Name: Trypsinizing en Steekenting zoogdiercellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-12T13:28:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Leer subcultuurmethoden voor hechting- en suspensiecellen om celviabiliteit te behouden. Deze visuele gids toont essentiële technieken voor gezonde celkweek in het laboratorium.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Cell Biology</a> .

De auteurs hebben niets te melden.

trypsinizing en steekenting zoogdiercellen

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Als cellen bereiken confluentie, moeten ze worden subcultuur of gepasseerd. Niet subcultuur confluent cellen resulteert in verminderde mitotische index en uiteindelijk in de cel de dood. De eerste stap in subcultuur is los te cellen van het oppervlak van de primaire cultuur schip door trypsinebehandeling of mechanische middelen. De resulterende celsuspensie is dan weer onderverdeeld, of reseeded, in de frisse culturen. Secundaire culturen worden gecontroleerd op groei en periodiek gevoed, en kunnen vervolgens worden subcultuur naar het tertiair culturen te produceren. De tijd tussen de passage van cellen varieert met de cellijn en is afhankelijk van de groei.

Als cellen bereiken confluentie, moeten ze worden subcultuur of gepasseerd. Deze video zal aantonen dat er een procedure voor de subcultuur zowel hechtende en vering cellen.

Trypsinizing en Steekenting zoogdiercellen

Zodra cellen confluency bereiken, moeten ze worden gesubcultured of gepassaged. Wanneer confluente cellen niet worden gesubcultured, resulteert dit in een verlaagde mitotische index en uiteindelijk in ...

Weefselkweektechnologie heeft een brede toepassing gevonden in het veld van de celbiologie. Echter vereisen gekweekte cellen regelmatig onderhoud om gezond te blijven. Wanneer cellen confluentie bereiken, moeten ze worden gesubcultured of gepassaged.Het nalaten hiervan resulteert in een verminderde groei en uiteindelijk in celdood. In deze video demonstreren we hoe we weefselkweekcellen kunnen onderhouden voor zowel adherente als suspensie-cellijnen. Hallo, ik ben Ricky van het laboratorium van Dr. LAN bij het Molecular Pathology Laboratories Network in Oost-Tennessee.Vandaag wil ik u twee technieken laten zien voor het passeren van suspensie- en adherente cellen. Om een plaat met cellen te passeren, beginnen we met een primaire cultuur die tot confluentie is gegroeid in een Petri-schaal van 60 millimeter of een tissue culture-fles van 25 centimeter kwadraat die vijf ml weefselkweekmedium bevat.We beginnen met het verwijderen van al het medium uit de primaire cultuur met de steriele pipet. Vervolgens wassen we de aanhechtende cellaag één of twee keer met een klein volume HBSS zonder calcium en magnesium bij 37 °C. Dit is om eventueel resterend foetaal runderserum te verwijderen dat de werking van het trypsine-enzym, dat in de volgende stap wordt toegevoegd, kan remmen.Voeg vervolgens voldoende warme trypsin-EDTA-oplossing toe aan de kweek zodat de adherente cellaag bedekt is. Daarna kunt u de plaat gedurende één tot twee minuten op een warmteplaat van 37 °C plaatsen. Tik na de incubatie tegen de bodem van de plaat op een vlak oppervlak om de cellen los te maken.Controleer de cultuur met een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen zijn afgerond, wat aangeeft dat ze zijn losgekomen van het oppervlak. Als de cellen onvoldoende zijn losgekomen, plaats de plaat dan nog een minuut of twee terug in de verwarmingsbak. Spoel na inspectie onder de microscoop de schaal met compleet medium en pipetteer de suspensie in een 15 mil conische buis die twee mils compleet medium bevat.Centrifugeer de cellen om een pellet te vormen en resuspendeer de pellet in compleet medium. Voeg vervolgens een gelijk volume cel-suspensie toe aan elke van de vers voorbereide en correct gelabelde platen. Alternatief kunnen de cellen worden geteld met een hemocytometer en worden verdund tot de gewenste dichtheid, zodat een specifiek aantal cellen aan elke plaat kan worden toegevoegd.Zorg ervoor dat elke plaat wordt gelabeld met de datum van de subcultuur en het passagenummer. Voeg na het toevoegen van de celsuspensie 1 ml vers medium toe aan elke nieuwe cultuur. Incubeer de platen vervolgens in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.Nadat u de cellen een nacht heeft geïncubeerd, voegt u vers medium toe aan de platen en plaatst u deze terug bij 37 graden. Zodra de plaat confluent is, kunt u de plaat opnieuw passageren door deze procedure te herhalen en indien nodig verder passageren. Nu laten we u zien hoe u cellen in suspensiecultuur passageert.Het verpakken van cellen in suspensiecultuur is eenvoudiger dan voor adherentiecellen. Voordat suspensieculturen worden verpakt, moeten de cellen in stand worden gehouden door elke twee tot drie dagen voeding toe te voegen totdat ze confluentie bereiken; dit is het moment waarop de cellen in de suspensie samenklonteren en het medium troebel oogt wanneer de kolf wordt rondgedraaid.Om dit te doen, haalt u de kolf met suspensiecellen uit de incubator, waarbij u er zorg voor draagt dat de cellen die naar de bodem van de kolf zijn gezakt niet worden verstoord. Verwijder aseptisch ongeveer een derde van het medium uit de kolf en vervang dit door een gelijk volume voorverwarmd medium bij 37 °C. Nadat u het medium heeft vervangen, draait u de kolf voorzichtig rond en plaatst u deze terug in de incubator bij 37 °C en 5% CO2.Als er minder dan 15 ml medium in de kolf aanwezig is, dient de kolf in een horizontale positie te worden geïncubeerd om het contact tussen de cellen en het medium te verbeteren. In overige gevallen kan de kolf verticaal worden geïncubeerd op de dagen dat de culturen niet worden gevoed. Controleer deze door de kolven te zwenken om de cellen te resuspenderen.Let goed op eventuele kleurveranderingen in het medium die duiden op een goede metabole groei. Zodra de culturen confluent zijn, wat ongeveer 2,5 miljoen cellen per ml moet zijn, kunnen ze worden gesubcultiveerd. Hiermee hebben we aangetoond hoe u gecultiveerde cellen kunt passageren voor zowel adherente als suspensieculturen.Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met al uw experimenten.

