Name: Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00.000+00:00
Duration: 14 min 42 s
Description: Leer de isolatie van hematopoietische stamcellen uit muizenplacenta voor ontwikkelingsbiologie. Deze methode toont unieke micro-omgevingsniches en visualisatietechnieken voor stamcelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Embryo verwijdering en placenta dissectie <ol><li> Om te beginnen, moeten embryo&#39;s eerst worden geïsoleerd van zwangere dammen. </li><li> Dieren worden gedood volgens goedgekeurde procedures - in ons geval gaan we een dodelijke dosis van het verdovingsmiddel isofluraan gebruiken </li><li> De eerste, spray de buik met ethanol en een kleine incisie met een schaar. </li><li> Afscheuren van de huid met beide handen op de buik bloot te leggen en open snijden het buikvlies. </li><li> Met een pincet, pak de baarmoeder hoornen en verzamel ze met een schaar aan elk distale einde. Plaats de baarmoeder hoorns in een petrischaal gevuld met PBS en leg ze op ijs. Vergeet ook niet om een ​​paar keer wassen met PBS voor het isoleren van de placenta. We kunnen nu isoleren de placenta. </li><li> Met twee tang, beginnen voorzichtig afpellen van het endometrium weefsel rondom de embryo conceptuses. Men moet oppassen niet te doorboren of anderszins toebrengen structurele schade aan de embryo&#39;s, want dit zal bemoeilijken latere dissectie stappen. </li><li> Plaats het geïsoleerde conceptuses in een nieuwe petrischaal met PBS op ijs en blijven totdat alle conceptuses zijn bevrijd van het baarmoederslijmvlies. </li><li> Overdracht een conceptie van een nieuwe petrischaal met PBS onder de microscoop en met twee tangen schil van de decidua weg van de placenta. Verwijder zoveel mogelijk van de decidua mogelijk als decidua cellen zullen interfereren met single-cell vering en flowcytometrie. Een vloeiende continu-peeling beweging wordt aanbevolen om de beste resultaten te bereiken. </li><li> Weggesneden de dooierzak van de placenta op de kruising tussen de twee organen en zachtjes weg te trekken van de dooierzak en vitelline vaartuigen van de placenta. Zorg ervoor dat u niet aan de chorion plaat van de placenta te verstoren, in het bijzonder met vroege embryo&#39;s. </li><li> Zorgvuldig te houden van de chorion plaat van de placenta met een pincet en de navelstreng met een ander, trek aan de navelstreng en de bijgevoegde embryo weg van de placenta. </li><li> Verwijder overtollig gigantische cel weefsel aan de randen van de placenta, om cellen klonteren tijdens de bereiding van de single-celsuspensie te minimaliseren. </li><li> Verzamel de placenta in een geschikte container, zoals een 15-ml Falcon buis, met PBS +5% FCS en op ijs. Doe dit voor alle placenta&#39;s ontleed. </li><li> Op dit punt, kunt u doorgaan met de voorbereiding van een single-cell suspensie voor flowcytometrie, functionele testen, zoals in vitro cultuur of transplantatie, of bereid gehele placenta voor weefsel fixatie en vaste diepgevroren blok inbedding voor eventuele immunohistochemie. </li></ol> 2. Voorbereiding van de single-celsuspensie van placenta weefsel <ol><li> We zullen nu laten zien hoe je een enkele celsuspensie van de placenta voor de FACS-analyse te genereren. </li><li> Ter voorbereiding op een enkele celsuspensie van de placenta, mechanische en enzymatische dissociatie is vereist. Prepareert u eerst een 0,1%-oplossing Collagenase in PBS met 10% FCS en 1% penicilline / streptomycine-oplossing. </li><li> Voeg een geschikt volume van collagenase oplossing om de placenta&#39;s, afhankelijk van hoeveel je hebt. Een volume dat het dubbele is van de placenta volume en tussen de twee-5ml wordt aanbevolen. </li><li> Gebruik een 16-G naald gemonteerd op een 5-ml-spuit op het weefsel mechanisch verstoren door passage van de collagenase