Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

Vandaag laat ik u zien hoe u retina-coupes van de tijgersalamander kunt prepareren voor patchclamp-metingen. Eerst bereid ik twee soorten microscoopglaasjes voor. Wij gebruiken glaasjes met een vastgeplakt adhesieveld, zodat we deze als vloeistofkamers kunnen gebruiken.

Op het eerste objectglas breng ik twee parallelle banen vacuümvet aan. Vervolgens neem ik filterpapier en snijd ik dit in rechthoekige stukjes met behulp van een lichtstraal. Nu plaats ik een van de stukjes op de vetbanen en druk ik dit aan, zodat het goed aan het objectglas vastzit.

Ik doe hetzelfde voor het andere onderdeel. Het tweede type objectglas heeft kleine rubberen blokjes die erop zijn gelijmd. Voor nu breng ik alleen een beetje vacuümvet aan tussen de blokjes; daarna plaats ik een nieuw stukje scheermesje in de weefselsnijder.

Ten slotte leg ik de instrumenten klaar die ik tijdens de dissectie nodig heb: twee pincetten, één schaar en een instrument om het oog uit de kop te verwijderen om lichtopgewekte stromen te registreren. De dissectie dient onder IR-licht te worden uitgevoerd, maar voor demonstratiedoeleinden zal ik nu in het licht werken. Eerst verwijder ik het oog en plaats ik het onder de microscoop op een stukje tissuepapier, dat ik heb bevochtigd met ijskoude Ringer-oplossing.

Vervolgens verwijder ik overtollig bindweefsel van de oogbol om er zeker van te zijn dat het oog niet beschadigd raakt. Ik snijd altijd langs het oppervlak. Dit is wat u door de microscoop ziet.

Vervolgens gebruik ik een scheermesje om een kleine incisie in het hoornvlies te maken. Hiervoor houd ik het oog met de pincet vast terwijl ik de rand van het scheermesje in het hoornvlies druk. Daarna houd ik het hoornvlies met de pincet vast en verwijder ik dit met de schaar om de lens eruit te halen.

Ik oefen wat druk uit op de randen van de oogbeker zodat ik de lens gemakkelijk met mijn pincet kan bereiken. Vervolgens verwijder ik de iris. Ik houd de iris met de pincet vast terwijl ik langs de aura serato snij tot alleen de oogbeker overblijft.

Vervolgens snijd ik de I-cup in twee rechthoekige stukken. Ik snijd deze eerst doormidden en trim daarna de boven- en onderranden. Nu neem ik een van de eerder voorbereide objectglazen, pak een stuk I-cup en plaats dit met de retinazijde naar beneden op het filterpapier.

Ik trek vervolgens dit sclera omhoog zodat alleen het netvlies op het glaasje achterblijft. Daarna voeg ik snel onze spoeloplossing toe aan de kamer. Laten we de procedure herhalen voor het tweede stuk netvlies.

Maar deze keer kunt u door de microscoop kijken terwijl u het netvlies op het filterpapier plaatst. Ik gebruik de pincet in mijn linkerhand om voorzichtig op de sclera te drukken. Tot slot snijd ik het netvlies in plakjes van 200 tot 300 micrometer breed.

Vervolgens kies ik een coupesectie om te gebruiken voor mijn experimenten. Om een geschikte sectie te selecteren, moet ik de secties 90 graden draaien zodat ik de lagen van het retina kan zien. Ik kies een sectie die er onbeschadigd uitziet en duidelijke horizontale banden vertoont die de verschillende lagen aangeven.

Om de plakjes van de ene naar de andere objectglasplaat te verplaatsen, maak ik een Ringer-brug en verplaats ik de plakjes vervolgens voorzichtig door de oplossing. Wanneer ik het plakje neerleg, druk ik het tegen de rubberen blokjes zodat het filterpapier verticaal ten opzichte van het glas is georiënteerd. Nu ben ik klaar voor de patchclamp-meting.

We bewaren de intracellulaire oplossing in kleine porties in de vriezer, zodat we alleen de hoeveelheid ontdooien die we op één dag daadwerkelijk nodig hebben. Voordat we de elektroden vullen, filteren we de oplossing om kleine deeltjes te verwijderen die de tip van de elektrode zouden kunnen verstoppen. De patchelektroden worden getrokken uit borosilicaat capillair glas om opnames te maken van ganglioncellen.

Ik kies een instelling die elektroderesistenties tussen twee en vier megaohm produceert. Wanneer ik de elektroden vul, wil ik ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de elektrodepunt zitten. Door met de vinger tegen het glas te tikken, kunnen luchtbellen worden verwijderd.

