Name: Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-25T18:13:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Leer myeloïde dendritische cellen kweken uit muizenbeenmerg voor immunologisch onderzoek en vaccinontwikkeling. Deze methode omvat isolatie, differentiatie en flowcytometrische analyse van celrijping.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

JB wordt ondersteund door studiebeurzen van het Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC). Steun voor dit project is verstrekt door de Canadese Institutes of Health Research, Grant MOP-67066.

Dit protocol is een aangepaste versie van Lutz et al. 1. Oogst en verwerking van het beenmerg <ol><li> Isolatie van het scheenbeen en dijbeen: euthanaseren de donor muis en spuit de benen met 70% ethanol. Stevig vastpakken de eerste enkel met stompe tang en begint weg te snijden van de huid en de onderliggende spieren aan het scheenbeen bloot te leggen. Om te voorkomen dat schade aan het bot, langzaam en parallel gesneden om de tibia, waardoor het kniegewricht intact. Voor het reinigen van het dijbeen, immobiliseren het kniegewricht door vast te pakken met stompe tang. Reinig de spieren weg met een scherpe schaar en gebogen pincet. Ga verder naar boven tot aan het heupgewricht wordt blootgesteld en een schaar kan worden geplaatst tussen de kop van het dijbeen en het heupgewricht. Verwijder de botten door te snijden tussen femur en heup en plaats in de fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs. </li><li> Verwijderen van het beenmerg: Schoon overgebleven spieren van de botten met een schaar en gebogen pincet. Snijd de epifysen van elk bot en zoek het midden holte. Met behulp van een 10 ml spuit vol met PBS en een 25G0.5 &quot;naald, spoelt het beenmerg in een niet-gecoate weefsel petrischaal. </li><li> Verwerking van het beenmerg: Gebruik de rubberen uiteinde van de zuiger van een 1 ml spuit om het beenmerg dissociëren in een single-celsuspensie (gebruik een op en neer, niet schrapen beweging). Verzamel beenmerg in een conische falcon buis, en spoel resterende beenmerg met PBS. </li></ol> Cultuur van dendritische cellen <ol><li> Resuspendeer cellen in DC media en tel DC voorlopers op een hemocytometer (figuur 1). U ziet de cellen van verschillende grootte, de DC-precursoren zijn de grootste en helderste. Differentieel tellen alleen deze cellen. Van twee dijbeen en twee dij van een wild-type C57Bl / 6 muis (6-8 weken oud), kunt u verwachten tussen de 25 tot 40 x 10 6 in totaal DC-precursoren. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_3/article769_figure_1.jpg" alt="" width="218" height="217" /> Figuur 1 </li><li> Cultuur-cellen bij een dichtheid van 2 x 10 5 DC voorlopers / ml in DC media aangevuld met 40 ng / ml recombinant muizen GM-CSF. Plaat cellen in niet-weefsel-gecoate polystyreen petri platen. </li></ol> Voeg media (dag 3) Op te frissen de media, voeg de helft van het totale volume van vers medium aangevuld met 40 ng / mL GM-CSF. Vervang een derde van de media (dag 6) en rijping Op te frissen de media, verwijder voorzichtig een derde van het totale volume van de media en vervang dit volume met verse DC media aangevuld met 40 ng / mL GM-CSF op dag 6 van de cultuur. Indien gewenst, kan dendritische cellen worden gestimuleerd om te rijpen gebruik van cytokines of toll-like receptor liganden. In de video, kregen ontwikkelingslanden gerijpt door &#39;s nachts stimulatie met 5 ng / mL CpG. Oogst van dendritische cellen DC cultuur is voltooid (figuur 2). Cellen worden zowel in suspensie en losjes gehandeld op grond van de plaat. Aangehouden cellen kunnen worden verwijderd door schrapen de schotel met een weefselkweek schraper en spoelen met PBS. Het totale aantal cellen zullen 5-8 voudige toename in de week-lange cultuur en differentiatie periode, daarom verwachten dat 1 tot 1,6 x 10 6 cellen / ml oogst. <img src="/files/ftp_upload/old/769_2008_6_30_5/article769_figure_2.jpg" alt="Figuur 2" width="407" height="358" /> Figuur 2 Reagentia <ol><li> DC media <ol><li> RPMI-1640 media, aangevuld met: </li><li> 10% foetaal runderserum </li><li> 100 IU / ml penicilline </li><li> 100 ug / ml streptomycine </li><li> 1% L-glutamine </li><li> 0,1% 2-mercapto-ethanol </li><li> 1X niet-essentiële aminozuren </li><li> 1X natriumpyruvaat </li></ol></li><li> Recombinant muizen GM-CSF <ol><li> rmGM-CSF (Peprotech inc, New Jersey, catalogus zonder. 315-03) </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lutz, M. B., Kukutsch, N., Ogilvie, A. L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> J. Immunol. Methods. 223, 77-92 (1999).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J. Clin. Invest. 117, 1195-1203 (2007).</li>
</ol>