oplossing en placenta door de naald 3 keer. Herhaal dit met een 18-G naald. </li><li> Het monster wordt in een 37 ° C, 5% CO 2 incubator gedurende 45 minuten. </li><li> Na de 45 minuten incubatie in collagenase, passage de cel oplossing door een 20-G naald, en incubeer gedurende een extra 45 minuten, in 37 ° C. </li><li> Na de 1,5 uur incubatie in totaal collagenase, passage de cel oplossing door 22-G en de 25-G naalden drie keer met elke naald. </li><li> Filtreer het monster door een 50-um filter gekoppeld aan een nieuwe 15-ml Falcon buis, wassen met PBS +5% FCS en centrifugeer bij 4 ° C gedurende 5 minuten bij 300 x g. </li><li> Op dit punt hebben we een enkele celsuspensie die geschikt zijn voor FACS-analyse of functionele assays. </li></ol> 3. Weefsel Fixatie voor vriescoupes <ol><li> Onmiddellijk na het isoleren van de placenta uit elk embryo, worden ze in koud 1X PBS. Meestal een 96-wells plaat het beste werkt voor jonge placenta (E8.5-11.5), maar met oudere placenta&#39;s, E12.5 en ouder, een 24-wells plaat kan handiger. </li><li> Elke placenta is ondergebracht in een nieuwe goed gevuld met vers ontdooid 4% paraformaldahyde of PFA. Voor de E12.5 placenta&#39;s, is het weefsel verplaatst naar een nieuw goed met de hand, maar voor de E10.5 kan je voorzichtig verwijderen van de PBS met een pipet en voeg de PFA. Het is belangrijk dat de placenta volledig is ondergedompeld gedurende 2-4 uur bij 4 ° C, afhankelijk van de leeftijd en de grootte van het weefsel. </li><li> Breng de weefsel in 30% sucrose, of als de weefsels zijn erg klein en broos, zuigen de PFA en direct toe te voegen de sucrose. In dit stadium zal de placenta te zweven in oplossing. Laat de weefsels overnachten bij 4 ° C.</li><li> Na de nacht stap in 30% sucrose, moeten de weefsels uiteindelijk zinken naar de bodem van de put, indicatief voor een goede cryopreservatie. Verwijder de helft van de sucrose-oplossing en vervang het volume met LGO en terug te plaatsen van het weefsel in de 4 ° C gedurende 1-2 uur. Dit vergemakkelijkt oktober penetratie. </li><li> Overdracht van het weefsel tot 100% LGO voor een uur, waarna het kan worden ingebed. </li></ol> 4. Inbedden van de Vaste Tissue <ol><li> Label plastic mallen met de juiste weefsel identificatie (tonen bijvoorbeeld schimmels). </li><li> Trek het weefsel uit de LGO-oplossing en snijd de placenta in tweeën gedeeld door het oriënteren van de schijfvormige placenta met de navelstreng kant naar beneden en zorgvuldig snijden met een schoon scheermesje en zorg ervoor dat het blad heen en weer voor het vrijgeven van de druk om ervoor te zorgen een nog te snijden. De placenta wordt gesneden in de helft om de beste prientation bereiken later visualiseren van de placenta HSC. </li><li> Plaats een placenta half op de bodem van de vorm met de gesneden kant in contact komen met de onderkant van de mal. Herhalen met een nieuwe mal voor de andere helft. Voor E10.5 placenta&#39;s, kunnen beide helften worden geplaatst in dezelfde mal met behulp van dezelfde techniek. </li><li> Bij het gieten oktober in de mal, kan het moeilijk zijn om de placenta te houden in de juiste richting. Zet de placenta op zijn plaats door die de weefsel half met een tang. Giet langzaam oktober oplossing in de vorm en voorkomen dat de productie van eventuele luchtbellen. Voor E10.5 placenta&#39;s, houdt u een weefsel half door de tang en de rest van de ander weefsel half tegen de buitenkant van de tang. Giet langzaam oktober oplossing zoals beschreven voor E12.5 placenta&#39;s. </li><li> Zodra de mal is gevuld met oktober, snel de matrijs plaats op droog ijs, zal de LGO-turn witte flits bevriezen van de weefsel </li><li> Plaats de vorm in een klein plastic zakje met Drierite en onmiddellijk op te slaan in de -80 ° C vriezer. </li></ol>

