Name: Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:21:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Leer mitochondriale complexe activiteit analyseren in menselijke embryonale stamcellen met in-gel activiteitstests. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale functie en stamcelbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden momenteel ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken dr. Carla Koehler (UCLA) en leden van het Koehler laboratorium voor het verstrekken van advies en inzicht in deze en aanvullende studies.

Hoge resolutie Clear native Gel Electophoresis (hrCNE) voor mitochondriële complex In-Gel Activity Assays Menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) werden gehouden op een monolaag van ˠ-bestraalde of mitomycine C-behandelde muis embryonale fibroblasten (MEF), daarna overgestapt naar groei op Matrigel gedurende 5 dagen in de MEF-geconditioneerd medium met behulp van standaard voorwaarden. Voor het verwijderen van verontreiniging MEFs, werden hESC &#39;s opnieuw uitgeplaat op Matrigel en gekweekt in MEF-geconditioneerd medium voor een extra 3 dagen. Immunofluorescentie microscopie voor pluripotentie markers Oct-4 en SSEA-4 werd gebruikt om het gebrek aan differentiatie hESC te bevestigen. <ol><li> Was de cellen met warm 1x PBS, pH 7,4, gevolgd door behandeling met trypsine (1ml van 1x per trypsine goed in een 6-wells plaat) gedurende 5 minuten. </li><li> Voeg een gelijk volume van verse trypsine-remmer (1mg/ml in 1x PBS, pH 7,4). Oogst cellen en centrifugeer bij 200 g, 5 min, kamertemperatuur. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer gepelleteerd cellen in 0,8 - 1.7ml (op basis van de grootte van de cel pellet) van ijskoude mitochondria isolatie buffer (83mm sacharose; 6.6mM imidazol / HCl, pH 7,0) met een vers bereide &#39;proteaseremmer Cocktail. Incubeer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Dounce cellen met een homogenisator (~ 40 tot 50 slagen). Vlek een hoeveelheid van de dounced cellen met trypan blauw om te controleren op volledigheid van homogenisering met behulp van een lichtmicroscoop. </li><li> Centrifugeer bij 20.000 g gedurende 10 min bij 4 ° C om een ​​ruwe mitochondriaal pellet dat bevat ook kernen en grotere cel fragmenten te verkrijgen. Giet Verwijder de bovenstaande vloeistof en wegen de neergeslagen ruwe mitochondriale pellet. De pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C volgende instant bevriezen in vloeibare stikstof of dit een stopplaats. LET OP: Differentiële centrifugering of andere gradiënt-gebaseerde procedures kunnen worden gebruikt voor het isoleren en het verzamelen van een pure mitochondriale membraan fractie. Zie ref. 4 voor meer informatie. Deze alternatieve benadering levert het mitochondriale complex activiteit per mg van de mitochondriale eiwit in plaats van complexe activiteit per mg van de cel gewicht of aantal cellen. De concentratie van mitochondriale eiwitten zal moeten worden bepaald na zuivering om deze vergelijking te maken. Ook kan een andere isolatie buffer nodig zijn voor deze aanpak. Voor solubilisatie van de zuivere mitochondriale membraan fractie, zie de opmerking volgende stap 6 hieronder. </li><li> Solubiliseren de ruwe mitochondriale pellet op ijs en door vortexen met ijskoud solubilisatie buffer (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2mm 6-aminohexanoic zuur). 6-aminohexanoic zuur kan worden vervangen door de 1x proteaseremmer Cocktail. Het gebruik van 35μl solubilisatie buffer per 20mg van pellet gewicht. Voeg 20μl van 10% w / v digitonine per 20 mg pellet gewicht en meng door de knop de buis. Incubeer gedurende 5-10 minuten op het ijs. Dodecyl-BD-maltoside of triton X-100 kan worden vervangen voor digitonine aan de eiwitten lossen. De keuze van het wasmiddel en de hoeveelheid kan invloed hebben op de vorming van supercomplexes of multimere vormen van mitochondriale complexen. Voor meer informatie, zie ref.1. OPMERKING: De hoeveelheid wasmiddel nodig is om een zuivere mitochondriale membraan fractie solubiliseren komt overeen met een detergent / eiwit-verhouding gewicht variërend van twee-6g / g. De optimale verhouding tot mitochondriale membranen solubiliseren is 2,5 g / g voor dodecyl-BD-maltoside, 3g / g voor triton X-100, en 6g / g voor digitonine. </li><li> Centrifugeer de opgeloste pellet bij 100.