullende studies.

Hoge resolutie Clear native Gel Electophoresis (hrCNE) voor mitochondriële complex In-Gel Activity Assays Menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) werden gehouden op een monolaag van ˠ-bestraalde of mitomycine C-behandelde muis embryonale fibroblasten (MEF), daarna overgestapt naar groei op Matrigel gedurende 5 dagen in de MEF-geconditioneerd medium met behulp van standaard voorwaarden. Voor het verwijderen van verontreiniging MEFs, werden hESC &#39;s opnieuw uitgeplaat op Matrigel en gekweekt in MEF-geconditioneerd medium voor een extra 3 dagen. Immunofluorescentie microscopie voor pluripotentie markers Oct-4 en SSEA-4 werd gebruikt om het gebrek aan differentiatie hESC te bevestigen. <ol><li> Was de cellen met warm 1x PBS, pH 7,4, gevolgd door behandeling met trypsine (1ml van 1x per trypsine goed in een 6-wells plaat) gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg een gelijk volume van verse trypsine-remmer (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Oogst cellen en centrifugeer bij 200 g, 5 min, kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer gepelleteerd cellen in 0,8 - 1.7ml (op basis van de grootte van de cel pellet) van ijskoude mitochondria isolatie buffer (83mm sacharose; 6.6mM imidazol / HCl, pH 7,0) met een vers bereide &#39;proteaseremmer Cocktail. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Dounce cellen met een homogenisator (~ 40 tot 50 slagen). Vlek een hoeveelheid van de dounced cellen met trypan blauw om te controleren op volledigheid van homogenisering met behulp van een lichtmicroscoop. </li><li> Centrifugeer bij 20.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C om een ​​ruwe mitochondriaal pellet dat bevat ook kernen en grotere cel fragmenten te verkrijgen. Giet Verwijder de bovenstaande vloeistof en wegen de neergeslagen ruwe mitochondriale pellet. De pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C volgende instant bevriezen in vloeibare stikstof of dit een stopplaats. LET OP: Differentiële centrifugering of andere gradiënt-gebaseerde procedures kunnen worden gebruikt voor het isoleren en het verzamelen van een pure mitochondriale membraan fractie. Zie ref. 4 voor meer informatie. Deze alternatieve benadering levert het mitochondriale complex activiteit per mg van de mitochondriale eiwit in plaats van complexe activiteit per mg van de cel gewicht of aantal cellen. De concentratie van mitochondriale eiwitten zal moeten worden bepaald na zuivering om deze vergelijking te maken. Ook kan een andere isolatie buffer nodig zijn voor deze aanpak. Voor solubilisatie van de zuivere mitochondriale membraan fractie, zie de opmerking volgende stap 6 hieronder. </li><li> Solubiliseren de ruwe mitochondriale pellet op ijs en door vortexen met ijskoud solubilisatie buffer (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2mm 6-aminohexanoic zuur). 6-aminohexanoic zuur kan worden vervangen door de 1x proteaseremmer Cocktail. Het gebruik van 35μl solubilisatie buffer per 20mg van pellet gewicht. Voeg 20μl van 10% w / v digitonine per 20 mg pellet gewicht en meng door de knop de buis. Incubeer gedurende 5-10 minuten op het ijs. Dodecyl-BD-maltoside of triton X-100 kan worden vervangen voor digitonine aan de eiwitten lossen. De keuze van het wasmiddel en de hoeveelheid kan invloed hebben op de vorming van supercomplexes of multimere vormen van mitochondriale complexen. Voor meer informatie, zie ref.1. OPMERKING: De hoeveelheid wasmiddel nodig is om een zuivere mitochondriale membraan fractie solubiliseren komt overeen met een detergent / eiwit-verhouding gewicht variërend van twee-6g / g. De optimale verhouding tot mitochondriale membranen solubiliseren is 2,5 g / g voor dodecyl-BD-maltoside, 3g / g voor triton X-100, en 6g / g voor digitonine. </li><li> Centrifugeer de opgeloste pellet bij 100.