Name: Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: Leer hoe je iPS-cellen genereert uit muizenembryonale fibroblasten met behulp van een lentiviraal systeem. Dit protocol demonstreert de gedwongen expressie van vier transcriptiefactoren voor celulaire herprogrammering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Stap 1: Ontdooien 293-cellen en de plaat voor lentivirus productie. <ol><li> Bereid 9 ml DMEM + medium in een 15 ml buis. </li><li> Verwijder een flacon van bevroren 293 aandelen uit de vloeibare stikstof tank en zet de flacon in een 37 ° C waterbad tot de meeste (maar niet alle) cellen worden ontdooid. </li><li> Verwijder de cellen van het bevriezen flacon en plaats in de 15 ml buis vanaf stap 1. </li><li> Centrifugeer bij 180g gedurende 5 minuten, en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen met 10 ml DMEM + medium, en over te dragen aan een gelatine gecoate 100-mm schotel. Incubeer de cellen in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator tot ze 80-90% confluent. </li><li> Passage van de 293 cellen: cellen wassen met PBS, aspiratie van de PBS, en voeg 4 ml per 10 cm schotel van 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, en incubeer gedurende 1 min bij 37 ° C. </li><li> Los cellen van gerechten door te tikken, mengen met 10 ml DMEM + medium, en over te dragen aan een 15-ml-buis. Centrifugeer bij 180g gedurende 5 minuten, en zuig het supernatant. </li><li> Voeg het juiste volume van DMEM + medium, en breken de cellen in een enkele cel schorsing door en neer te pipetteren meerdere malen. </li><li> Tel het aantal cellen en pas de concentratie 8x10 5 cellen per ml met OH medium. </li><li> Zaad cellen op 8x10 6 cellen (10 ml) per 100-mm cultuur schotel, en incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Stap 2: Transfecteren 293 cellen met lentivirus plasmiden en de oogst virus <ol><li> Voor elke 10-cm plaat, gebruik 10 pg FUW-Teto-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 of c-Myc) lentivirus ruggengraat met 2.5ug van de PMD-G en 7,5 ug van pPax2. </li><li> Terwijl aliquoting de drie plasmiden in een buis, te leveren 30μl van Fugene 6 transfectiereagens in een tweede buisje met 500μl van DMEM zonder serum en meng voorzichtig met de vinger te tikken en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg de DNA mix drop-door-drop in de Fugene 6/DMEM-containing buis, meng door de vingers te tikken en incubeer gedurende 20 minuten. </li><li> Voeg de DNA / Fugene 6 complex druppelsgewijs in de schaal van 293, en incubeer overnacht bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> De volgende ochtend: Zuig de transfectiereagens-bevattend medium, voeg 5 ml vers ES-cel-medium, en de cellen naar de incubator terug te keren. </li><li> Op 48 uur en 72 uur na transfectie, het verzamelen van het medium van de 293&#39;s met behulp van een 10-ml steriele wegwerpspuit, filteren door een 0,45-um poriën cellulose-acetaat filter, en de overdracht in een 15 ml buis. </li><li> Concentreer het virus supernatant door ultracentrifugatie. Resuspendeer de virus pellet in gewenste volume en maak amixture van gelijke delen van het medium dat Oct-3/4-, Sox2-, Klf4-en c-Myc-lentivirussen. </li><li> Tijdens het maken van het virus, bereiden Oct4-neo/rtTA of Oct4-GFP/rtTA MEF (passage &lt;3) tot 90% confluentie in 10-cm gerechten (2x10 6 cellen per schaaltje) </li><li> Aspireren het kweekmedium en wassen met 10 ml PBS. </li><li> Gooi PBS, voeg 1 ml per schotel van 0,05% trypsin/0.53 mM EDTA, en bij 37 ° C incubeer gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 9 ml van het kweekmedium, schorten de cellen van een enkele cel, en over te dragen aan een 15-ml-buis. </li><li> Tel het aantal cellen, en pas de concentratie 8x10 4 cellen per ml. Breng 10 ml celsuspensie (8x10 5 cellen) om een 10-cm schotel bedekt met gelatine. &#39;S nachts Incubeer de schotel op 