DC&#39;s zijn nuttig voor studies van aangeboren en adaptieve immuunsysteem interacties, en kan worden gebruikt als vaccin vector. In deze video, hebben we aangetoond dat de stappen om beenmerg te isoleren en te differentiëren myeloïde dendritische cellen in vitro. Na de cultuur periode kunnen deze cellen microscopisch gevisualiseerd worden zowel als hechtende cellen, die vaak beschikken over dendrieten, en niet-klevende ronde cellen. De DCS kan verder worden gemanipuleerd voor antigeen presentatie door pulseren met een antigeen of gestimul...

<table><tbody><tr><td>recombinant muis GM-CSF</td><td>Reagens</td><td>Peptrotech</td><td>315-03</td><td></td></tr></tbody></table>

cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Myeloïde dendritische cellen (DC&#39;s) worden vaak gebruikt om de interacties tussen de aangeboren en adaptieve immuun mechanismen en het begin van de reactie op de infectie te bestuderen. Omdat dit de meest potente antigeen presenterende cellen, worden DCs steeds meer gebruikt als vaccin vector voor de inductie van antigeen-specifieke immuunrespons te bestuderen. In deze video, tonen we de procedure voor het oogsten dij-en bovenbenen van een donor muis, de verwerking van het beenmerg en differentiëren DC&#39;s in vitro. De eigenschappen van DCs te veranderen na stimulatie: onrijpe dendritische cellen zijn krachtige fagocyten, terwijl de rijpe DCs zijn in staat om antigeen presentatie en interactie met CD4 + en CD8 + T-cellen. Deze verandering in functionele activiteit komt overeen met de opregulatie van celoppervlaktemerkers en cytokine productie. Veel agenten kunnen gebruikt worden om te rijpen DC&#39;s, zoals cytokines en toll-like receptor liganden. In deze video, tonen we flowcytometrische vergelijkingen van de expressie van twee co-stimulerende moleculen, CD86 en CD40, en de cytokine, IL-12, na &#39;s nachts stimulatie met CpG of modellen behandeling. Na de differentiatie, kan DCs verder worden gemanipuleerd voor gebruik als een vaccin vector of om antigeen-specifieke immuunrespons te genereren door in vitro pulserende met behulp van peptiden of eiwitten, of met behulp van recombinante getransduceerde virale vectoren.

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto&#39;s tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Myeloïde dendritische cellen (DC's) worden regelmatig gebruikt om de interacties tussen aangeboren en adaptieve immuunmechanismen en de vroege respons op ... te bestuderen.

