Invriezen, ontdooien, en verpakking Cellen van Verkeer

Celculturen worden gebruikt in een breed scala aan onderzoeks- en diagnostische toepassingen. Het is soms wenselijk om cellijnen op te slaan voor toekomstig werk om cellen te behouden, senescentie te voorkomen, het risico op contaminatie te verminderen en de effecten van genetische drift te minimaliseren. Cellijnen kunnen worden ingevroren voor langetermijnopslag.

In deze video laten we zien hoe u cellen die zowel in een monolaag als in suspensie zijn gekweekt, kunt invriezen en hoe u deze vervolgens weer ontdooit voor verdere groei. Hallo, ik ben Ricky uit het laboratorium van Dr. LAN bij het Molecular Pathology Laboratories Network in Oost-Tennessee. Vandaag ga ik u laten zien hoe u cellen invriest voor langdurige bewaring en hoe u ze ontdooit uit vloeibare stikstof.

Om menselijke adherente cellen te invriezen, begint u met het losmaken van de cellen van de plaat, zoals u dat ook zou doen bij het prepareren voor passage. Houd er rekening mee dat het voor cryopreservatie het beste is om cellen te gebruiken die zich in de logaritmische groeifase bevinden. Zodra de cellen zijn losgekomen en u de trypsinereactie heeft gestopt door serum of medium dat serum bevat toe te voegen, brengt u de celsuspensie over naar een steriele centrifugebuis en voegt u twee milliliter toe.

Compleet medium met serumcellen uit drie of meer schalen van dezelfde subcultuur van dezelfde bron kunnen worden samengevoegd in één buis. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 tot 350 Gs bij kamertemperatuur. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer het pellet in 10 ml bij 4 °C.

Voeg aan het complete medium een gelijk volume vriesmedium van vier graden toe, meng de cellen grondig en plaats de buis vervolgens op ijs om de cellen te tellen. Gebruik een hemocytometer om de suspensie verder te verdunnen met vriesmedium, zodat een uiteindelijke celconcentratie van 1 miljoen of 10 miljoen cellen per milliliter wordt bereikt om cellen uit een bijna confluente fles van 25 vierkante centimeter te vriezen. Resuspendeer in ongeveer drie ml vriesmedium en pipetteer aliquots van één ml cel-suspensie in gelabelde cryovials van twee ml.

Zorg ervoor dat de doppen van de vials goed zijn aangedraaid. Plaats de vials één uur tot een nacht in een vriezer van -80 °C en breng ze vervolgens over naar een vriesbewaarkast met vloeibare stikstof. Het invriezen van cellen uit een suspensiecultuur is in principe vergelijkbaar met het invriezen van cellen uit een monolaag.

Het belangrijkste verschil is dat suspensieculturen niet eerst getrypsiniseerd hoeven te worden; breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis en centrifugeer 10 minuten bij 300 tot 350 Gs bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellet in vriesmedium bij vier graden met een dichtheid van 1 miljoen tot 10 miljoen cellen per ml.

Breng vervolgens aliquots van 1 ml van de celstuspensie over in cryovials en vries deze in. Zoals reeds gedemonstreerd voor monolaagculturen in het vorige hoofdstuk, volgt hier de procedure om bevroren vials te ontdooien en te herstellen. Haal eerst de vial met cellen uit de vloeibare stikstofvriezer en plaats deze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C.

Schud het flaconnetje continu tot het medium is ontdooid, wat doorgaans minder dan 60 seconden duurt. Veeg na het ontdooien de bovenkant van het flaconnetje af met 70% ethanol voordat u het opent. Breng vervolgens de ontdooide cel-suspensie over naar een steriele centrifugebuis die 2 mL warm compleet medium en 20% foetaal kalfsserum bevat en centrifugeer deze.

Centrifuge dit gedurende 10 minuten bij 150 tot 200 ×g bij kamertemperatuur. Deze stap verwijdert alle resterende DMSO na centrifugatie; gooi het supernatant weg en resuspendeer het celpellet voorzichtig in een kleine hoeveelheid (ongeveer 1 mL) compleet medium met 20% FBS. Breng dit over naar een correct gelabelde kweekplaat met de juiste hoeveelheid medium. Over het algemeen is 1 mL cel-suspensie nodig in 5 tot 20 mL medium.

Plaats de cellen nu in een incubator bij 37 °C om gedurende 24 uur te laten groeien. Controleer of de cellen na vijf tot zeven dagen aan de plaat zijn gehecht; wanneer de pH-indicator in het medium van kleur verandert, dient het medium te worden vervangen. Houd de culturen in een medium met 20% FBS totdat de cellijn is hersteld.

Als de herstelsnelheid extreem laag is, kan het zijn dat slechts een subpopulatie van de oorspronkelijke cultuur groeit. Wees hier vooral voorzichtig mee bij het werken met cellijnen waarvan bekend is dat ze mozaïek zijn. Als culturen verzonden moeten worden, kan dit eenvoudig worden gedaan voor zowel monolaag- als suspensieculturen.

In weefselkweekflessen van 25 centimeter worden cellen gekweekt tot bijna confluentie in een monolaag of tot de gewenste dichtheid in suspensie. Voor monolaagculturen wordt het medium eerst verwijderd en wordt de fles vervolgens gevuld met vers medium. Het is essentieel dat de fles volledig met medium is gevuld om te voorkomen dat de cellen uitdrogen als de flessen tijdens het transport worden omgekeerd.

Voor verse suspensieculturen wordt medium toegevoegd om de kolf te vullen. De dop wordt stevig aangedraaid en vastgezet met Parafilm. De kolf wordt afgesloten in een lekvrije plastic zak of een andere lekvrije houder die is ontworpen om morsen te voorkomen.

In het geval dat de kolf beschadigd raakt, wordt de primaire houder in een secundaire geïsoleerde houder geplaatst om deze tijdens het transport te beschermen tegen extreme temperaturen. Een label voor biologisch gevaar wordt op de buitenkant van de verpakking aangebracht. Over het algemeen worden culturen vervoerd via koeriersdiensten met levering op dezelfde dag of de volgende dag.

We hebben u zojuist laten zien hoe u menselijke celculturen kunt invriezen en ontdooien, zowel voor adherente als suspensiecellen. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met al uw experimenten.