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Zuig het medium van een fibroblast schaal, en voeg 10 ml van het virus-bevattend medium. Incubeer de cellen van 4 uur tot &#39;s nachts bij 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Na 24 aspireren het medium van een fibroblast schaal, en voeg 10 ml vers ES-cel medium. </li><li> Vervang regelmatig ES-cel medium met een medium dat Doxycycline om de expressie van de vier genen initiëren, met andere woorden, start herprogrammering. </li><li> Bij gebruik van een Oct4-neo reporter, dan starten drug sectie elk moment tussen de 6 en 9 dagen. </li><li> Verander het medium elke dag tot de kolonies worden groot genoeg om opgehaald te worden. Kolonies moet eerst zichtbaar worden ongeveer een week na de start van de herprogrammering. Ze moeten groot genoeg om opgehaald te worden rond dag 20. </li></ol> Stap 3: Het afhalen van de iPS kolonies De dag voor Picking: <ol><li> Zaad het vereiste aantal van gelatine-gecoate 24-well platen met γ-bestraalde DR4 MEFs </li></ol> Picking Klonen op dag 1: <ol><li> Voer de kolonies op de platen 1-2 uur voor het plukken. </li><li> Voeg 15 pi PBS aan de putjes van een V-vormige 96-wells schotel. </li><li> Was het schaaltje met de koloniën een keer worden geplukt met PBS en voeg 10 ml van PBS aan het gerecht. </li><li> Kies de kolonies met de kleine 5μl pipetpunten (zet de P20 Pipetman op 4 pi). Overdracht colonies naar een put in de 96-wells schotel. </li><li> Voeg 20 ui van trypsine aan elk putje met behulp van de multi-channel (12) pipetor. Pipet op en neer 3 keer. Incubeer bij 37 ° C gedurende 4 minuten. </li><li> Voeg 100 ul van ES medium om de getrypsiniseerd koloniën. Pipet op en neer 10 keer. Transfer 6 klonen op een tijd van de 96-well schotel naar een 24-well gerecht met behulp van een tip op elke andere plaats op de 12 plaats pipetor. </li><li> Groeien de cellen op de 24-well plaat in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator totdat de cellen te bereiken 80-90% confluentie, het voeden dagelijks met ES-cel medium. Cellen zullen waarschijnlijk klaar zijn om uit te breiden in 3-7 dagen. </li></ol> Stap 4 <ol><li> Uitbreiding van iPS cellen <ol><li> Zuig het medium, en was de cellen met 1 ml PBS. </li><li> Volledig te verwijderen PBS, voeg 0,1 ml van 0,25% trypsine / 1 mM EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 0,4 ml van de ES medium en schorten de cellen door en neer te pipetteren tot enkele celsuspensie. </li><li> Breng de celsuspensie om een goed van de 6-well plaat, voeg 1,5 ml ES-cel-medium, en incuberen in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator tot de cellen te bereiken 80-90% confluentie in 6-wells platen. Op dit punt, voor te bereiden bevroren voorraad van de cellen, als volgt. </li></ol></li><li> De voorbereiding van bevriezen voorraad <ol><li> Zuig het medium, en was de cellen met 2 ml PBS. </li><li> Volledig te verwijderen PBS, voeg 0,5 ml van 0,25% trypsine / 1 mM EDTA en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 2 ml van de ES medium en schorten de cellen door en neer te pipetteren tot enkele celsuspensie. </li><li> Breng de celsuspensie om een ​​15-ml tube, tel het aantal cellen en spin down van de cellen. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer de cellen met ES medium om de concentratie bij 2x10 6 cellen per ml. </li><li> Bereid 2 ES-cel bevriezing medium (20% DMSO in ES medium) en aliquot het op 0,5 ml per flacon. </li><li> Overdracht 0,5 ml van de celsuspensie om flesjes te bevriezen en meng. </li><li> Doe de injectieflacons in een cel-invriezen container en houd het bij -80 ° C gedurende de nacht, over te dragen aan vloeibare stikstof de volgende dag voor de lange termijn opslag. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li>
<li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li>
<li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li>
</ol>

