Name: Invriezen, ontdooien, en verpakking Cellen van Verkeer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer hoe u zoogdiercellen invriest en ontdooit voor langdurige opslag in vloeibare stikstof. Deze technieken behouden celviabiliteit en zijn essentieel voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De volledige tekst protocol voor deze experimentele aanpak is beschikbaar in <a class="jove_content" href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract">Current Protocols in Cell Biology.</a>

De auteurs hebben niets te melden.

invriezen, ontdooien, en verpakking cellen van verkeer

Freezing, Thawing, and Packaging Cells for Transport

Gekweekte zoogdiercellen worden op grote schaal gebruikt in de celbiologie studies. Het vereist een aantal speciale vaardigheden om te kunnen om de structuur, functie, gedrag en biologie van de cellen in cultuur te bewaren. Deze video beschrijft de basisvaardigheden die nodig zijn om te bevriezen en op te slaan cellen en hoe om bevroren voorraden herstellen.

Gekweekte zoogdiercellen worden op grote schaal gebruikt in de celbiologie studies. Deze video beschrijft de basisvaardigheden die nodig zijn om te bevriezen en op te slaan cellen en hoe om bevroren voorraden herstellen.

Invriezen, ontdooien, en verpakking Cellen van Verkeer

Gekweekte zoogdiercellen worden uitgebreid gebruikt in celbiologische studies. Er zijn een aantal speciale vaardigheden vereist om in staat te zijn het ... te behouden

Celculturen worden gebruikt in een breed scala aan onderzoeks- en diagnostische toepassingen. Het is soms wenselijk om cellijnen op te slaan voor toekomstig werk om cellen te behouden, senescentie te voorkomen, het risico op contaminatie te verminderen en de effecten van genetische drift te minimaliseren. Cellijnen kunnen worden ingevroren voor langetermijnopslag.In deze video laten we zien hoe u cellen die zowel in een monolaag als in suspensie zijn gekweekt, kunt invriezen en hoe u deze vervolgens weer ontdooit voor verdere groei. Hallo, ik ben Ricky uit het laboratorium van Dr. LAN bij het Molecular Pathology Laboratories Network in Oost-Tennessee. Vandaag ga ik u laten zien hoe u cellen invriest voor langdurige bewaring en hoe u ze ontdooit uit vloeibare stikstof.Om menselijke adherente cellen te invriezen, begint u met het losmaken van de cellen van de plaat, zoals u dat ook zou doen bij het prepareren voor passage. Houd er rekening mee dat het voor cryopreservatie het beste is om cellen te gebruiken die zich in de logaritmische groeifase bevinden. Zodra de cellen zijn losgekomen en u de trypsinereactie heeft gestopt door serum of medium dat serum bevat toe te voegen, brengt u de celsuspensie over naar een steriele centrifugebuis en voegt u twee milliliter toe.Compleet medium met serumcellen uit drie of meer schalen van dezelfde subcultuur van dezelfde bron kunnen worden samengevoegd in één buis. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 300 tot 350 Gs bij kamertemperatuur. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspendeer het pellet in 10 ml bij 4 °C.Voeg aan het complete medium een gelijk volume vriesmedium van vier graden toe, meng de cellen grondig en plaats de buis vervolgens op ijs om de cellen te tellen. Gebruik een hemocytometer om de suspensie verder te verdunnen met vriesmedium, zodat een uiteindelijke celconcentratie van 1 miljoen of 10 miljoen cellen per milliliter wordt bereikt om cellen uit een bijna confluente fles van 25 vierkante centimeter te vriezen. Resuspendeer in ongeveer drie ml vriesmedium en pipetteer aliquots van één ml cel-suspensie in gelabelde cryovials van twee ml.Zorg ervoor dat de doppen van de vials goed zijn aangedraaid. Plaats de vials één uur tot een nacht in een vriezer van -80 °C en breng ze vervolgens over naar een vriesbewaarkast met vloeibare stikstof. Het invriezen van cellen uit een suspensiecultuur is in principe vergelijkbaar met het invriezen van cellen uit een monolaag.Het belangrijkste verschil is dat suspensieculturen niet eerst getrypsiniseerd hoeven te worden; breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis en centrifugeer 10 minuten bij 300 tot 350 Gs bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens het supernatant en resuspendeer de pellet in vriesmedium bij vier graden met een dichtheid van 1 miljoen tot 10 miljoen cellen per ml.Breng vervolgens aliquots van 1 ml van de celstuspensie over in cryovials en vries deze in. Zoals reeds gedemonstreerd voor monolaagculturen in het vorige hoofdstuk, volgt hier de procedure om bevroren vials te ontdooien en te herstellen. Haal eerst de vial met cellen uit de vloeibare stikstofvriezer en plaats deze onmiddellijk in een waterbad van 37 °C.Schud het flaconnetje continu tot het medium is ontdooid, wat doorgaans minder dan 60 seconden duurt. Veeg na het ontdooien de bovenkant van het flaconnetje af met 70% ethanol voordat u het opent. Breng vervolgens de ontdooide cel-suspensie over naar een steriele centrifugebuis die 2 mL warm compleet medium en 20% foetaal kalfsserum bevat en centrifugeer deze.Centrifuge dit gedurende 10 minuten bij 150 tot 200 ×g bij kamertemperatuur. Deze stap verwijdert alle resterende DMSO na centrifugatie; gooi het supernatant weg en resuspendeer het celpellet voorzichtig in een kleine hoeveelheid (ongeveer 1 mL) compleet medium met 20% FBS. Breng dit over naar een correct gelabelde kweekplaat met de juiste hoeveelheid medium. Over het algemeen is 1 mL cel-suspensie nodig in 5 tot 20 mL medium.Plaats de cellen nu in een incubator bij 37 °C om gedurende 24 uur te laten groeien. Controleer of de cellen na vijf tot zeven dagen aan de plaat zijn gehecht; wanneer de pH-indicator in het medium van kleur verandert, dient het medium te worden vervangen. Houd de culturen in een medium met 20% FBS totdat de cellijn is hersteld.Als de herstelsnelheid extreem laag is, kan het zijn dat slechts een subpopulatie van de oorspronkelijke cultuur groeit. Wees hier vooral voorzichtig mee bij het werken met cellijnen waarvan bekend is dat ze mozaïek zijn. Als culturen verzonden moeten worden, kan dit eenvoudig worden gedaan voor zowel monolaag- als suspensieculturen.In weefselkweekflessen van 25 centimeter worden cellen gekweekt tot bijna confluentie in een monolaag of tot de gewenste dichtheid in suspensie. Voor monolaagculturen wordt het medium eerst verwijderd en wordt de fles vervolgens gevuld met vers medium. Het is essentieel dat de fles volledig met medium is gevuld om te voorkomen dat de cellen uitdrogen als de flessen tijdens het transport worden omgekeerd.Voor verse suspensieculturen wordt medium toegevoegd om de kolf te vullen. De dop wordt stevig aangedraaid en vastgezet met Parafilm. De kolf wordt afgesloten in een lekvrije plastic zak of een andere lekvrije houder die is ontworpen om morsen te voorkomen.In het geval dat de kolf beschadigd raakt, wordt de primaire houder in een secundaire geïsoleerde houder geplaatst om deze tijdens het transport te beschermen tegen extreme temperaturen. Een label voor biologisch gevaar wordt op de buitenkant van de verpakking aangebracht. Over het algemeen worden culturen vervoerd via koeriersdiensten met levering op dezelfde dag of de volgende dag.We hebben u zojuist laten zien hoe u menselijke celculturen kunt invriezen en ontdooien, zowel voor adherente als suspensiecellen. Dat was alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met al uw experimenten.

