Name: Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-02T15:50:00.000+00:00
Duration: 19 min 33 s
Description: Leer whole-cell voltage clamp opnames in retinaslices van de tijgersalamander voor visuele neurofysiologie. Deze methode onthult ionische stromen tijdens lichtstimulatie en helpt onderzoekers retinale functie begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Oplossingen <ul><li> Intracellulaire oplossing voor het ganglion cellen (in mm): 100 K-gluconaat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 1 EGTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 uM sulforhodamine B (voor de kleuring), aangepast aan pH = 7,4 met KOH </li><li> Intracellulaire oplossing voor bipolaire cellen (in mm): 90 K-gluconaat, 8 KCl, 1 MgCl 2, 10 BAPTA, 10 HEPES, 4 ATP, GTP 0.5, 90 uM sulforhodamine B (voor de kleuring), aangepast aan pH = 7,4 met KOH </li><li> Extracellulaire Ringer-oplossing (in mm): 112 NaCl, 5 Glucose, 5 HEPES, 2 KCl, 2 CaCl2, een MgCl 2, op pH = 7,75 met NaOH. Oxygenatie van de oplossing is niet nodig. </li></ul> Bereid de opname kamers Onze opnamestudio kamer bestaat uit een objectglaasje met een lijm goed waarbij zowel kleine siliconen blokken uit een andere lijm gesneden worden geplaatst om de stabiliteit van het weefsel plakjes te bieden. De voorbereiding van het netvlies plakken Om te voorkomen dat bleken van de fotoreceptoren, is de dissectie uitgevoerd in IR of zwak rood licht licht. Indien men geïnteresseerd is in het opnemen van reacties van de staaf weg, mag alleen infrarood licht gebruikt worden (IR dissectiemicroscoop en geen ruimte licht. Extra IR-bril moet worden gebruikt voor de procedures niet gedaan onder de microscoop). Als men vooral geïnteresseerd in het opnemen van kegel licht de reacties, afm rode kamer licht of een rood flitslicht kunnen worden gebruikt. De microscoop moet echter nog wel IR lenzen. Als fotoreceptor ingang is niet relevant voor het experiment, kunnen procedures worden uitgevoerd in een normale kamer licht met behulp van een gewone microscoop. <ol><li> Bereid twee microscoopglaasjes met een zelfklevende siliconen goed: maak twee parallelle banden van siliconenvet (ongeveer 0,5 cm uit elkaar) op elke dia en plaats een rechthoekig stuk filtreerpapier aan de ene kant van de glijbaan, kruising zowel vet banden (druk op de filter papier met een deel van een scheermes, zodat het goed is bevestigd aan de dia) </li><li> Offer een salamander volgens vastgestelde protocollen: het dier is geplaatst in een ijsbad gedurende 30 minuten, daarna onthoofd en dubbel-pithed. </li><li> Verwijder de ogen van salamander hoofd en plaats het onder de microscoop ontleden op een stukje tissue bevochtigd met de oplossing ijskoude Ringer&#39;s </li><li> Verwijderen bindweefsel van het oog </li><li> Gebruik scheermesje om een ​​klein sneetje te maken in het hoornvlies </li><li> Houd gesneden hoornvlies met een pincet, terwijl het verwijderen met een schaar langs de gehechtheid aan het oog </li><li> Haal de lens met een tang </li><li> Houd de iris met een tang en knip langs de ora serrata om de iris te verwijderen </li><li> Snijd de oogschelp in twee rechthoekige stukken </li><li> Pick-up een van de stukken en leg deze sclera kant naar boven op het filter papier (zorg ervoor dat afvlakken het stuk terwijl u naar beneden heel voorzichtig) </li><li> Til de sclera uit het netvlies, die nu moet worden gehecht aan de filer papier </li><li> Voeg snel ijskoude Ringer-oplossing voor het goed </li><li> Herhaal hetzelfde voor het tweede stuk </li><li> Gebruik een scheermesje geplaatst in een op maat gemaakte snijmachine 200-300μm breed plakjes snijden. </li><li> Gebruik een tang op te halen de plakken aan de zijkant van het filter papier, draai ze om, zodat de lagen van het netvlies zichtbaar worden, en leg ze op de stofzuiger vet bands </li><li> Kies een plakje dat ziet er onbeschadigd en toont horizontale banden met vermelding van de lagen van het netvlies (de lagen zijn soms moeilijk te zien onder de microscoop dissectie als de vergroting is niet hoog genoeg is, maar als men kan begrijpen dat sommige lagen van de slice meestal goed genoeg. De uiteindelijke beslissing over de vraag of de slice te gebruiken, echter, is gemaakt zodra het wordt bekeken onder de microscoop rechtop). Verplaats het naar de opname kamer dia door het bouwen van een Ringer brug tussen de twee dia&#39;s </li><li> Zorg ervoor dat het filter papier wordt gedrukt tegen de rubberen blokken in de opname kamer, zodat het schijfje is niet gekanteld (ganglion cellen en fotoreceptoren moeten in focus zijn op hetzelfde moment) </li></ol> Het plaatsen van het weefsel in de opname rig <ol><li> De opname dia wordt geplaatst onder de microscoop en geperfuseerd met Ringer-oplossing door middel van een zwaartekracht perfusie syste </li><li> Het preparaat is gevisualiseerd met een rechtopstaande microscoop met een 10x en 40x water immersie objectief. </li><li> Nogmaals, we alleen gebruik maken van infrarood licht om te voorkomen dat bleken van de fotoreceptoren. Een IR-camera is bevestigd aan de zijkant poort van de microscoop, die is aangesloten op een TV-scherm. </li></ol> Visuele stimulatie Visuele stimuli zijn geprogrammeerd in Matlab met behulp van de Psychtoolbox en worden geprojecteerd op het netvlies door de bovenkant poort van de microscoop met behulp van een microscopie afbeelding injector (MBF bioscience). A + + bits Digital Video Processor (Cambridge Research Systems) wordt gebruikt om een ​​14bit luminantie schaal te verkrijgen en te synchronize stimulus presentatie met data-acquisitie. De visuele stimuli die in deze video zijn heldere of donkere balken (width = 460μm) van 100% contrast, die gedurende twee seconden gepresenteerd op een stabiele uniforme achtergrond (luminantie = 8 * 10 4 fotonen / um / s, afmetingen: 1,84 x 1.38mm). Elektrofysiologie <ul><li> Patch elektroden zijn getrokken uit borosilicaat glas (OD:.. 1,5 mm, ID 84mm) met een micropipet trekker. Voor de ganglioncellen, weerstanden liggen tussen de 2 en 4 Mohm. Voor bipolaire cellen, zijn hoger weerstanden tussen de 4 en 8 Mohm gebruikt. </li><li> Voltage Clamp opnames worden uitgevoerd met behulp van een Multiclamp 700A (Molecular Devices), versterker en lab interne software geprogrammeerd in Labview. </li><li> Drugs zijn perfusie via een 8-kanaals perfusie-systeem. De microperfusion elektrode ligt dicht geplaatst om de slice (het weefsel moet zichtbaar beweegt wanneer u de perfusie-en uitschakelen, maar moet men oppassen dat de druk niet te sterk, zodat de plak los kunnen raken van het filter papier). Tijdens experimenten de microperfusion moet voortdurend ingeschakeld (perfuseren controle-oplossing als er geen drugs nodig zijn), zodat de opname niet gestoord door het inschakelen van de perfusie-en uitschakelen. </li></ul>