In deze video laten we zien hoe een induceerbaar, lentivirale systeem te gebruiken om GFP-positieve, pluripotente iPS cellen van MEFs afgeleid van Oct4-GFP/R26-M2rtTA en Nanog-GFP/R26-M2rtTA muizen te genereren. Deze procedure is een bruikbare methode voor het genereren van iPS cellen, omdat het zorgt voor de controle van transgenexpressie tijdens de herprogrammering proces. Hoewel het gebruik van virussen in de generatie van iPS cellen belemmert het gebruik van deze cellen in een klinische setting is deze procedure kunnen we enkele van de belangrijkste biologische vragen die het nog niet gedefinieerd herprogrammering proces te benadrukken beantwoorden.

<table><tbody><tr><td>Doxycyclinehyclaat</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

het genereren van ips cellen van mef door gedwongen expressie van sox-2, okt-4, c-myc en klf4

Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

Pluripotentie kan worden geïnduceerd in gedifferentieerde murine door virale transductie van Oct4, Sox2, Klf4, en c-Myc (Takahashi en Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007;. Okita, et al., 2007;.. Maherali, et al., 2007). We hebben bedacht een herprogrammering strategie waarbij deze vier transcriptiefactoren worden uitgedrukt van doxycycline (DOX)-induceerbare lentivirale vectoren (Brambrink et al.., 2008). Met behulp van deze induceerbare constructen, kunnen we afleiden geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen van muis embryonale fibroblasten (MEFs). In deze video, tonen we de procedure voor het genereren van induceerbare lentivirussen dat de vier transcriptiefactoren te uiten en te laten zien hoe MEFs infecteren met deze virussen om iPS cellen te produceren. Door het gebruik van induceerbare lentivirussen, de uitdrukking van de vier factoren in gecontroleerde door de toevoeging van doxycyline aan het kweekmedium. Het voordeel van dit systeem in de traditionele retrovirale infectie is de mogelijkheid om de genen aan-en uitzetten, zodat de kinetiek van herprogrammering en genexpressie eisen kan worden in detail geanalyseerd.

Deze video toont de procedure voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van induceerbare lentivirus die uitdrukken Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

Pluripotentie kan worden geïnduceerd in gedifferentieerde muiscellen door virale transductie van Oct4, Sox2, Klf4 en c-Myc (Takahashi en Yamanaka, 2006; Wernig, et al., ...