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Vang het heldere supernatant. </li><li> Voeg laadbuffer tot een uiteindelijke 5% w / v glycerol en 0,01% w / v Ponceau S (gebruik een 50% w / v glycerol, 0,1% w / v Ponceau S laadbuffer voorraad-oplossing). </li><li> Laad gel putten met een volume dat 20-40mg van de ruwe mitochondriale pellet per rijstrook bevat. Gebruik een acrylamide gradiënt gel (4 -13%) met een 3,5% stacking gel. LET OP: Gel elektroforese voorbereiding en voorwaarden: Voor de gel bereiding, gebruik maken van een acrylamide / bis-acrylamide (AA / bisAA) 3 mix als volgt: 48 g van acrylamide en 1,5 g van bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Waar T is totale concentratie van AA en bisAA en C is het percentage van de crosslinker (bisAA) om de totale monomeer). Gel buffer (3 &#39;): 1.5M 6-aminohexanoic zuur; 75mm imidazool, pH 7,0 </li></ol><table style="padding-left: 60px;" border="0"><tbody><tr><td> Gradiënt gel: </td><td> 4% </td><td> 13% </td><td> Stapelen gel: </td><td> 3,5% </td></tr><tr><td> AA / bisAA 3 mix </td><td> 2 ml </td><td> 6,5 ml </td><td></td><td> 0,6 ml </td></tr><tr><td> Gel buffer 3 &#39; </td><td> 8,3 ml </td><td> 8,3 ml </td><td></td><td> 2,7 ml </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td></td><td> 5 g </td><td></td><td></td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 14,7 ml </td><td> 5 ml </td><td></td><td> 4,7 ml </td></tr><tr><td> Totale volume </td><td> 25 ml </td><td> 25 ml </td><td></td><td> 8 ml </td></tr><tr><td> 10% APS </td><td> 139 ul </td><td> 125 ul </td><td></td><td> 67 pl </td></tr><tr><td> TEMED </td><td> 14 pl </td><td> 12,5 ul </td><td></td><td> 6,7 pl </td></tr></tbody></table> Anode buffer: 25mm imidazol / HCl, pH 7,0 Kathode buffer: 50mm Tricine, 7.5mm imidazol / HCl, 0,02% w / v dodecyl-BD-maltoside, 0,05% w / v deoxycholaat, pH 7,0 Giet en uitvoeren gels in een koude kamer (4-7 ° C). De gebruikte aanvankelijke voltage is 100V. Wanneer het monster heeft de stacking gel ingevoerd, wordt de spanning verhoogd tot 500 V met de huidige beperkte tot 15 mA (voor 0.15 &quot;14&quot; 14-cm gels). Elektroforese is gestopt na 3-4 uur als de scherpe lijn van de rode kleurstof Ponceau S de gel front nadert. Als alternatief kan een gel &#39;s nachts worden uitgevoerd met een constante spanning bij 70-100V. <ol><li> In-gel-activiteit assays. De tijd van incubatie voor elke assay afhankelijk van de efficiëntie van eiwitten oplosbaar en de hoeveelheid van het materiaal geladen per putje. Complexen I, IV en V meestal opbrengst sterkere signalen dan de complexen II en III. </li></ol> Complex I (CI) Incubeer de gel plak met CI buffer (5mm Tris-HCl, pH 7,4; 0.1mg/ml NADH, 2.5mg/ml NBT) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CI buffer: Voeg per 100 ml van 5 mm Tris-HCl, pH 7,4: 0.01g NADH 0,25 g NBT Bevestig de gel in 50% methanol en 10% azijnzuur voor 15-45 minuten. De vaste gel wordt bewaard in 10% azijnzuur. Complex II (CII) Incubeer de gel plak met CII buffer (20mm natrium-succinaat, 0.2mm fenazine methasulfate; 2.5mg/ml NBT, 5mM Tris-HCl pH 7,4) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CII buffer: Voeg per 100 ml van 5 mm Tris-HCl, pH 7,4: 200μl 1M natrium-succinaat 80μl fenazine methasulfate (250mm PMS opgelost in DMSO) 0,25 g NBT Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I Complex III (CIII) Incubeer de gel plak met CIII buffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,2; 0,05% 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CIII buffer: Voeg per 100 ml van 50 mM natrium-fosfaat, pH 7.2: 50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I Complex IV (CIV) Incubeer de gel plak met CIV buffer (50 mM natriumfosfaat, pH 7,2; 0,05% 3,3 &#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB), 50μM paard hart cytochroom c) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CIV buffer: Voeg per 100 ml van 50 mM natrium-fosfaat, pH 7.2: 50mg diaminobenzidine tetrahydrochloride 0.1g paard hart cytochroom c Bevestig de gel als beschreven voor het Complex I Complex V (CV) Incubeer de gel plak met CV buffer (35mm Tris-base, 270mm glycine, pH 8,3 bij 25 ° C, 14mm MgSO 4, 0,2% w / v Pb (NO 3) 2, 8mm ATP) bij kamertemperatuur gedurende enkele uren. CV-buffer: Per 100 ml van de oplossing toe te voegen: <table border="0"><tbody><tr><td> Tris-base </td><td> 0.424g </td></tr><tr><td> Glycine </td><td> 2.026g </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> 0.345g </td></tr><tr><td> Pb (NO 3) 2 </td><td> 0.29g </td></tr></tbody></table> Geen behoefte om pH (moet 8,3) aan te passen - gebruik geen zuur of base. Filter, en voeg <table border="0"><tbody><tr><td> ATP </td><td> 0.441g </td></tr></tbody></table> Bevestig de gel in 50% methanol gedurende 30 minuten en transfer naar het water.

