Trypsinizing en Steekenting zoogdiercellen

Weefsel gekweekte technologie heeft een brede toepassing gevonden op het gebied van celbiologie. Gekweekte cellen hebben echter regelmatig onderhoud nodig om gezond te blijven. Als cellen confluency bereiken, moeten ze worden gesubcultiveerd of gepasseerd.

Mislukking hierin resulteert in verminderde groei en uiteindelijk celdood. In deze video demonstreren we hoe je weefselkweekcellen kunt onderhouden voor zowel adherente als suspensie cellijnen. Hallo, ik ben Ricky hier in het laboratorium van Dr.LAN bij het Molecular Pathology Laboratories Network in East Tennessee.

Vandaag wil ik je twee technieken laten zien voor het verpakken van suspensie- en adhesiecellen. Om een plaat met cellen te passeren. We willen beginnen met een primaire cultuur die is gekweekt tot confluency in een 60 millimeter petrischaal of een 25 centimeter vierkante weefselkweekfles die vijf milliliter weefselkweekmedium bevat.

We beginnen door al het medium van de primaire cultuur te verwijderen met de steriele pipette. Vervolgens wassen we de adhesieve celmonolaag een of twee keer met een klein volume van 37 graden Celsius HBSS zonder calcium en magnesium. Om eventueel resterend foetaal bovien serum te verwijderen dat de werking van het trypsine-enzym dat in de volgende stap wordt toegevoegd, kan remmen.

Voeg vervolgens voldoende warme trypsine EDTA-oplossing toe aan de cultuur zodat je de adhesieve cellageer bedekt. Vervolgens kunt u de plaat gedurende een tot twee minuten op een verwarmende lade van 37 graden Celsius plaatsen. Na de incubatie tikt u op de bodem van de plaat op een vlakke ondergrond om de cellen los te maken.

Controleer de cultuur met een omgekeerd microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen afgerond zijn, wat aangeeft dat ze los zijn van het oppervlak. Als de cellen niet voldoende los zijn, brengt u de plaat terug naar de verwarmende lade voor een extra minuut of twee. Na het kijken door de microscoop, spoelt u de schaal in compleet medium en pipetteert u de suspensie in een 15 ml conische buis met twee ml compleet medium.

Spin de cellen naar beneden om ze te pelleren en resuspendeer de pellet in compleet medium. Voeg nu een gelijk volume celsuspensie toe aan elk van de verse platen die op de juiste manier zijn gelabeld. Alternatief kunnen de cellen worden geteld met behulp van een hemo cytometer en verdund tot de gewenste dichtheid, zodat een specifiek aantal cellen aan elke plaat kan worden toegevoegd.

Zorg ervoor dat elke plaat is gelabeld met de datum van de subcultuur en het passagenummer. Nadat u de celsuspensie hebt toegevoegd, plaatst u één ml vers medium in elke nieuwe cultuur. Bewaar de platen nu in een bevochtigde 37 graden Celsius 5%CO2 incubator.

Nadat je de cellen een nacht hebt geïncubeerd, voeg je vers medium toe aan de platen en zet je ze terug op 37 graden. Zodra de plaat is gegroeid tot confluency, kun je de plaat opnieuw passeren door deze procedure te herhalen en door te gaan met passeren zoals nodig is. Nu laten we je zien hoe je cellen in suspensiekweek passeert.

Cellen verpakken in suspensiekweek is eenvoudiger dan voor adhesiecellen. Voordat suspensieculturen worden verpakt, moeten de cellen worden onderhouden door elke twee tot drie dagen te voeren tot ze confluency bereiken, dat is wanneer de cellen in de suspensie samenklonteren en het medium troebel lijkt. Wanneer de fles wordt gezwaaid.

Om dit te doen, verwijdert u de fles met suspensiecellen uit de incubator, zorg ervoor dat u degenen die zich op de fles hebben gesetteld niet verstoort. Verwijder en gooi ongeveer een derde van het medium uit de fles en vervang het door een gelijk volume voorverwarmd medium op 37 graden Celsius. Nadat u het medium hebt veranderd, zwaait u de fles en plaatst u deze terug in de incubator, die op 37 graden Celsius, 5%CO2 staat.

Als er minder dan 15 ml medium in de fles zit, incubeer dan de fles in een horizontale positie om de contact tussen cel en medium te verbeteren. Anders kan de fles verticaal worden geïncubeerd op de dagen dat de culturen niet worden gevoed. Controleer ze door de flats te zwaaien om de cellen opnieuw te suspenderen.

Zorg ervoor dat u eventuele kleurveranderingen in het medium observeert die goede metabolische groei aangeven. Zodra de culturen confluent zijn, wat ongeveer 2,5 miljoen cellen per ml zou moeten zijn, kunt u ze passeren. Nogmaals, we hebben je net laten zien hoe je gekweekte cellen kunt passeren voor zowel adherente als suspensieculturen.

Dat is het. Bedankt voor het kijken en veel succes met al je experimenten.