Meer dan 50 jaar geleden werd de hypothese opgesteld dat terminaal gedifferentieerde cellen, zoals huidfibroblasten, gedwongen konden worden om een pluripotente staat aan te nemen die vergelijkbaar is met die van embryonale stamcellen. De basis voor dit concept was de waarneming dat alle celtypen, op enkele kleine uitzonderingen na, dezelfde genetische code hebben en dat het enige verschil tussen celtypen ligt in de manier waarop deze code wordt gelezen. Dit vermogen om de cellulaire identiteit van een gedifferentieerde cel te veranderen naar een pluripotente staat wordt cellulaire herprogrammering genoemd.Na vijf jaar onderzoek is onlangs aangetoond dat de geforceerde expressie van vier transcriptiefactoren huidfibroblasten kan herprogrammeren tot pluripotente cellen. De impact van deze ontdekking is enorm. Naast het belang voor de fundamentele biologie, neemt dit ook de belangrijkste ethische bezwaren weg tegen het gebruik van menselijke embryonale stamcellen voor transplantatietherapie.Om herprogrammering mogelijk te maken, moeten vier genen die coderen voor de transcriptiefactoren Oct4, Sox2, c-Myc en Klf4 worden verpakt en in een lentivirus worden gebracht. Een weefselkweekmedium dat gezuiverd virus bevat, wordt vervolgens toegevoegd aan een celkweekschaal met een hoge dichtheid aan fibroblasten, waarna er in die schaal iets bijzonders gebeurt. Een klein deel van de fibroblasten raakt geïnfecteerd met alle vier de virussen die de transcriptiefactoren dragen en begint te dedifferentiëren.Ze ondergaan drastische veranderingen in hun morfologie en proliferatie en beginnen zich te delen in grote sferische clusters van pluripotente stamcellen. Na twee tot drie weken kweek onder embryonale stamcelcondities kunnen kolonies van gereprogrammeerde fibroblasten handmatig worden geïsoleerd en in vitro worden uitgebreid. Eenmaal gezuiverd kunnen deze cellen worden gebruikt om chimere muizen te genereren, waarbij een bepaald percentage cellen afgeleid van deze gededifferentieerde fibroblasten kan bijdragen aan verschillende weefsels van de muis.In chimeren waarin het genetisch materiaal van de oorspronkelijke fibroblasten heeft bijgedragen aan de kiemlijn, wordt de genetische code doorgegeven aan de volgende generatie en vervolgens aan de generaties daarna. Hoewel het gebruik van een viraal afleversysteem momenteel een belemmering vormt voor klinische toepassingen, zal dit waarschijnlijk op korte termijn worden opgelost. In deze video zullen leden van het yin-lab demonstreren hoe geïnduceerde pluripotente stamcellen worden afgeleid van embryonale fibroblasten van muizen.Hallo, ik ben Grant Welted van het laboratorium van Rudolph Jish aan het Whitehead Institute for Biomedical Research in Cambridge, Massachusetts. En ik ben Tobias Bro brink, ook van het Jish-lab. Vandaag laten we u de generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen zien door de introductie van vier cDNA's: OCT4, SOX2, KLF4 en c-MYC, gebruikmakend van lentivirussen die deze vier cDNA's tot expressie brengen via een Tet-On CMV-promotor.Dit maakt een nauwkeurige controle mogelijk van de expressie van deze vier transgenen na de infectie van embryonale fibroblasten van muizen. Het protocol dat we vandaag laten zien, omvat de hantering van lentivirus dat mogelijk menselijke cellen kan infecteren. Het is essentieel dat u altijd de veiligheidsprocedures volgt en contact opneemt met uw veiligheidsfunctionaris voordat u dit zelf probeert uit te voeren.Laten we nu some iPS-cellen genereren om lentivirus te produceren dat mes-cellen zal converteren naar iPS-cellen. 293-cellen moeten worden getransfecteerd met drie plasmiden: pAKS2, dat de benodigde genetische elementen voor virale packaging biedt; de virale backbone, wat een FUW-TE-OCMV-lentivirus is met een van de vier cDNA's (T4, SOX2, KLF4 of c-MYC); en pMDG, dat het envelop-glycoproteïne van het vesicular stomatitis virus (VSV) tot expressie brengt.Hiermee wordt het virus gemaakt dat het atrope virus zal genereren. Daarom moeten de juiste BSL-2+ procedures worden gevolgd. In deze specifieke video werken we niet met infectieus virus, dus dragen we geen typische jassen en bevinden we ons niet in onze BSL-2+ faciliteit.Vóór de transfectie worden 2, 9 3 cellen ontdooid uit vloeibare stikstof en gekweekt tot 90% confluentie. De cellen worden vervolgens getransfecteerd met het FU-gen en krijgen 48 tot 72 uur de tijd om het virus tot expressie te brengen, waarna het medium waarin de cellen zich bevinden wordt gefilterd met een 0,45 micron filter en geconcentreerd via ultracentrifugatie. Na het concentreren van het virus zijn we klaar om de MES te infecteren om IPS-clusters te genereren. Tijdens de stappen van de virale preparatie worden muis embryonale fibroblasten met minder dan drie passages gekweekt tot 90% confluentie in 10 centimeter schalen, met ongeveer 2 × 10⁶ cellen per