<ol><li>Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+Clear+Native+Electrophoresis+for+In-gel+Functional+Assays+and+Fluorescence+Studies+of+Membrane+Protein+Complexes.++6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).</li>
<li>Castle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Organelles+from+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Purification of Organelles from Mammalian Cells.</a> Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).</li>
</ol>

In deze video, hebben we beschreven de extractie van de mitochondriale eiwitcomplexen uit menselijke embryonale stamcellen, hun scheiding door de hoge resolutie heldere inheemse gelelektroforese (hrCNE), en de daaropvolgende analyse door in-gel katalytische activiteit assays. hrCNE lost mitochondriale membraan eiwit complexen met een resolutie vergelijkbaar met die van autochtone blauwe gel elektroforese en is superieur voor in-gel-activiteit assays. Deze techniek kan niet alleen gebruikt ter mitochondriale ademhaling complexen IV te kwanti...

<table><tbody><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>pH aanpassen naar 8,0 met NaOH</td></tr><tr><td>1M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014-500MG</td><td></td></tr><tr><td>1M Natriumsuccinaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>0,1M Natiumfosfaatbuffer pH 7,2</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1 en BP329-1</td><td>Meng 68,4 ml van 1M Na2HPO4 en 31,6 ml van 1M NaH2PO4 om 0,1M natiumfosfaatbuffer met pH 7,2 bij 25 C te bereiden</td></tr><tr><td>1M Tricine, pH 7,0 (aangepast met NaOH)</td><td>EMD Millipore</td><td>9010</td><td>bewaren bij 4 C</td></tr><tr><td>1M imidazole/HCl, pH 7,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-2399</td><td>bewaren bij 4 C</td></tr><tr><td>1M Tris-HCl, pH 7,4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>20% (m/v) dodecyl-b-D-maltoside (DDM)</td><td>Fluka</td><td>44205-500MG</td><td>Opgelost in water. Bewaar aliquoten van 1 ml bij &amp;#8211;20 C.</td></tr><tr><td>10% (m/v) digitonine (&amp;gt;50% zuiverheid, gebruikt zonder herkristallisatie)</td><td>Fluka</td><td>37008-1G</td><td>Opgelost in water. Bewaar aliquoten van 0,1&amp;#8211;1 ml bij &amp;#8211;20 C. Moet voor gebruik worden opgewarmd tot 95 C.</td></tr><tr><td>2M 6-aminohexaanzuur</td><td>Fluka</td><td>07260-100G</td><td>bewaren bij 4 C</td></tr><tr><td>10x Ponceau S/glycerol stamoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3504 en G6279-1L</td><td>0,1% Ponceau S, 50% glycerol, (m/v) in water.</td></tr><tr><td>10% m/v natriumdeoxycholaat</td><td>Fluka</td><td>30970-25G</td><td>Opgelost in water. Moet tegen licht worden beschermd. pH aanpassen naar 7,0 met HCl, filteren en bewaren bij kamertemperatuur.</td></tr><tr><td>250 mM fenazine methasulfaat (PMS)</td><td>TCI America</td><td>P0083</td><td>Opgelost in DMSO en in aliquoten verdeeld. Bewaren bij &amp;#8211;20 C.</td></tr><tr><td>Nitro-blauw tetrazolium (NBT)</td><td>Amresco</td><td>0329-1G</td><td></td></tr><tr><td>3,3&amp;rsquo;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)</td><td>TCI America</td><td>D0078</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Fisher Scientific</td><td>L62-100</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-10</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>G45-212</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-trifosfaat dinatriumzout (ATP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-5G</td><td>Graad I, minimaal 99%</td></tr><tr><td>beta-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH) gereduceerde vorm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N-8129</td><td></td></tr><tr><td>Cytochroom c uit paardenhart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-212</td><td></td></tr><tr><td>100x protease-inhibitorcocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td>Bewaren bij &amp;#8211; 20 C.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypaanblauw kleuring 0,4%</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>10x Trypsine (0,5%)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-inhibitor</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr></tbody></table>

peilen naar mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondriën zijn cytoplasmatische organellen die een primaire rol in de cellulaire metabolisme en homeostase hebben, de regulatie van de cel signaleringsnetwerk, en geprogrammeerde celdood. Mitochondria produceren ATP, reguleren van de cytoplasmatische redox staat en Ca2 + saldo, catabolize vetzuren, synthese van heem, nucleotiden, steroïde hormonen, aminozuren, en helpen monteren ijzer-zwavel clusters in eiwitten. Mitochondriën hebben ook een essentiële rol in de productie van warmte. Mutaties van het mitochondriaal genoom oorzaak verschillende soorten van de menselijke aandoening. De accumulatie van mtDNA mutaties correleert met het ouder worden en is vermoedelijk een belangrijke rol in de ontwikkeling van kanker te hebben. Door hun uiterst belangrijke rol in alle celtypes, moet de functie van mitochondriën ook kritisch zijn voor stamcellen. Belangrijke vooruitgang geboekt in onze kennis van stamcellen levensvatbaarheid, proliferatie en differentiatie capaciteit. Maar de functionele activiteit van stamcellen, in het bijzonder hun energie-status, was nog niet in detail bestudeerd. Bijna niets is bekend over de mitochondriale eigenschappen van menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en hun gedifferentieerde voorloper nageslacht. Een manier om te begrijpen en evalueren van de rol van mitochondriën in hESC functie en ontwikkelingsmogelijkheden is om rechtstreeks de activiteit van de mitochondriale ademhaling complexen. We beschrijven hier een hoge resolutie duidelijk inheemse gelelektroforese en vervolgens in de gel-activiteit visualisatie als een methode voor het analyseren van de vijf ademhalingsketen complexen van hESC &#39;s.

In deze video laten wij u zien hoe de mitochondriale ademhalingsketen-complexen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van gel-activiteit assays.

Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Mitochondriën zijn cytoplasmatische organellen die een primaire rol spelen bij het cellulaire metabolisme en de homeostase, de regulatie van het cel-signaleringsnetwerk en ...