<ol><li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li>
<li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li>
</ol>

De experimentele procedures beschreven in dit protocol zal zorgen voor isolatie en visualisatie van placenta weefsel en hematopoietische stamcellen en progenitorcellen. Voor een uitgebreide samenvatting over de verwachte opbrengst en het aantal cellen van HSC in de placenta en andere foetale hematopoietische organen gedurende de foetale ontwikkeling verwijzen we naar Gekas, et al.. 2005. Voor het lokaliseren van het ontwikkelen van HSC en andere hematopoietische cellen in de placenta verwijzen we naar Rhodos, et al.. 2008.

Materialen Lijst: 100mm Glucose 10 mM NaN3 15-ml conische buizen (BD) 16-G, 18-G, 20-G, 22-G en de 25-G naalden (BD) 30% Sucrose Solution 35mm Petri Schotels (BD) 4% Paraformaldehyde 50 - m cel filters (Celltrics) 5-ml spuiten (BD) Alkalische fosfatase Ondergrond Kit I (Vector Red, Vector) Alkalische fosfatase Ondergrond Kit III (Vector Blue, Vector) Antibioticum (penicilline / streptomycine, P / S)-oplossing Collagenase type I (Sigma) Cryomold Wegwerp Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Cytokeratine primaire antilichaam (DakoCytomation) Dissection tang, roestvrij staal of titanium, nummer 5 of 55 Drierite Foetaal runderserum (FBS) Fisherbrand Plastic microscoopglaasje Mailer (Fisher) Glucose-oxidase 1000u/ml Levamisol (Vector) Montage media, Waterige basis van Mounting Medium (VectamountTM AQ) Normaal Horse Serum (Vector) Optimale Cutting Temperatuur (OCT, Tissue-Tek) Peroxidasesubstraat Kit DAB (Vector) Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met Calcium / Magnesium (w Ca2 + / Mg2 +) Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Calcium / Magnesium (w / o Ca2 + / Mg2 +) Kunststof glijbaan Box (bevat 100 dia&#39;s) Plastic slang (Nalgene 180 PVC Niet-giftig Autoclaveerbaar) Polypropyleen ronde bodem Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco) Research Products International Corp Super Pap Pen HT * Schuif Markers (2,5 mm, Fisher) Tissue-cultuur behandeld U-vormige (ronde bodem) 96-well of 24-well platen (BD Falcon) Tween20, SigmaUltra (Sigma) Tyramide Amplification Kit (Invitrogen) Vectastain ABC Alkalische fosfatase Standard Kit (Vector) Vectastain ABC Standaard Elite Kit (Vector)

isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietische stamcellen (HSC&#39;s) hebben de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en het genereren van alle celtypen van het bloed lijnen gedurende het hele leven van een individu. Alle HSCs ontstaan ​​tijdens de embryonale ontwikkeling, waarna de pool grootte wordt onderhouden door zelf-vernieuwing celdelingen. Het identificeren van de anatomische oorsprong van HSC en de kritische ontwikkeling gebeurtenissen reguleren van het proces van HSC ontwikkeling is ingewikkeld als veel lokalisaties deel te nemen tijdens de foetale hematopoiesis. Recent identificeerden we de placenta als een belangrijk orgaan waar hematopoietische HSC&#39;s worden gegenereerd en uitgebreid in een unieke microenvironmental niches (Gekas, et al. 2005, Rhodos, et al. 2008). Bijgevolg is de placenta is een belangrijke bron van HSC tijdens hun opkomst en de eerste uitbreiding. In dit artikel tonen we dissectie technieken voor de isolatie van murine placenta van E10.5 en E12.5 embryo&#39;s, die overeenkomen met de ontwikkelingsstadia van de inleiding van HSC en de piek in de grootte van de HSC zwembad in de placenta, respectievelijk. Daarnaast presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor enzymatische en mechanische dissociatie van placenta weefsel in de single-cell suspensie voor gebruik in de flowcytometrie of functionele assays. We hebben gevonden dat het gebruik van collagenase voor single-celsuspensie van placenta voldoende opbrengsten van HSC geeft. Een belangrijke factor die van invloed HSC opbrengst van de placenta is de mate van mechanische dissociatie voorafgaand aan, en de duur van, enzymatische behandeling. We bieden ook een protocol voor de bereiding van vaste-ingevroren placenta weefsel secties voor de visualisatie van de ontwikkeling van HSC door middel van immunohistochemie in hun precieze cellulaire niches. Als hematopoietische specifieke antigenen zijn niet bewaard gebleven tijdens de bereiding van paraffine ingebedde coupes, we routinematig gebruik van vaste vriescoupes voor het lokaliseren van de placenta HSCs en voorouders.

We hebben de placenta als een belangrijk hematopoietische organen tijdens de ontwikkeling. Wij vonden dat hematopoietische stamcellen (HSC&#39;s) zijn beide gegenereerd en uitgebreid in de placenta in unieke microenvironmental niches. We beschrijven hier experimentele technieken die nodig zijn voor isolatie en visualisatie van HSC in de muis placenta.

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Hematopoëtische stamcellen (HSC's) hebben het vermogen om zichzelf te vernieuwen en alle celtypen van de bloedlijnen te genereren gedurende het hele leven van een individu. ...

Hallo, ik ben Mikkola en welkom in mijn laboratorium. De primaire focus van ons lab is het onderzoeken van de ontwikkeling van hematopoëtische stamcellen. Tijdens de embryogenese hebben we de placenta geïdentificeerd als een belangrijk hematopoëtisch orgaan en hebben we ontdekt dat hematopoëtische stamcellen in unieke micro-omgevingsniches in de placenta zowel worden gegenereerd als uitgebreid.Hierdoor heeft de placenta een enorme waarde als bron van hematopoëtische stamcellen tijdens hun ontstaan en initiële expansie. Vandaag zullen de leden van mijn lab de experimentele technieken demonstreren die nodig zijn voor de isolatie van hematopoëtische stamcellen uit de placenta en het visualiseren van HCS in hun unieke micro-omgevingsniches. Hallo, ik ben Chriss Geka van het laboratorium van Dr. Hannah Mola van de afdeling Moleculaire Cel- en Ontwikkelingsbiologie aan de UCLA.Vandaag zal ik u laten zien hoe u de placenta van een muis moet dissekeren en hoe u een enkelcellige suspensie van placentawevsel bereidt voor FACS-analyse van foetale hematopoëtische stamcellen. En ik ben Katrina Rhodes, en ik zal u laten zien hoe u placentawevsel bereidt voor immunohistochemie. Laten we beginnen.

isolation-and-analysis-of-hematopoietic-stem-cells-from-the-placenta

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video laat zien hoe de dooierzak en de aorta-gonaden-mesonephros regio micro-ontleden van embryo's en het gebruik flowcytometrie om hematopoietische stamcellen te sorteren.