schaal. In dit specifieke experimentele protocol gebruiken we MES die RTTA tot expressie brengen, wat essentieel is voor doxycycline-expressie, en GFP vanuit de endogene OC vier locus.MES zijn GFP-negatief, maar echte IPS-cellen worden GFP-positief. Deze marker maakt een methode mogelijk om gereprogrammeerde mes-cellen te identificeren; aspireer het kweekmedium van de fibroblasten en was met 10 ml HEPES-EDTA, verwijder het HEPES-EDTA en voeg 5 ml 1× trypsine toe en incubeer 10 minuten bij 37 °C. Trypsine helpt om de cellen van de bodem van de schaaltjes los te maken.Voeg nu negen ml kweekmedium toe om de cellen te resuspenderen tot een enkelcellige suspensie en breng dit over naar een buis van 15 ml. Deze cellen worden vervolgens gecentrifugeerd om een pellet te vormen. Na het resuspenderen van de pellet wordt het aantal cellen in de suspensie geteld en wordt de concentratie aangepast naar 8 × 10⁴ cellen per ml.Vervolgens worden 10 ml van de celsuspensie overgebracht naar een schaal van 10 centimeter die is gecoat met gelatine. Incubeer de schaal overnacht bij 37 °C en 5% CO2. Na de overnachtelijke incubatie wordt het medium uit een fibroblastschaal geaspireerd en worden 10 ml van het virushoudende medium aan de schaal toegevoegd. Incubeer de cellen gedurende vier uur tot overnacht bij 37 °C en 5% CO2.Aspireer de volgende dag het medium uit een schotel met fibroblasten en voeg vervolgens 10 ml vers ESL-medium toe. In dit stadium kunnen de cellen worden ingevroren, uitgebreid of voorbereid voor de start van de herprogrammering. Om de herprogrammering te initiëren, vervangt u het reguliere ESL-medium door medium dat doxycycline bevat om de expressie van de vier genen op te starten.Plaats deze cellen in de incubator en ververs het medium dagelijks totdat de kolonies groot genoeg zijn om te worden opgepikt. Kolonies zouden ongeveer een week na de start van de herprogrammering zichtbaar moeten worden. Ze zouden rond dag 20 groot genoeg moeten zijn om te worden opgepikt.Nu er 20 dagen zijn verstreken, kunnen we overgaan tot het plukken van IPS-kolonies. Men dient erop te letten dat het benodigde aantal met gelatine gecoate 24-wells platen met gamma-bestraalde DR vier mythen één tot twee uur voor het plukken gereedstaan. De kolonies op de platen moeten worden gevoed door vlak voor het plukken vers medium toe te voegen; voeg onmiddellijk voor het plukken 50 µL HEPA-buffer toe aan de wells van een 96-wells V-bodem dish. Was de dish met de te plukken kolonies één keer met PBS en voeg 10 ml PBS toe aan de dish. IPS-celclusters kunnen worden geplukt met behulp van een stereomicroscoop of een omgekeerde microscoop.Pak de koloniën met een kleine pipetsptip en breng ze over naar een putje in de 96-wells plaat met PBS om de clusters te verwijderen. Teken met een pipetpunt een cirkel rond het cluster om de klonten op te breken. De gereprogrammeerde cellen kunnen nu worden geëxtraheerd met behulp van een multichannel pipet, waarbij aan elk putje 20 µL trypsine wordt toegevoegd.Pipetteer het mengsel drie keer op en neer en incubeer dit gedurende vier minuten bij 37 °C. Voeg na de incubatietijd van vier minuten 100 µL ES-medium toe aan de tripps-nice-kolonies. Pipetteer dit 10 keer op en neer en transfer vervolgens zes klonen per keer.Breng de cellen over van de 96-well plaat naar een 24-well plaat met een pipetpunt op elke tweede positie van de 12-plaatsen pipeteerder. De cellen worden vervolgens gekweekt op de 24-well plaat in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 totdat de cellen een confluentie van 80 tot 90% bereiken, waarbij het medium dagelijks wordt aangevuld met ES-celmedium; de cellen zullen waarschijnlijk over drie tot zeven dagen klaar zijn voor expansie. Enkele dagen later, wanneer de iPS-cellen confluent zijn, wordt het medium geaspireerd en worden de cellen gewassen met 1 mL PBS. Verwijder het PBS volledig en voeg 100 µL 1× trypsine toe; incubeer dit gedurende 10 minuten bij 37 °C. Voeg na incubatie met trypsine 400 µL ES-celmedium toe en resuspendeer de cellen door herhaaldelijk op en neer te pipetteren om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.De 500 µL enkelcel-suspensie uit de 24-wellsplaat wordt vervolgens overgebracht naar één well van een six-wellplaat en geïncubeerd in een incubator op 37 °C met 5% CO2 totdat de cellen een confluentie van 80 tot 90% in de six-wellplaat bereiken. Op dit punt kunt u overgaan tot het amplifieren van cellen voor Southern-analyse, blasts, injecties, teratoomassays of in vitro differentiatie-assays. Vergeet niet om reservevoorraden van deze cellen te invriezen, zodat u deze kostbare voorraad iPS-cellen niet verliest.We hebben zojuist aangetoond hoe pluripotentie kan worden geïnduceerd in muizem Embrionale fibroblasten met behulp van een induceerbaar antiviraal systeem. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