Mitochondriën vervullen talrijke rollen in de celphysiologie, van metabolisme en energieproductie tot geprogrammeerde celdood en de synthese van steroïdhormonen. Ondanks het belang van mitochondriën voor zowel fundamentele cellulaire functies als ziektebeelden, is er zeer weinig bekend over de functie van mitochondriën in menselijke embryonale stamcellen en hun gedifferentieerde nakomelingen. In deze video laten we u zien hoe de complexen van de mitochondriale ademhalingsketen van menselijke embryonale stamcellen kunnen worden geanalyseerd met behulp van Ingel-activiteitsassays.Hallo, ik ben Ivan OV van het laboratorium van Michael Tetel van de afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde aan de University of California Los Angeles. Vandaag laten we u een procedure zien voor het beoordelen van de functie van mitochondriële respiratoire complexen in menselijke embryonale stamcellen. Deze in-gel activiteitsanalyse omvat de isolatie van ruwe mitochondriële fracties uit menselijke embryonale stamcellen, de scheiding van mitochondriële complexen van het oxidatieve fosforyleringssysteem met hoge resolutie clear native polyacrylamidegelelektroforese en de daaropvolgende in-gel activiteitsanalyse.Laten we beginnen. De eerste stap in deze procedure is het isoleren van mitochondriën uit humane embryonale stamcellen. Voor deze analyse gebruiken we humane embryonale stamcellen die zijn gekweekt op een met matrigel bedekte plaat onder feeder-vrije omstandigheden.Om mitochondriën te isoleren uit onze menselijke amry-stamcellen, beginnen we met het wassen van de cellen met warm 1x PBS pH 7.4, waarna we de cellen vijf minuten trypsiniseren. U kunt 1 mL 1x trypsine per putje in een six-well plaat gebruiken. Na vijf minuten kan de reactie worden gestopt door een gelijk volume verse trypsine-inhibitor (1 mg/mL in 1x PBS) toe te voegen, waarna de cellen kunnen worden geoogst.De verzamelde cellen worden vervolgens gecentrifugeerd bij 200 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer de pellet van de cellen in 0,8 tot 1,7 milliliters ijskoud mitochondriën-isolatiebuffer met een vers bereide cocktail van één x protease-inhibitor. De hoeveelheid buffer die u gebruikt, is afhankelijk van de grootte van de verkregen celpellet. Nadat de pellet is geresuspendeerd, wordt deze ongeveer 10 minuten op ijs geïncubeerd.Na de incubatie breken we de cellen af met een homogenisator; dit kan ongeveer 40 tot 50 slagen duren. We kunnen de volledigheid van de homogenisatie controleren door een aliquot van de DOD-cellen te kleuren met trypaanblauw en deze onder een lichtmicroscoop te bekijken. Het zou er ongeveer zo uit moeten zien.Dit is de eerste opname na 50 slagen met een downs. Dit is de tweede opname na 80 slagen met een downs. Zodra de cellen gehomogeniseerd zijn, centreer deze vervolgens bij 20,000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Dit resulteert in een ruw mitochondriaal pellet, waarin ook kernen en grotere celfragmenten aanwezig zullen zijn.Voordat het pellet wordt verzameld, moeten we de opvangbuis wegen om het daaropvolgende pelletgewicht te kunnen schatten, het supernatant afgieten en weggooien, en vervolgens het neergeslagen ruwe mitochondriële pellet wegen. Door het gewicht van de buis