Chromatine immunoprecipitatie van menselijke embryonale stamcellen

Hallo, ik ben Stefan Burani van het laboratorium van Dr. Frank Zawa van de afdeling Biochemie aan de University of California Riverside. Vandaag laten we u een procedure zien voor chromatine-immunoprecipitatie. Laten we beginnen.

Deze procedure begint met formaldehyde-crosslinking van menselijke embryonale stamcellen. Voorafgaand aan de crosslinking worden de menselijke embryonale stamcellen gedurende vijf minuten bij 37 °C ontdooid uit vloeibare stikstof en vervolgens gewassen met medium. De cellen worden daarna uitgeplaat op met gelatine gecoate zeswells-platen en krijgen twee tot drie dagen de tijd om uit te groeien.

Voor elke immunoprecipitatiereactie moeten we starten met 50 tot 100 miljoen cellen. De cellen worden eerst geprepareerd en verzameld in suspensie. Vers formaldehyde wordt aan elke celsuspensie toegevoegd in een concentratie van 1% en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd.

Voeg vervolgens één tiende volume 1,25 M glycine toe om het formaldehyde te neutraliseren en incubeer gedurende 10 minuten. Spoel de cellen twee keer met 10 milliliter PBS en breng ze daarna over in 50 milliliter conische buisjes. Centrifugeer de buisjes bij 1000 RPM gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius om de cellen als pellet te verzamelen.

Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 1,5 milliliters lysebuffer. Breng de cellen vervolgens over naar een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Nadat de cellen zijn overgebracht, worden ze drie keer snel ingevroren (flash freeze) in vloeibare stikstof en daarna met een weefselmaler kapotgemaakt.

Zodra de cellen zijn gecrosslinkt, zijn ze klaar voor immunoprecipitatie of ze kunnen onbeperkt bevroren worden bewaard bij minus 80 °C. Nadat u de cellen heeft gecrosslinkt, moet u de magnetische beads hiervoor voorbereiden. Voeg 50 µL DI-beads toe aan 1,5 mL microcentrifugebuisjes met lage retentie en bereid één buisje beads voor per immunoprecipitatie.

Voeg vervolgens één milliliter blokkeringsoplossing toe. Verzamel nu de dyal-beads met behulp van dyal MPC. Plaats de buisjes in het magnetische rek.

Laat de kraaltjes zich aan de zijkant van de buis verzamelen. Dit zou ongeveer 15 seconden duren. U kunt het rek twee keer omkeren om het verzamelen van de kraaltjes te vergemakkelijken.

Zodra de beads zijn opgevangen, kunt u het supernatant met een pipette verwijderen. Voeg na het verwijderen van het supernatant één milliliter blokkeringsoplossing toe en resuspendeer de beads voorzichtig door de magnetische strip uit het rek te halen en het rek om te keren. Terwijl de buis op zijn plaats blijft, kunt u dit 10 tot 20 keer herhalen of totdat de beads gelijkmatig zijn verdeeld.

Resuspendeer en verzamel de beads zoals u dit eerder heeft gedaan. Zodra ze zijn verzameld, kunt u het supernatant met een pipet verwijderen. Herhaal deze wasstap met 1,5 milliliters blokkeringsoplossing.

Na de tweede wasbeurt kunt u de beads resuspenderen in 750 µL blokkeringsoplossing en vervolgens 10 µg antilichaam toevoegen. In ons onderzoek gebruiken we een antilichaam tegen het eiwit MLL; incubeer het mengsel bij 4 °C gedurende minimaal zes uur of overnacht op een rotator. Tijdens deze incubatie kunt u het crosslinked chromatine sonificeren, wat we kort na de overnachtelijke incubatie zullen demonstreren.

Verwijder de antilichaamoplossing en was de beads vervolgens drie keer. Gebruik hiervoor één milliliter lyasebuffer, zoals u eerder deed, en gebruik het magnetische rek om de beads te verzamelen. Na het wassen kunt u het verzadigde chromatine toevoegen.

Voordat u begint met het soniceren, moet u eerst de bevroren celpellets uit de vriezer van -80 °C halen en laten ontdooien. Bereid een conische buis van 15 milliliter voor op sonificatie. Dit wordt gedaan door de buis bij de markering van 5 milliliter in twee stukken te snijden en de bovenste helft weg te gooien.

De buisjes kunnen worden afgedekt met parafilm of de dop van het buisje. Positioneer tijdens het opstellen het buisje in een buisjesrek zodanig dat de ator-probe zich ongeveer 0,5 tot één centimeter boven de bodem van het buisje bevindt.