generating-ips-cells-from-mefs-through-forced-expression-sox-2-oct-4

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De Stemgent Dox Induceerbare Mouse TF lentivirus Set kan herprogrammeren muis embryonale fibroblasten (MEF) om geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen. Hier hebben we het protocol voor DOX-induceerbare expressie van muis herprogrammering transcriptiefactoren Oct4 te tonen, om Sox2, Klf4 en c-Myc genereren iPS kolonies die uitdrukken gemeenschappelijke MES pluripotentie markers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen door herprogrammeren embryonale fibroblasten van muizen met een vier transcriptiefactor, Doxycycline Induceerbare Lentivirale transductiesysteem

Het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) lijnen produceert lijnen van verschillende ontwikkelingspotentieel, zelfs als ze passeren standaard tests voor pluripotentie. Hier beschrijven we een protocol muizen volledig zijn verkregen uit iPSCs die de iPSC lijnen gedefinieerd als hebbende full pluripotentie...

Generatie van Muizen Afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier laten we een eenvoudige en effectieve protocol voor het genereren van menselijke iPSCs 3-4 ml van perifeer bloed met een lentivirale vector herprogrammering. Herprogrammering van direct beschikbare bloedcellen belooft om het gebruik van IPSC technologie te versnellen door het toegankelijk voor een breder onderzoeksgemeenschap.

Generatie van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed Met behulp van de STEMCCA lentivirale vector

Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Hier presenteren we onze gevestigde methode om menselijke somatische cellen herprogrammeren in-transgen vrij mens iPSCs met Sendai-virus, die in overeenstemming resultaat en verbeterde efficiëntie toont.

Efficiënte Generation humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met Sendai-virus

Muis embryonale fibroblasten kunnen met lage efficiëntie worden gereprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen door de geforceerde expressie van transcriptiefactoren Oct-4, Sox-2, Klf-4, c-Myc. De zeldzame tussenproducten van de herprogrammeringsreactie worden via FACS geïsoleerd door middel van labeling met antilichamen tegen celoppervlaktemarkers Thy-1.2, Ssea-1 en Epcam.

Celoppervlaktemerker Mediated Zuivering van iPS Cell Intermediates van een Herprogrammeerbare muismodel

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit perifeer bloed met behulp van een episoom gebaseerd herprogrammering strategie en histondeacetylaseremmers.

Efficiënte iPS Cell Generation van Blood behulp episomen en HDAC-remmers

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

We beschrijven hier een protocol voor de generatie van iCM's met behulp van retrovirus-gemedieerde levering van Gata4, Tbx5 en Mef2c in een polycistronisch construct. Dit protocol levert een relatief homogene populatie van geherprogrammeerde cellen met verbeterde efficiëntie en kwaliteit en is waardevol voor toekomstige studies van iCM-reprogrammering.

Verbeterde Generatie van geïnduceerde Cardiomyocytes Met behulp van een polycistronisch Construct uitdrukken optimale verhouding van GATA4, MEF2C en Tbx5

Het hier beschreven protocol beschrijft de inductie van een hemogenetisch programma in muis embryonale fibroblasten via overexpressie van een minimale set transcriptiefactoren. Deze technologie kan worden toegepast op het menselijk systeem om platforms te bieden voor toekomstig onderzoek naar hematopoëse, hematologische ziekten en hematopoietische stamceltransplantatie.

Herprogrammeren muis embryonale fibroblasten met transcriptiefactoren een Hemogenic Program Laten

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Leer hoe je iPS-cellen genereert uit muizenembryonale fibroblasten met behulp van een lentiviraal systeem. Dit protocol demonstreert de gedwongen expressie van vier transcriptiefactoren voor celulaire herprogrammering.

Het genereren van iPS Cellen van MEF door gedwongen Expressie van Sox-2, okt-4, c-Myc en Klf4

Meer video's verkennen