Isolatie van Vroege hematopoietische stamcellen van muizen dooierzak en AGM

Een methode om de verdeling van beenmerg hematopoietische stamcellen in flowcytometrie en efficiënt isoleren sterk gezuiverde hematopoietische stamcellen (HSC) analyse beschreven. De isolatie procedure is in hoofdzaak gebaseerd op magnetische verrijking van c-Kit + cellen en cel sortering tot HSCs voor cellulaire en moleculaire studies te zuiveren.

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

Twee technieken voor het isoleren van cellulaire lipide druppeltjes uit 1) gistcellen en 2) humane placenta worden gepresenteerd. De kern van beide procedures is dichtheidsgradiëntcentrifugatie, waar de resulterende drijvende laag met de druppeltjes gemakkelijk kan worden gevisualiseerd door oog, gewonnen, en gekwantificeerd door Western Blot analyse voor zuiverheid.

Isolatie van Cellulaire lipidedruppeltjes: Twee zuiveringstechnieken Vanaf gistcellen en Human placenta

Beschreven hierin is een protocol om de infiltrerende leukocyten van de decidua basalis en decidua parietalis - de menselijke moeder-foetus interface - te isoleren en verder te bestuderen. Dit protocol handhaaft de integriteit van celoppervlaktemarkeringen en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream-toepassingen, zoals bewezen door flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Human Maternal-foetale Interface

Beschreven hierin is een protocol om de infiltraterende leukocyten van weefsels bij de moeder-foetus interface (baarmoeder, decidua en placenta) van muizen te isoleren en te analyseren. Dit protocol behoudt de integriteit van de meeste celoppervlaktemarkers en levert voldoende levensvatbare cellen op voor downstream toepassingen, inclusief flowcytometrie-analyse.

Isolatie van leukocyten uit de Murine Tissues de Maternal-Fetal Interface

Hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPC) afgeleid van gespecialiseerde (hemogenic) endotheelcellen tijdens de ontwikkeling, maar weinig bekend over het proces waarbij sommige endotheelcellen specificeren bloedvormende worden. We tonen een stroom-cytometrie-gebaseerde methode waarmee gelijktijdige isolatie van hemogenic endotheelcellen en HSPC van muizen embryonale weefsels.

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

Hierin beschrijven we werkwijzen voor de ontleding van foetale en maternale weefsels van menselijke term placenta, gevolgd door isolatie en expansie van mesenchymale stamcellen / stromale cellen (MSC) van deze weefsels.

Isolatie en uitbreiding van mesenchymale stamcellen / stromale cellen afkomstig van menselijke placenta Tissue

Hier presenteren we een protocol voor de ontleding van menselijke navelstreng (UC) en foetale placenta monster in koord bekleding (CL), Wharton's gelei (WJ), cord-placenta junctie (CPJ) en foetale placenta (FP) voor het isoleren en karakterisering van mesenchymale stromale cellen (MSC's) met de explantaatkweek techniek.

Isolatie en karakterisering van mesenchymale stromale cellen uit menselijke navelstreng en foetale Placenta

Het doel van dit protocol is te isoleren van endotheliale voorlopercellen van bloed van de navelstreng. Enkele van de toepassingen zijn het gebruik van deze cellen als een biomarker voor het identificeren van patiënten met cardiovasculaire risico, behandeling van ischemische ziekten, en creëren weefsel-engineered vasculaire en hart ventiel construeert.

Isolatie van endotheliale voorlopercellen van menselijke navelstrengbloed

Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

We presenteren een stapsgewijs protocol voor de isolatie van lange termijn hematopoëtische stamcellen (LT-HSCs) en korte termijn HSC's (ST-HSCs) met behulp van het Hoxb5 reporter systeem.

Isolatiemethode voor hematopoëtische stamcellen op lange en korte termijn

Leer de isolatie van hematopoietische stamcellen uit muizenplacenta voor ontwikkelingsbiologie. Deze methode toont unieke micro-omgevingsniches en visualisatietechnieken voor stamcelonderzoek.

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Meer video's verkennen