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Vang het heldere supernatant. </li><li> Voeg laadbuffer tot een uiteindelijke 5% w / v glycerol en 0,01% w / v Ponceau S (gebruik een 50% w / v glycerol, 0,1% w / v Ponceau S laadbuffer voorraad-oplossing). </li><li> Laad gel putten met een volume dat 20-40mg van de ruwe mitochondriale pellet per rijstrook bevat. Gebruik een acrylamide gradiënt gel (4 -13%) met een 3,5% stacking gel. LET OP: Gel elektroforese voorbereiding en voorwaarden: Voor de gel bereiding, gebruik maken van een acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 mix als volgt: 48 g van acrylamide en 1,5 g van bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Waar T is totale concentratie van AA en bisAA en C is het percentage van de crosslinker (bisAA) om de totale monomeer). Gel buffer (3 &#39;): 1.5M 6-aminohexanoic zuur; 75mm imidazool, pH 7,0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> Gradiënt gel: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> Stapelen gel: </td><td> 3,5% </td></tr><tr><td> AA / bisAA 3 mix </td><td> 2 ml </td><td> 6,5 ml </td><td></td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td> Gel buffer 3 &#39; </td><td> 8,3 ml </td><td> 8,3 ml </td><td></td><td> 2,7 ml </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td></td><td> 5 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14,7 ml </td><td> 5 ml </td><td></td><td> 4,7 ml </td></tr><tr><td> Totale volume </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td></td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> 10% APS </td><td> 139 ul </td><td> 125 ul </td><td></td><td> 67 pl </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 pl </td><td> 12,5 ul </td><td></td><td> 6,7 pl </td></tr></tbody></table> Anode buffer: 25mm imidazol / HCl, pH 7,0 Kathode buffer: 50mm Tricine, 7.5mm imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0,05% w / v deoxycholaat, pH 7,0 Giet en uitvoeren gels in een koude kamer (4-7 ° C). De gebruikte aanvankelijke voltage is 100V. Wanneer het monster heeft de stacking gel ingevoerd, wordt de spanning verhoogd tot 500 V met de huidige beperkte tot 15 mA (voor 0.15 &quot;14&quot; 14-cm gels). Elektroforese is gestopt na 3-4 uur als de scherpe lijn van de rode kleurstof Ponceau S de gel front nadert. Als alternatief kan een gel &#39;s nachts worden uitgevoerd met een constante spanning bij 70-100V. <ol><li> In-gel-activiteit assays. De tijd van incubatie voor elke assay afhankelijk van de efficiëntie van eiwitten oplosbaar en de hoeveelheid van het materiaal geladen per putje. Complexen I, IV en V meestal opbrengst sterkere signalen dan de complexen II en III. </li></ol> Complex I (CI) Incubeer de gel plak met CI buffer (5mm Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH, 2.5mg/ml NBT) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CI buffer: Voeg per 100 ml van 5 mm Tris-HCl, pH 7,4: 0.01g NADH 0,25 g NBT Bevestig de gel in 50% methanol en 10% azijnzuur voor 15-45 minuten. De vaste gel wordt bewaard in 10% azijnzuur. Complex II (CII) Incubeer de gel plak met CII buffer (20mm natrium-succinaat, 0.2mm fenazine methasulfate; 2.5mg/ml NBT, 5mM Tris-HCl pH 7,4) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CII buffer: Voeg per 100 ml van 5 mm Tris-HCl, pH 7,4: 200μl 1M natrium-succinaat 80μl fenazine methasulfate (250mm PMS opgelost in DMSO) 0,25 g NBT Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I Complex III (CIII) Incubeer de gel plak met CIII buffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,2; 0,05% 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CIII buffer: Voeg per 100 ml van 50 mM natrium-fosfaat, pH 7.2: 50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I Complex IV (CIV) Incubeer de gel plak met CIV buffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,2; 0,05% 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), 50μM paard hart cytochroom c) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CIV buffer: Voeg per 100 ml van 50 mM natrium-fosfaat, pH 7.2: 50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 0.1g paard hart cytochroom c Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I Complex V (CV) Incubeer de gel plak met CV buffer (35mm Tris-base, 270mm glycine, pH 8,3 bij 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CV-buffer: Per 100 ml van de oplossing toe te voegen: <table border="0"><tbody><tr><td> Tris-base </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> Geen behoefte om pH (moet 8,3) aan te passen - gebruik geen zuur of base. Filter, en voeg <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> Bevestig de gel in 50% methanol gedurende 30 minuten en transfer naar het water.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