op dit punt af te trekken, kan men overgaan tot het solubiliseren van het pellet, wat in de volgende stap wordt getoond. Om het ruwe mitochondriële pellet te solubiliseren, beginnen we door het pellet op ijs te houden en te vortexen met 35 µL ijskoud solubilisatiebuffer.Voor elke 20 mg pellet waarover we gedetailleerde informatie hebben, worden de buffercomponenten vermeld in het bijbehorende schriftelijke protocol. Na het vortexen en het toevoegen van solubilisatiebuffer, en vóór het toevoegen van digitonin, brengen we de geresuspendeerde pellet over in een buis die geschikt is voor hogesnelheidscentrifugatie; vervolgens voegen we 20 µL 10% (w/v) digitonin toe per 20 mg pelletgewicht en mengen we door met de buis te tikken. Nadat het mengsel grondig is gemengd, wordt de mitochondriale pellet vijf tot 10 minuten op ijs geïncubeerd. Dodecylmaltoside (DDM) of Triton X-100 kan in de plaats van digitonin worden gebruikt om eiwitten te solubiliseren.De keuze van het detergent en de hoeveelheid ervan kunnen de vorming van supracomplexen of multimere vormen van mitochondriale complexen beïnvloeden na incubatie op ijs. Zodra het pellet is gesolubiliseerd, centrifugeren we dit 15 minuten bij 100.000 ×g bij 4 °C, waarna we de heldere supernatant verzamelen. We kunnen nu de supernatant voorbereiden voor het aanbrengen op onze gradiëntgel voor native gradiëntgelelektroforese van mitochondriën.Wij raden het gebruik aan van een acrylamide-gradiëntgel van vijf tot 13% met een stackinggel van 3,5%. Voor de bereiding van de gel gebruiken we een acrylamide-bisacrylamide-mengsel zoals beschreven in het geschreven protocol. De acrylamide-bisacrylamide-oplossing wordt vooraf bereid en bewaard bij vier graden Celsius op een donkere plaats.Acrylamide en bis-acrylamide zijn toxische chemicaliën, zowel in poedervorm als in vloeibare vorm, dus er moet speciale aandacht worden besteed bij het werken ermee. We combineren de acrylamide-bis-acrylamide-oplossing met een aliquot van drie x gelbuffer bestaande uit 1,5 M 6-aminocapronzuur en 75 mM OLET bij pH 7,0. De hoeveelheid acrylamide-bis-acrylamide-oplossing die we aan de buffer toevoegen, is afhankelijk van het gelpercentage dat we gebruiken om de gradiëntgel te maken.We maken één 4%mengsel en één 13%mengsel, en de stapelgel wordt een 3,5%mengsel. Vergeet niet om glycerol aan het 13%mengsel toe te voegen. Wanneer alle drie de mengsels klaar zijn, voegen we een passende hoeveelheid ammoniumpersulfaat en TEMED aan de mengsels toe en gieten we de mengsels in een castingkamer voor gradiëntvorming.Het linkergedeelte van de kamer bevat de 5%mix. Het rechtergedeelte van de kamer bevat de 13%mix met een klein magnetisch roerstafje. We beginnen met het gieten van de gel door het rechtergedeelte van de kamer te openen.Vervolgens openen we onmiddellijk het linkergedeelte van de kamer en laten we de 5% oplossing mengen met een 13% oplossing om de gradiënt te vormen. We voegen een kleine hoeveelheid isopropanol toe aan de bovenkant van de gel om na polymerisatie een scherpe, rechte rand voor de gel te vormen. Ongeveer een uur later, wanneer de polymerisatie van de gradiëntgel voltooid is, verwijderen we de isopropanol, gieten we de 3.5 stacking gel in het apparaat en plaatsen we een gelkam.We