<ol><li>Cook, P. B., Lukasiewicz, P. D., McReynnolds, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28C%29+receptors+control+adaptive+changes+in+a+glycinergic+inhibitory+pathway+in+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">GABA(C) receptors control adaptive changes in a glycinergic inhibitory pathway in salamander retina.</a> Journal of Neuroscience. 20, 806-812 (2000).</li>
<li>Heflin, S. J., Cook, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Narrow+and+wide+field+amacrine+cells+fire+action+potentials+in+response+to+depolarization+and+light+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Narrow and wide field amacrine cells fire action potentials in response to depolarization and light stimulation.</a> Visual Neuroscience. 24, 197-206 (2007).</li>
<li>Ichinose, T., Shields, C. R., Lukasiewicz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+Channels+in+the+Transient+Retinal+Bipolar+Cells+Enhance+Visual+Responses+in+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.%22%5BJournal%5D)">Sodium Channels in the Transient Retinal Bipolar Cells Enhance Visual Responses in Ganglion Cells.</a> J Neurosci.. 25, 1856-1865 (2005).</li>
</ol>

Voordelen: <ol><li> Alle celtypen zijn toegankelijk </li><li> Eenvoudige identificatie van celtypen, met name wanneer een fluorescerende kleurstof wordt toegevoegd aan de elektrode oplossing </li><li> Farmacologische middelen gemakkelijk kunt bereiken doelcellen </li><li> De patch clamp techniek maakt het mogelijk om de rol van verschillende ionenkanalen te onderzoeken in het netvlies berekeningen. Dezelfde informatie kan niet worden verkregen via extracellulaire spike-opnamen of opnamen met scherpe elektroden. <...