freezing-thawing-and-packaging-cells-for-transport

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier laten we zien hoe onze lab TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen bevriest.

Invriezen menselijke embryonale stamcellen

Sinds James Thomson et al. ontwikkelde een techniek in 1998 te isoleren en HES groeien in de cultuur, hebben vriescellen voor later gebruik en ontdooien en uitbreiden van cellen van een ingevroren voorraad belangrijk geworden procedures uitgevoerd in routine hES celkweek. Omdat hES-cellen zijn zeer gevoelig voor de stress van het invriezen en ontdooien, speciale aandacht genomen. Hier laten we zien de juiste techniek voor het snel ontdooien van hES cellen van vloeibare stikstof voorraden,...

Invriezen en ontdooien van menselijke embryonale stamcellen

Illustreren we hier hoe u elektron cryotomography (ECT) te gebruiken om de ultrastructuur van bacteriële cellen in near-native staten studie, om "macromoleculaire" (~ 4 nm) resolutie.

Electron Cryotomography van bacteriële cellen

Vriesdrogen is vaak een eenvoudige en handige manier om droge producten van levensvatbare bacteriële cellen te verkrijgen. Een kwestie van het proces is overleving van de cel. We detail hier een procedure te onderzoeken hoe celoverleving gedurende vriesdrogen wordt beïnvloed door de eigenschappen van de formulering.

Formuleringen voor Vriesdrogen van bacteriën en hun invloed op de overleving van de cel

Het verkrijgen van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscoopbeelden is een uitdaging, vooral in het geval van plantencellen, die overvloedige grote watergevulde vacuolen en beluchte ruimtes hebben. Tandem hogedrukvriestechniek en snelle vriessubstitutie verminderen de bereidingstijd van plantenmonsters voor TEM aanzienlijk, terwijl ze monsters produceren met uitstekende ultrastructurele behoud.

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.

Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy

Drosophila cellijnen zijn belangrijke reagentia voor zowel fundamenteel als biomedisch onderzoek. Dit artikel bevat de protocollen voor ontdooien, subcultuur en cryopreservatie van veelgebruikte Drosophila cellijnen aan onderzoekers helpen om het gebruik van deze reagentia in hun onderzoek op te nemen.

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Hier laten we zien hoe het sandwich-vriesapparaat kan worden gebruikt voor het snel invriezen van biologische monsters, waaronder bacteriën, gist, gekweekte cellen, geïsoleerde cellen, dierlijke en menselijke weefsels en virussen. We laten ook zien hoe u monsters kunt voorbereiden op ultradunne secties na snelvriezen.

Snelvriezen met behulp van sandwichbevriezingsapparaat voor goed ultrastructureel behoud van biologische monsters in elektronenmicroscopie

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

Leer hoe u zoogdiercellen invriest en ontdooit voor langdurige opslag in vloeibare stikstof. Deze technieken behouden celviabiliteit en zijn essentieel voor celbiologisch onderzoek.

Invriezen, ontdooien, en verpakking Cellen van Verkeer

Meer video's verkennen