trypsinizing-and-subculturing-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

In dit rapport tonen we een systeem te isoleren en cultuur donor cellen van de muis borstklier, en orthotopically deze cellen transplantatie in ontvangende muizen om de stromale analyseren: epitheel interacties tijdens mammatumor ontwikkeling.

Borstklieren transplantatie van stromale cellen en carcinoom cellen in C57BL/6J Muizen

This video demonstrates a technique to study the in vivo localization of tumor-specific antibodies in a mouse tumor xenograft model. Upon subcutaneously injecting cancer cells into mice for tumor formation, fluorescently-labeled antibodies are injected that bind to tumor-specific receptors, enabling in vivo assessment of antibody localization via imaging.

A Technique to Assess the In Vivo Localization of Tumor-Specific Antibodies

The video demonstrates an assay for assessing bulk autophagic sequestration activity in mammalian cells. It utilizes electroporation to release cytosolic proteins, including lactate dehydrogenase (LDH). The sequestered LDH and total cellular LDH fractions are determined to assess LDH sequestration, providing insights into the overall bulk sequestration activity.

Quantifying Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

This video demonstrates a protocol for isolating and culturing primary cerebral cortex cells from the dorsolateral telencephalon of mouse embryos.

Isolation and Culturing of Cells from Mouse Embryo Dorsolateral Telencephalons

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

We beschrijven procedures voor etikettering en genotypering pasgeboren muizen en het genereren van primaire neuronale kweken van hen. De genotypering is snel, efficiënt en betrouwbaar, en maakt geautomatiseerde nucleïnezuur extractie. Dit is vooral handig neonataal dodelijke muizen en culturen die voorafgaande afronding genotyperen vereisen.

Snelle Genotypering van dieren Gevolgd door Vaststelling Primaire culturen van neuronen in de hersenen

Het doel van dit protocol is het isoleren van epidermale keratinocyten uit de rughuid van volwassen muizen voor een verscheidenheid aan downstreamtoepassingen zoals moleculaire biologie, biochemie, fluorescentie geactiveerde celsortering en primair in vitro gebruik (bijv. clonogene keratinocyten).

Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Leer subcultuurmethoden voor hechting- en suspensiecellen om celviabiliteit te behouden. Deze visuele gids toont essentiële technieken voor gezonde celkweek in het laboratorium.

Trypsinizing en Steekenting zoogdiercellen

Meer video's verkennen