Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Mitochondria hebben tal van rollen in de celfysiologie, van metabolisme en energieproductie tot het programmeren van celdood en de synthese van steroïde hormonen. Ondanks het belang van mitochondria in zowel fundamentele cellulaire functies als ziekten, is er heel weinig bekend over de functie van mitochondria in menselijke embryonale stamcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen. In deze video laten we u zien hoe de mitochondriale ademhalingsketencomplexen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van Ingel-activiteitsassays.

Hallo, ik ben Ivan OV van het laboratorium van Michael Tetel in het Departement Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde aan de University of California Los Angeles. Vandaag laten we u een procedure zien voor het beoordelen van mitochondriale ademhalingscomplexfunctie in menselijke embryonale stamcellen. Deze in gel-activiteitsbeoordelingprocedure omvat isolatie van ruw mitochondriaal palet uit menselijke embryonale stamcellen, scheiding van mitochondriale complexen van het exudatieve fosforylatiesysteem met hogere resolutie heldere native polyacrylamide-gelelektroforese en vervolgens in gel-activiteitss.

Dus laten we beginnen. De eerste stap in deze procedure is het isoleren van mitochondria uit menselijke embryonale stamcellen. Voor deze assay gebruiken we menselijke embryonale stamcellen die zijn gekweekt op een matrigel-bedekte plaat in een feeder-vrije conditie.

Om mitochondria uit onze menselijke embryonale stamcellen te verzamelen, beginnen we door ze te wassen met warme één XPDS pH 7.4 en vervolgens de cellen vijf minuten lang te trypsiniseren. U kunt één mil van één x trypsine per put in een zesputplaat gebruiken. Na vijf minuten kunt u de reactie stoppen door een gelijk volume verse trypsine-remmer één milligram per mil in één XPBS toe te voegen en de cellen te oogsten.

De verzamelde cellen worden vervolgens gecentrifugeerd bij 200 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na het draaien, gooit u de supernatant weg en hervat u, suspendeert u de gepelletiseerde cellen in 0,8 tot 1,7 milliliter ijskoud mitochondriaal isolatiebuffer met een vers bereide cocktail van één x proteaseremmer. Hoeveel buffer u gebruikt, hangt af van de grootte van de cellenpellet die u krijgt. Nadat het pellet is geresuspendeerd, incubeert u het ongeveer 10 minuten op ijs.

Na de incubatie op we nemen we de cellen af met een homogenisator, dit kan ongeveer 40 tot 50 slagen duren. We kunnen controleren of de homogenisatie compleet is door een aliquot van de DOD-cellen te kleuren met trianblauw en door een lichtmicroscoop te kijken. Het zou er ongeveer zo uit moeten zien.

Dit is de eerste opname na 50 slagen met een downs. Dit is de tweede opname na 80 slagen met een downs. Nadat de cellen gehomogeniseerd zijn, centrifugeren we ze bij 20.000 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden C. Dit geeft ons een ruw mitochondriaal pellet, dat ook kernen en grotere celfragmenten zal bevatten.

Voor het verzamelen van het pellet, moeten we het verzamelbuisje wegen om het gewicht van het volgende pellet te schatten, de supernatant weggeven en weggooien, en vervolgens het geprecipiteerde ruwe mitochondriaal pellet wegen. Door het gewicht van het buisje op dit punt af te trekken, kan men doorgaan met het solubiliseren van het pellet, wat in de volgende stap zal worden getoond. Om het ruwe mitochondriale pellet te solubiliseren, houden we het pellet op ijs en vortexen met 35 microliter ijskoud solubilisatieferf.

Voor elke 20 milligram pellet dat we hebben, worden gedetailleerde informatie over de bufferverbindingen genoemd in het bijbehorende schriftelijke protocol. Na het vortexen en toevoegen van solubilisatieferf en voordat we digitoine toevoegen, brengen we het geresuspendeerde pellet over in een buis die geschikt is voor hogesnelheidscentrifugeren, en vervolgens voegen we 20 microliter 10% gewicht per volume digitoine toe voor 20 milligram pelletgewicht en mengen door het buisje te schudden nadat het grondig is gemengd. Incubeer het mitochondriale pellet vijf tot 10 minuten op ijs. Doil beta D multiside of DDM of Triton X 100 kan worden vervangen voor digitoine om eiwitten te solubiliseren.

De keuze van het detergent en de hoeveelheid ervan kunnen de vorming van supracomplexen of multimere vormen van mitochondriale complexen beïnvloeden na de incubatie op ijs. En zodra het pellet is solubiliseerd, centrifugeren we het bij honderdduizend keer G gedurende 15 minuten bij vier graden C, we zullen dan de heldere supernatant verzamelen. We zijn nu klaar om de supernatant voor te bereiden om op onze gradiëntgel te draaien voor native gradiëntgelelektroforese van mitochondria.

We raden aan om een acrylamidegradiëntgel van vijf tot 13% te gebruiken met een 3,5% stackinggel. Om de gel te bereiden, zullen we een acrylamide bisacrylamide-mix gebruiken zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Acrylamide bisacrylamide-oplossing wordt van tevoren bereid en bewaard bij vier graden Celsius op een donkere plaats.

Acrylamide en bisacrylamide zijn giftige chemicaliën, zowel in poedervorm als in vloeibare vorm, dus speciale aandacht moet worden besteed wanneer u ermee werkt. We combineren de acrylamide bisacrylamide-oplossing met een aliquot van drie x gelbuffer, bestaande uit 1,5 molair zes amino hexanoic zuur en 75 millimolar ole op pH 7,0. De hoeveelheid acrylamide bisacrylamide-oplossing die we aan de buffer toevoegen, hangt af van het percentage gel dat we maken om de gradiëntgel te maken.

We zullen een 4% mix en een 13% mix maken, en de stackinggel zal een 3,5% mix zijn. Vergeet niet glycerol toe te voegen aan de 13% mix. Wanneer alle drie de mengsels klaar zijn, voegen we een geschikte hoeveelheid ammoniumpersulfaat en temid toe aan de mengsels en gieten de mengsels in een gradiëntvormende gietkamer.

Het linkergedeelte van de kamer bevat de 5% mix. Het rechterdeel van de kamer bevat de 13% mix in een kleine magnetische roerstaaf. We beginnen het gel te gieten door het rechterdeel van de kamer te openen.

Dan openen we onmiddellijk het linkergedeelte van de kamer en laten de 5% oplossing mengen met een 13% oplossing om de gradiënt te maken. We voegen een kleine hoeveelheid isopropanol toe aan