Mijn naam is Jeanette Boudreaux, en vandaag wil ik u meenemen door de stappen om myeloïde dendritische cellen te kweken uit beenmergprecursoren. De myeloïde DC-lijn wordt steeds vaker gewaardeerd voor studies naar de wisselwerking tussen aangeboren en adaptieve immuniteit, en wordt daarnaast steeds vaker gebruikt als platform voor vaccinontwikkeling. Vandaag nemen we u mee door de stappen om de precursorcellen te isoleren, ze in culture te plaatsen en ze te differentiëren tot dendritische cellen.Daarna laat ik u een flowcytometrische analyse zien van de cellen vóór en na de rijping. Met het toll-like receptor-ligand prolifereren de cellen in vitro tijdens de kweekperiode, dus u kunt een ongeveer vijf tot achtvoudige toename van het totale aantal cellen verwachten ten opzichte van de precursoren die u op dag nul heeft uitgeplaat. De procedures die ik u vandaag laat zien, worden gedemonstreerd op een open laboratoriumbank, maar om de steriliteit te waarborgen, raad ik aan om uw kweken uit te voeren in een biologische veiligheidskabinet of een laminaire flow-kast.Om te beginnen heeft u een spuit van 10 ml nodig met een naald van 25 gauge gevuld met PBS, een gebogen pincet, een recht p

culture-of-myeloid-dendritic-cells-from-bone-marrow-precursors

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Antigeen presentatie in secundaire lymfoïde organen door de dendritische cellen is cruciaal voor de opening van het T-cel gemedieerde adaptieve immuunrespons. Hier laten we zien de cultuur van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, activering, en de etikettering voor 2-photon imaging.

Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

This video describes a protocol for the generation of dendritic cells--key antigen-presenting cells that activate T cells--from the bone marrow of an adult mouse.

Bone Marrow-Derived Dendritic Cells Generation: A Method to Generate Dendritic Cells from Mouse Bone Marrow

Immature dendritische cellen kunnen selectief worden gedifferentieerd in tolerogeen of rijpe dendritische cellen om het evenwicht tussen immuniteit en tolerantie te reguleren. Dit werk presenteert een manier om vanuit onrijpe, uit monocyten afgeleide dendritische cellen (moDC's) in vitro tolerogeen en rijpe moDC's te genereren die verschillen in metabolische fenotypen.

Generatie van onrijpe, Ouder en tolerogene dendritische cellen met verschillende Metabolic Phenotypes

Beendermergcellen gekweekt met granulocyte macrophage colony stimulerende factor (GM-CSF) genereren een heterogene cultuur die macrofagen en dendritische cellen (DC's) bevat. Deze methode benadrukt het gebruik van MHCII en hyaluronan (HA) binding om macrofagen te onderscheiden van de DC's in de GM-CSF cultuur. Macrofagen in deze cultuur hebben veel overeenkomsten met alveolaire macrofagen.

Generatie en identificatie van GM-CSF Afgeleide alveolaire-achtige macrofagen en dendritische cellen van de muis beenmerg

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Graft-versus-host ziekte is een belangrijke complicatie na allogene beenmergtransplantatie. Dendritische cellen spelen een cruciale rol in de pathogenese van graft-versus-host ziekte. Het huidige artikel beschrijft een nieuw beenmergtransplantatieplatform om de rol van dendritische cellen te onderzoeken bij de ontwikkeling van graft-versus-host ziekte en het graft-versus-leukemie-effect.

Beenmergtransplantatie Platform om de rol van dendritische cellen in graft-versus-host ziekte te onderzoeken

Hier presenteren we een protocol voor in vivo vergroting van gut-homing regulatoire T Cell inductie. In dit protocol zijn dendritische cellen ontworpen om lokaal hoge concentraties van de actieve vitamine D (1,25-dihydroxyvitamin D of 1,25 [OH]2d) en de actieve vitamine A (retinoïnezuur of RA) de Novo te produceren.

In vivo augmentatie van gut-homing regulatoire T Cell inductie

Hier presenteren we een economische en efficiënte methode om zeer zuivere beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen te isoleren en te genereren na 7 dagen cultuur met 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Economisch en efficiënt protocol voor het isoleren en kweken van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Leer myeloïde dendritische cellen kweken uit muizenbeenmerg voor immunologisch onderzoek en vaccinontwikkeling. Deze methode omvat isolatie, differentiatie en flowcytometrische analyse van celrijping.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Meer video's verkennen