Dit is de elektrodenhouder die aan de head stage is bevestigd. De elektroderol bevat een zilverchloride-draad. Dit is de randelektrode met een agar-brug.

Hier is de perfusiepipet. Deze is verbonden met een microperfusiesysteem met acht kanalen. De hoofdperfusie wordt door zwaartekracht aangestuurd; het is dus simpelweg een fles gevuld met wingers, waarbij de oplossing via deze buis naar de registratiekamer stroomt.

Om in het donker te kunnen opnemen, heb ik een IR-camera bevestigd aan de zijpoort van de microscoop, die is verbonden met een televisiescherm. Op de bovenpoort heb ik een beeldprojector aangesloten, waarmee ik visuele stimuli op het netvlies kan projecteren. En tot slot, de patchclamp-versterker.

Ik plaats nu de retinale slice onder de microscoop en voeg de grounding-elektrode toe aan het bad om de hoofdperfusie op te zetten. Vervolgens voeg ik de slang van het zwaartekrachtperfusiesysteem toe. De glazen buis aan de andere zijde is verbonden met een vacuümsysteem, waardoor het vloeistofniveau constant blijft.

Ik zorg er ook voor dat een zuigbuis is aangesloten op de elektrodehouder. Vervolgens plaats ik de microperfusiepipet. Ik laat deze in het bad zakken, gevolgd door het microscoopobjectief.

Zodra ik dicht bij het sneetje ben, trek ik het een klein beetje terug zodat de oplossing het sneetje raakt. Wanneer ik de perfusie inschakel, zou ik moeten zien dat het sneetje licht beweegt, zoals hier. Laten we nu op zoek gaan naar een geschikte cel om van te registreren.

We zoeken naar ganglioncellen, die zich aan de onderkant van de slice bevinden. Nu maak ik de elektrode gereed; voordat ik de elektrode in het bad breng, breng ik enige positieve druk aan. Zodra ik de elektrode onder de microscoop heb gevonden, laat ik deze zakken tot net boven de slice om een patch op een cel te maken.

Ik ben overgeschakeld naar het 40 x objectief. Nu stel ik de basisstroom naar nul en controleer ik de weerstand van de elektrode. De sealtest bestaat uit een reeks pulsen van 10 millivolt, waarmee ik kan vaststellen of er een goede afsluiting (seal) is bereikt tussen de elektrode en de cel.

Ik laat mijn elektrode nu zakken op de doelcel. Zodra ik een kuiltje op het cellichaam zie, laat ik de positieve druk uit de buis ontsnappen, waardoor een nauwe afsluiting wordt gevormd. De weerstand is nu zo hoog dat de stroomcurve er vlak uitziet.

De kleine uitschieters zijn capaciteitsartefacten van de elektrode. Deze kunnen als volgt worden gecompenseerd, waardoor ze nu verdwenen zijn. Ik zal nu proberen om de cel binnen te dringen.

Om dat te doen, breng ik voorzichtig kleine zuigpulsen aan op de buis die verbonden is met de schouder van de elektrode, en als alles goed gaat, zie je de stroomcurve als volgt veranderen. De spikes die je nu ziet, worden doorkruist door de membraancapaciteit en kunnen nu gecompenseerd worden; dit is een preparaat dat in het donker is voorbereid. Laten we kijken of we lichtgeëvoceerde responsen kunnen registreren.

Het spoor dat u op de oscilloscoop ziet, is de stroomrespons van een ganglioncel met een voltageclamp op minus 60 millivolt. De lichtstimuli die we gebruiken zijn heldere en donkere balken die worden gepresenteerd tegen een constante, uniforme achtergrond. De software van ons laboratorium toont de volledige registratie van één proef.

Men kan zien dat dit een 'off-cel' is als reactie op het begin van een donkere balk en het einde van een heldere balk. De witte lijn bovenaan geeft de duur van de stimulus aan. We kunnen nu experimenten uitvoeren waarbij we verschillende farmacologische middelen perfunderen.

Bijvoorbeeld kunnen we de GABAerge en glycinerge inhibitie blokkeren. Na minder dan een minuut wachten kunnen we hier gewoonlijk de effecten van het geneesmiddel beginnen te zien. De respons werd sterker en hield langer aan.

De preparatie van retina-coupes wordt veelvuldig gebruikt om synaptische stromen van verschillende cellen in de retina te registreren, en wanneer men een fluorescente kleurstof aan de elektrode-oplossing toevoegt, kan het celtype eenvoudig worden bevestigd. Anatomisch gezien gebruiken we hier de larvale TGA-salamander als diermodel. Het feit dat salamanders koudbloedige dieren zijn en grote retina-cellen hebben, biedt gunstige registratiecondities, maar dezelfde techniek kan worden toegepast op preparaties van zoogdieren.