Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

Meer dan 50 jaar geleden werd de hypothese geopperd dat terminaal gedifferentieerde cellen zoals huidfibroblasten gedwongen kunnen worden om een pluripotente toestand aan te nemen, vergelijkbaar met embryonale stamcellen. De basis voor dit concept was de waarneming dat alle celtypen, op een paar kleine uitzonderingen na, dezelfde genetische code hebben en dat het enige verschil tussen celtypen is hoe de code wordt gelezen. Dit vermogen om de cellulaire identiteit van een gedifferentieerde cel te veranderen in een pluripotente toestand wordt cellulaire herprogrammering genoemd.

Na een half decennium onderzoek, werd onlangs aangetoond dat de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren huidfibroblasten kan herprogrammeren om pluripotent te worden. De impact van deze ontdekking is enorm. Naast de betekenis voor de fundamentele biologie, overwint het ook de belangrijkste ethische bezwaren tegen het gebruik van menselijke embryonale stamcellen voor transplantatietherapie.

Om herprogrammering te laten gebeuren, moeten vier genen die coderen voor de transcriptiefactoren OC vier sox twee cmic en K vier worden verpakt en in een lentivirusteelkweek worden gedaan. Medium dat gezuiverd virus bevat, wordt vervolgens toegevoegd aan een celcultuurschaal die een hoge dichtheid van fibroblasten bevat, en binnen die schaal gebeurt er iets verbazingwekkends. Een kleine fractie van fibroblasten wordt geïnfecteerd met alle vier de transcriptiefactor-dragende virussen en begint te de-differentiëren.

Ze ondergaan drastische veranderingen in hun morfologie en proliferatie en beginnen zich te verdelen in grote spirituele clusters van gevormde pluripotente stamcellen. Na twee tot drie weken kweken onder embryonale stamcelcondities, kunnen kolonies van herprogrammeerde fibroblasten handmatig worden geïsoleerd en in vitro uitgebreid. Eenmaal gezuiverd, kunnen deze cellen worden gebruikt om chimere muizen te genereren waarin een bepaald percentage cellen dat afkomstig is van die de-gedifferentieerde fibroblasten kan bijdragen aan verschillende weefsels van de muis.

In chimaeren waarin het genetische materiaal van de oorspronkelijke fibroblasten heeft bijgedragen aan de kiemlijn, kan de genetische code worden doorgegeven aan de volgende generatie en vervolgens aan de volgende en vervolgens aan de volgende. Hoewel het gebruik van een viraal leveringssysteem momenteel een belemmering vormt voor klinische toepassingen, zal dit waarschijnlijk in korte tijd worden overwonnen. In deze video zullen leden van het yin-lab demonstreren hoe geïnduceerde atory potent stamcellen worden afgeleid van muis embryonale fibroblasten.

Hallo, ik ben Grant Welted van het laboratorium van Rudolph Jish aan het Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts. En ik ben Tobias Bro brink ook van ish lab. Vandaag zullen we je de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen laten zien door de introductie van vier CDNAs OCT vier SOX twee CIC KF vier met behulp van lentivirussen die deze vier CDNAs tot expressie brengen vanuit een Tet OCMV-promotor.

Dit maakt de nauwkeurige controle van de expressie van deze vier transgenen mogelijk na de infectie van muis embryonale fibroblasten. Het protocol dat we je vandaag laten zien, omvat de omgang met lentivirus dat mogelijk humane cellen kan infecteren. Het is van cruciaal belang dat je altijd veilige procedures volgt en contact opneemt met je veiligheidskantoor voordat je dit zelf probeert.

Dus laten we wat IPS-cellen genereren om lentiviruksen te genereren die mes naar IPS-cellen zullen converteren. 2 9 3 cellen moeten worden getransfecteerd met drie plasmiden Paks twee, wat de vereiste genetische elementen biedt voor viraal verpakken. De virale ruggengraat, die een FUW TE OCMV lentiviruus is met een van de vier CD aids T vier SOX twee, KLA vier of CMIC PMDG, die het envelop glycoproteïne van vesiculair stomatitis virus of VSV tot expressie brengt.

Dit maakt het virus dat een atropisch virus zal genereren. Dus BL twee plus procedures moeten worden gevolgd. In deze specifieke video behandelen we eigenlijk geen infectieus virus, dus we dragen onze typische jassen niet en zijn niet in onze BL twee plus faciliteit.

Voorafgaand aan de transfectie worden 2, 9 3 cellen ontdooid uit vloeibare stikstof en gekweekt tot 90% Co fluence cellen worden vervolgens getransfecteerd met FU gen en gedurende 48 tot 72 uur gegeven om het virus tot expressie te brengen, waarna het medium dat de cellen badt wordt gefilterd met behulp van een 0,45 micronfilter en geconcentreerd met behulp van ultracentrifugatie na concentratie van het virus. We zijn nu klaar om MES te infecteren om IPS-clusters te genereren. Tijdens de virale voorbereidingsstappen worden muis embryonale fibroblasten die minder dan drie keer zijn gepasseerd, gekweekt tot 90% Co fluence in 10 centimeter schalen, ongeveer twee keer 10 tot de zes cellen per schaal. In dit specifieke experimentele protocol gebruiken we MES die de RTTA tot expressie brengen, wat cruciaal is voor doxycycline-expressie en GFP vanuit het endogene OC vier-locus.

MES zijn GFP-negatief, maar echte IPS-cellen worden GFP-positief. Deze marker biedt een methode om geherprogrammeerde mes te identificeren, aspireer het kweekmedium van de fibroblasten en was met 10 ml hippies, EDTA, gooi de hippies EDTA weg en voeg vijf ml van een keer trypsine toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden. Trypsine helpt de cellen van de bodem van de schalen te tillen.

Voeg nu negen ml van het kweekmedium toe om de cellen in een enkele celsuspensie te resuspenderen en breng over naar een 15 ml buisje. Deze cellen worden vervolgens gecentrifugeerd en gepelleteerd. Na het opnieuw schorsen van de pellet, worden het aantal cellen in de suspensie geteld en wordt de concentratie aangepast tot acht keer 10 tot de vier cellen per ml.

10 ml van de celsuspensie wordt vervolgens overgebracht naar een 10 centimeter schaal bedekt met gelatine. Incubeer de schaal een nacht bij 37 graden Celsius 5% CO2. Na de overnachtelijke incubatie wordt het medium van een fibroblastenschaal geaspireerd en wordt 10 ml van het virusbevattende medium toegevoegd aan de meth. Incubeer de cellen gedurende vier uur tot een nacht bij 37 graden Celsius, 5% CO2.

De volgende dag aspireer het medium van een fibroblastenschaal en voeg vervolgens 10 ml vers ESL-medium toe. In dit stadium kunnen cellen worden ingevroren,