<table><tbody><tr><td>Multiclamp 700A</td><td>Patch clamp-versterker</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SZX9</td><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX50WI</td><td>Rechte microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>Uitgerust met 40x, 10x waterimmersie-objectief, fluorescentiefilters en kwiklamp</td></tr><tr><td>P-97</td><td>Micropipet-trekker</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lucivid</td><td>Microscoop-beeldinjector</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-kanaals perfusiesysteem</td><td>Microperfusie</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bits++</td><td>Digitale videoprocessor</td><td>Cambridge Research Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infraroodoculairs</td><td>Overig</td><td>ITT Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hechtende siliconen wells</td><td>Overig</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td></td><td>20 mm diameter, 1,0 mm diep</td></tr><tr><td>Membraanfilters</td><td>Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>HAWPO1300</td><td>.45&amp;#x03BC;m HA</td></tr><tr><td>Borosilicaatglascapillaires</td><td>Elektrodegas</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilters</td><td>Filter</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>6789-0402</td><td>4 mm filters, .2 μm nylonmembraan, polypropyleen behuizing</td></tr><tr><td>IR-camera</td><td>Op de microscoop gemonteerde camera</td><td>Sony Corporation</td><td>SPT-M324</td><td>Extrawave HAD, B7W videocamera</td></tr><tr><td>Picrotoxine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Strychnine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0532</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole-4-azijnzuurnatrium</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7013</td><td></td></tr><tr><td>Larven van de tijgersalamander</td><td>Dier</td><td>Charles E. Sullivan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

whole-cell opnames van licht prikkelende synaptische stromingen opgeroepen in het netvlies slice

Whole-cell Recordings of Light Evoked Excitatory Synaptic Currents in the Retinal Slice

We gebruiken de whole-cell patch clamp techniek om de synaptische circuits die ten grondslag ligt visuele informatieverwerking in het netvlies te bestuderen. In deze video, zullen wij begeleiden u door het proces van het uitvoeren van whole-cell-opnamen van het licht opgeroepen stromingen van de individuele cellen in het netvlies slice voorbereiding. We gebruiken de in het water levende tijger salamander als een diermodel. We beginnen met een beschrijving van de dissectie van het oog en laten zien hoe schijfjes zijn gemonteerd voor elektrofysiologische opnames. Zodra het schijfje is geplaatst in de opname kamer, we laten zien hoe je whole-cell voltage clamp opnames uit te voeren. Vervolgens hebben we het project visuele prikkels op de fotoreceptoren in de slice aan het licht opgewekte stroom reacties uitlokken. Tijdens de opname hebben we perfuseren het segment met farmacologische stoffen, waarbij een 8-kanaals perfusie-systeem stelt ons in staat om snel te schakelen tussen verschillende agenten. Het netvlies slice voorbereiding wordt veel gebruikt voor patch clamp opnames in het netvlies, met name om amacrine of bipolaire cellen, die niet toegankelijk zijn in een geheel-mount voorbereiding van studie.

Deze video toont het proces van het whole-cell voltage clamp opnamen in de retinale deel van de in het water levende tijger salamander. Tonen we de voorbereiding van het stuk, alsook hoe de patch clamp opnames uit te voeren tijdens visuele stimulatie van het netvlies.

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

We maken gebruik van de whole-cell patch-clamptechniek om de synaptische circuits te bestuderen die ten grond liggen aan de verwerking van visuele informatie in het netvlies. In deze video ...

Vandaag laat ik u zien hoe u retina-coupes van de tijgersalamander kunt prepareren voor patchclamp-metingen. Eerst bereid ik twee soorten microscoopglaasjes voor. Wij gebruiken glaasjes met een vastgeplakt adhesieveld, zodat we deze als vloeistofkamers kunnen gebruiken.Op het eerste objectglas breng ik twee parallelle banen vacuümvet aan. Vervolgens neem ik filterpapier en snijd ik dit in rechthoekige stukjes met behulp van een lichtstraal. Nu plaats ik een van de stukjes op de vetbanen en druk ik dit aan, zodat het goed aan het objectglas vastzit.Ik doe hetzelfde voor het andere onderdeel. Het tweede type objectglas heeft kleine rubberen blokjes die erop zijn gelijmd. Voor nu breng ik alleen een beetje vacuümvet aan tussen de blokjes; daarna plaats ik een nieuw stukje scheermesje in de weefselsnijder.Ten slotte leg ik de instrumenten klaar die ik tijdens de dissectie nodig heb: twee pincetten, één schaar en een instrument om het oog uit de kop te verwijderen om lichtopgewekte stromen te registreren. De dissectie dient onder IR-licht te worden uitgevoerd, maar voor demonstratiedoeleinden zal ik nu in het licht werken. Eerst verwijder ik het oog en plaats ik het onder de microscoop