In deze video, hebben we beschreven de extractie van de mitochondriale eiwitcomplexen uit menselijke embryonale stamcellen, hun scheiding door de hoge resolutie heldere inheemse gelelektroforese (hrCNE), en de daaropvolgende analyse door in-gel katalytische activiteit assays. hrCNE lost mitochondriale membraan eiwit complexen met een resolutie vergelijkbaar met die van autochtone blauwe gel elektroforese en is superieur voor in-gel-activiteit assays. Deze techniek kan niet alleen gebruikt ter mitochondriale ademhaling complexen IV te kwanti...

<table><tbody><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>pH aanpassen naar 8,0 met NaOH</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M Natriumsuccinaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>0,1M Natiumfosfaatbuffer pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 en BP329-1</td><td>Meng 68,4 ml van 1M Na2HPO4 en 31,6 ml van 1M NaH2PO4 om 0,1M natiumfosfaatbuffer met pH 7,2 bij 25 C te bereiden</td></tr><tr><td>1M Tricine, pH 7,0 (aangepast met NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>bewaren bij 4 C</td></tr><tr><td>1M imidazole/HCl, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>bewaren bij 4 C</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20% (m/v) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Opgelost in water. Bewaar aliquoten van 1 ml bij &amp;#8211;20 C.</td></tr><tr><td>10% (m/v) digitonine (&amp;gt;50% zuiverheid, gebruikt zonder herkristallisatie)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Opgelost in water. Bewaar aliquoten van 0,1&amp;#8211;1 ml bij &amp;#8211;20 C. Moet voor gebruik worden opgewarmd tot 95 C.</td></tr><tr><td>2M 6-aminohexaanzuur</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>bewaren bij 4 C</td></tr><tr><td>10x Ponceau S/glycerol stamoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 en G6279-1L</td><td>0,1% Ponceau S, 50% glycerol, (m/v) in water.</td></tr><tr><td>10% m/v natriumdeoxycholaat</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Opgelost in water. Moet tegen licht worden beschermd. pH aanpassen naar 7,0 met HCl, filteren en bewaren bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>250 mM fenazine methasulfaat (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>Opgelost in DMSO en in aliquoten verdeeld. Bewaren bij &amp;#8211;20 C.</td></tr><tr><td>Nitro-blauw tetrazolium (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-trifosfaat dinatriumzout (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Graad I, minimaal 99%</td></tr><tr><td>beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) gereduceerde vorm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Cytochroom c uit paardenhart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x protease-inhibitorcocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Bewaren bij &amp;#8211; 20 C.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypaanblauw kleuring 0,4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x Trypsine (0,5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-inhibitor</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

peilen naar mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondriën zijn cytoplasmatische organellen die een primaire rol in de cellulaire metabolisme en homeostase hebben, de regulatie van de cel signaleringsnetwerk, en geprogrammeerde celdood. Mitochondria produceren ATP, reguleren van de cytoplasmatische redox staat en Ca2 + saldo, catabolize vetzuren, synthese van heem, nucleotiden, steroïde hormonen, aminozuren, en helpen monteren ijzer-zwavel clusters in eiwitten. Mitochondriën hebben ook een essentiële rol in de productie van warmte. Mutaties van het mitochondriaal genoom oorzaak verschillende soorten van de menselijke aandoening. De accumulatie van mtDNA mutaties correleert met het ouder worden en is vermoedelijk een belangrijke rol in de ontwikkeling van kanker te hebben. Door hun uiterst belangrijke rol in alle celtypes, moet de functie van mitochondriën ook kritisch zijn voor stamcellen. Belangrijke vooruitgang geboekt in onze kennis van stamcellen levensvatbaarheid, proliferatie en differentiatie capaciteit. Maar de functionele activiteit van stamcellen, in het bijzonder hun energie-status, was nog niet in detail bestudeerd. Bijna niets is bekend over de mitochondriale eigenschappen van menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en hun gedifferentieerde voorloper nageslacht. Een manier om te begrijpen en evalueren van de rol van mitochondriën in hESC functie en ontwikkelingsmogelijkheden is om rechtstreeks de activiteit van de mitochondriale ademhaling complexen. We beschrijven hier een hoge resolutie duidelijk inheemse gelelektroforese en vervolgens in de gel-activiteit visualisatie als een methode voor het analyseren van de vijf ademhalingsketen complexen van hESC &#39;s.

In deze video laten wij u zien hoe de mitochondriale ademhalingsketen-complexen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van gel-activiteit assays.

Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Mitochondriën zijn cytoplasmatische organellen die een primaire rol spelen bij het cellulaire metabolisme en de homeostase, de regulatie van het cel-signaleringsnetwerk en ...

Mitochondriën vervullen talrijke rollen in de celphysiologie, van metabolisme en energieproductie tot geprogrammeerde celdood en de synthese van steroïdhormonen. Ondanks het belang van mitochondriën voor zowel fundamentele cellulaire functies als ziektebeelden, is er zeer weinig bekend over de functie van mitochondriën in menselijke embryonale stamcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen. In deze video laten we u zien hoe de complexen van de mitochondriale ademhalingsketen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van Ingel-activiteitsassays.Hallo, ik ben Ivan OV van het laboratorium van Michael Tetel van de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde aan de University of California Los Angeles. Vandaag laten we u een procedure zien voor het beoordelen van de functie van mitochondriële respiratoire complexen in menselijke embryonale stamcellen. Deze in-gel activiteitsanalyse omvat de isolatie van ruwe mitochondriële fracties uit menselijke embryonale stamcellen, de scheiding van mitochondriële complexen van het oxidatieve fosforyleringssysteem met hoge resolutie clear native polyacrylamidegelelektroforese en de daaropvolgende in-gel activitei

probing-for-mitochondrial-complex-activity-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk...

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

De effecten van activering van eiwit kinase C (PKC) isozymen op mitochondriële functies geassocieerd met ademhaling en oxidatieve fosforylering en cellevensvatbaarheid beschreven. De aanpak past adenovirale techniek om selectief PKC overexpressie isozymen in primaire celkweek en verschillende assays voor mitochondriële functies en energie status van de cel te bepalen.

Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.

Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering

Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Verspreiding van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen

Leer mitochondriale complexe activiteit analyseren in menselijke embryonale stamcellen met in-gel activiteitstests. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale functie en stamcelbiologie.

Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Meer video's verkennen