zullen de gels assembleren en laten lopen in een koelruimte van ongeveer vier tot zeven graden Celsius. Voor het laten lopen van deze gel gebruiken we twee verschillende buffers. In de anodekamer gebruiken we een buffer die 25 millimolar ole zoutzuur pH 7.0 bevat.De kathodebuffer bevat 50 millimol Tris, 7,5 millimol zoutzuur, 0,02% gewicht per volume n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) en 0,05% gewicht per volume desoxycolaat bij pH 7,0. Om het supernatant voor te bereiden voor applicatie op de zojuist gegoten gel, wordt ladingsbuffer toegevoegd om een eindconcentratie van 5% gewicht per volume glycerol en 0,01% gewicht per volume NP-40 te verkrijgen; gewoonlijk voegen we een 10x stockoplossing met glycerol en NP-40 rechtstreeks toe aan de supernatanten.Nu zijn we klaar om het monster op de gel te laden. We vullen de gelputjes met een volume dat 20 tot 40 mg van het ruwe mitochondriële eiwit per lane bevat. Direct na het laden wordt de gel gerund bij 100 volt.Zodra het monster in de stapelgel is geïntroduceerd, kan het voltage worden verhoogd naar 500 volt, met een stroombeperking van 15 milliampère. Hoewel we de gel gewoonlijk gedurende de nacht draaien bij 70 tot 100 volt, stoppen we de elektroforese wanneer een scherpe lijn van de rode zos-kleurstof het gelfront nadert. Nu de gel is gedraaid, kunnen we de activiteit van verschillende proteïnecomplexen direct in de gel analyseren.De incubatietijd voor elke assay is afhankelijk van de efficiëntie van de eiwitsolubilisatie en de hoeveelheid materiaal die per putje wordt geladen. Complexen één, vier en vijf leveren gewoonlijk sterkere signalen op dan complexen twee en drie. Daarom moet de kleuringstijd voor complex twee en drie langer zijn.Om de complexactiviteit te testen, moeten we specifieke buffers voor elk complex gebruiken. De ingrediënten voor de afzonderlijke buffers vindt u in het schriftelijke protocol. We zullen nu afzonderlijke banen uit de gel knippen om de in-gel activiteitsassays afzonderlijk uit te voeren.Incubeer voor alle complexen, behalve voor complex vijf, de gelplak enkele uren bij kamertemperatuur in de respectievelijke buffers. Fixeer de gel na incubatie gedurende 15 tot 45 minuten in 50% methanol en 10% azijnzuur. De gefixeerde gel wordt bewaard in 10% azijnzuur.Hier ziet u hoe de kleuring van complex één eruitziet. Er is één dieppaarse band in de gelplak die overeenkomt met complex één. Heldere gels maken het mogelijk om densitometrie uit te voeren op de activiteiten van mitochondriële complexen en vergelijkende analyses te maken.Na de dichte cytometrie drogen we de gelsecties gewoonlijk voor langdurige bewaring en/of voor scanning om een kwalitatief hoogwaardig beeld te verkrijgen; complex twee heeft dezelfde paarse kleur als complex drie en complex vier. Beiden geven een oranje of gelige kleuringsband. Hier zijn voorbeelden van de kleuringsactiviteiten van complex twee, drie en vier.We hebben zojuist aangetoond hoe de activiteit van mitochondriale exudatieve activeringscomplexen kan worden geanalyseerd, welke werden geëxtraheerd uit menselijke embryonale stamcellen en gescheiden met een hogere resolutie, waaronder native gelelektroforese. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experiment.