whole-cell-recordings-light-evoked-excitatory-synaptic-currents

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschrijven we een procedure voor het genereren van donker aangepaste plakjes van de muis netvlies voor elektrofysiologische opnames.

Patch Clamp Opnamen van Mouse Retinal Neuronen in een donker aangepaste Slice Voorbereiding

Hier beschrijven we een protocol voor de bereiding van agar-embedded netvlies plakken die geschikt zijn voor elektrofysiologie en Ca2 + beeldvorming. Deze methode laat toe om te studeren lint-type synapsen in het netvlies microcircuits met behulp van directe patch-clamp opnames van enkele presynaptische zenuwuiteinden.

Patch-clamp capaciteitsmetingen en Ca 2 + Imaging bij Single zenuwuiteinden in het netvlies Slices

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

The video describes the electrophysiological recording of retinogeniculate and corticogeniculate synapses in mouse brain slices. The slices containing the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) are placed in a recording chamber. A stimulating pipette is positioned on either the optic tract to stimulate retinal ganglion cells (RGCs) and investigate retinogeniculate synapses or the nucleus reticularis thalami to stimulate cortical neurons and investigate corticogeniculate synapses. Upon...

An Electrophysiological Study of Retinogeniculate and Corticogeniculate Synapses in Mouse Brain Slices

This video demonstrates the recording of light-evoked post-synaptic responses in a dark-adapted mouse retinal tissue slice preparation. The retinal slice is placed in a recording chamber, and a recording pipette is used to establish electrical continuity with a retinal ganglion cell. Light pulses are applied to generate excitatory post-synaptic potentials in the ganglion cells, which are recorded by the pipette.

Light-Evoked Postsynaptic Responses in Neurons of Mouse Retinal Slices

This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

We beschrijven de bereiding van dunne netvlies plakken uit het water levende tijger salamanders...

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

We zullen demonstreren hoe retinale plakjes van het muizenoog worden bereid en lichtreacties in retinale neuronen worden opgenomen. De hele procedure wordt uitgevoerd in donker-aangepaste omstandigheden.

Opname Light-evoked Postsynaptische Reacties in Neuronen in Dark-aangepaste, Mouse retinale Slice Voorbereidingen Gebruik Patch Clamp technieken

We ontwikkelden een horizontale slice voorbereiding van de zoogdierretina volwassene met het vlak van snijden parallel aan het netvliesoppervlak. Dendritische gebied van nonradially georiënteerde retinale neuronen werden niet afgekapt, waardoor de studie van de signaalverwerking met patch-klem en beeldvormende technieken.

Voorbereiding van de Horizontale Schijfjes van Adult Mouse Retina voor elektrofysiologisch onderzoek

Hier presenteren we protocollen voor de bereiding van acute hersen schijfjes met de laterale geniculate Nucleus en het elektrofysiologisch onderzoek van retinogeniculate en corticogeniculate synapsen functie. Dit protocol biedt een efficiënte manier om te bestuderen van de synapsen met de hoge-release en lage-release kans in dezelfde acute hersenen segmenten.

Elektrofysiologische onderzoeken van Retinogeniculate en Corticogeniculate Synapse functie

Dit werk presenteert een alternatief flatmount retina-preparaat waarbij de verwijdering van fotoreceptorcellichamen een snellere verspreiding van antilichamen en verbeterde patchpipettoegang tot binnenste retinale neuronen mogelijk maakt voor immunohistochemie, in situ hybridisatie en elektrofysiologische experimenten.

Split Retina als een verbeterde flatmount-voorbereiding voor het bestuderen van neuronen in de binnenste nucleaire laag in het netvlies van gewervelde dieren

Leer whole-cell voltage clamp opnames in retinaslices van de tijgersalamander voor visuele neurofysiologie. Deze methode onthult ionische stromen tijdens lichtstimulatie en helpt onderzoekers retinale functie begrijpen.

Whole-cell Opnames van Licht prikkelende synaptische Stromingen opgeroepen in het netvlies Slice

Meer video's verkennen