probing-for-mitochondrial-complex-activity-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Fibroblasten van patiënten die mutaties in Parkinson's ziekte-veroorzakende genen vormen een gemakkelijk...

Het gebruik van primaire menselijke fibroblasten voor de monitoring van Mitochondriale fenotypes op het gebied van de ziekte van Parkinson

Enkele cel genexpressie test is noodzakelijk om inzicht stamcel heterogeniteiten.

Profilering Individuele menselijke embryonale stamcellen door kwantitatieve RT-PCR

Hier schetsen we hoe we de mitochondriale lokalisatie van een (celcyclus) kinase kunnen bestuderen, en hoe we de sub-mitochondriale locatie evenals potentiële mitochondriale substraten/doelen kunnen bepalen. Gedwongen expressie van eiwitten in de mitochondriën biedt een nuttige tool voor het bestuderen van de functionele consequenties van de mitochondriale lokalisatie van een eiwit van belang.

Experimentele benaderingen om te studeren mitochondriale lokalisatie en functie van een nucleair celcyclus Kinase, Cdk1

Verminderde mitochondriale vervoer en morfologie zijn betrokken bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Het gepresenteerde protocol maakt gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide voorhersenen neuronen om mitochondriale vervoer en morfologie in erfelijke spastische dwarslaesie te beoordelen. Dit protocol maakt karakterisering van mitochondriale handel langs axonen en analyse van hun morfologie mogelijk, wat de studie van neurodegeneratieve ziekte zal vergemakkelijken.

Analyseren van mitochondrial transport en morfologie in de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen in erfelijke Spastische dwarslaesie

We beschrijven een gedetailleerd protocol voor het genereren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide hersenorganoïden en hun gebruik bij het modelleren van mitochondriale ziekten.

Generatie van organoïden in de menselijke hersenen voor mitochondriale ziektemodellering

Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Dit protocol beschrijft een techniek voor de analyse van respiratoire supercomplexen wanneer slechts kleine hoeveelheden monsters beschikbaar zijn.

Isolatie van mitochondriën voor mitochondriale supercomplexanalyse uit kleine weefsel- en celcultuurmonsters 

Verspreiding van menselijke embryonale stamcellen (ES) cellen

Leer mitochondriale complexe activiteit analyseren in menselijke embryonale stamcellen met in-gel activiteitstests. Deze methode biedt inzicht in mitochondriale functie en stamcelbiologie.

Peilen naar Mitochondriale complexe activiteit in menselijke embryonale stamcellen

Meer video's verkennen