Zorg ervoor dat de probe gecentreerd is en de wand van de buis niet raakt om schuimvorming van de oplossing te voorkomen. Soniceren vervolgens de suspensie gedurende zes rondes van 20 seconden. Elk monster moet tussen de sonicatierondes in een ijswaterbad worden bewaard om schuimvorming te verminderen.

Stel het uitgangsvermogen aanvankelijk in op nul en verhoog dit vervolgens handmatig naar het definitieve vermogen tijdens de eerste burst. Na enige tijd wordt het materiaal overgebracht naar een buisje van 1,5 milliliter en vervolgens 10 minuten gecentrifugeerd bij 13.000 RPM op vier graden Celsius. Dit dient om het residu te pelletiseren en de supernatant te oogsten.

Overbreng de SINA naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Bewaar 50 µL van het cellysaat van elk monster als input-DNA. Dit zal later worden gebruikt om de grootte van het gedeelde chromatine te controleren.

Dit kan worden bewaard bij -20 °C. Er moet ten minste één aliquot input-DNA worden bewaard per batch gesoniceerd lysaat. We zijn nu klaar om het chromatine te immunoprecipiteren.

Voeg eerst het chromatine-equivalent van 50 tot 100 miljoen cellen uit de in de vorige stap verzamelde pellet toe aan 50 µL antibody magnetic bead mix die eerder is bereid, tot een eindvolume van 1 mL. Indien nodig kan dit volume worden aangepast met lysebuffer; keer het buisje om om te resuspenderen. Incubeer dit mengsel met de beads overnacht op een rotator bij 4 °C.

Verzamel na incubatie de beads met behulp van een magneetstatief. Plaats de buisjes in het rek, zodat de beads zich tegen de wand van het buisje verzamelen. Dit zal ongeveer 20 seconden duren. Beweeg het rek twee keer om te helpen alle beads te verzamelen.

Verwijder vervolgens het supernatant met een pipetteur en vervang de tips tussen de monsters. Daarna moeten de beads gewassen worden. Voeg hiervoor één milliliter lyasebuffer toe aan elke buis en resuspendeer de beads voorzichtig.

Dit kan worden gedaan door de magneetstrip uit het rek te verwijderen en het rek, met de buisjes er nog in, ongeveer 10 tot 20 keer om te keren of totdat de beads gelijkmatig zijn geresuspendeerd. Verzamel daarna de beads door de magneetstrip terug te plaatsen. Verwijder het supernatant met een pipet.

Herhaal deze wasstap nog drie tot vijf keer. Vergeet niet om de tips tussen de wasbeurten te vervangen. Was de beads vervolgens vier tot zes keer in één milliliter IP one buffer zoals zojuist beschreven.

Was daarna op dezelfde wijze de beads vier tot zes keer in één milliliter IP twee buffer. Was de beads tot slot vier tot zes keer in één milliliter TE-buffer pH 8,0, zoals bij de overige wasstappen is gedaan. Verwijder de TE-buffer na de laatste wasbeurt.

Centrifugeer nu 3 minuten bij 3000 RPM bij vier graden Celsius om eventuele resterende TE-buffer te verwijderen. De beads zijn nu klaar voor elutie om het chromatine te verwijderen. Voeg eerst 210 µL elutiebuffer toe en elueer het materiaal van de beads door de buizen 15 minuten, of tot 30 minuten om het herstel van het eluaat te verbeteren, te incuberen in een thermische mixer bij 65 graden Celsius op 800 RPM.

Centrifugeer de kraaltjes gedurende één minuut bij 13.000 RPM. Verwijder na centrifugatie 200 µL van het supernatant en breng dit over naar een nieuwe buis, voeg vervolgens 200 µL TE-buffer toe. De monsters zijn nu klaar voor de CRO-stap om het geprecipiteerde DNA te decrosslinken.

Incubeer het supernatant in een waterbad van 65 °C gedurende minimaal zes uur en maximaal 15 uur. Deze incubatie kan in een waterbad worden uitgevoerd om condensatie te minimaliseren. Voeg vervolgens 50 µL input-DNA toe.

Dit werd na sonificatie teruggekoppeld door de lengte van dit input-DNA aan te passen via incubatie bij 65 °C, zoals ook bij het eluaat is gedaan. Nu zijn we klaar om het DNA te zuiveren. Het DNA wordt vervolgens gezuiverd en geprecipiteerd met behulp van fenol-chloroformextractie, gevolgd door ethanolprecipitatietechnieken.

De neergeslagen DNA-pellets worden geresuspendeerd in water en kunnen vervolgens bij minus 20 graden Celsius worden bewaard. Voor toekomstig gebruik kan het gezuiverde input-DNA op een agarosegel worden geladen om de grootte van het gescheren chromatine te controleren. Idealiter moet het chromosoom tussen de 250 en 750 basen groot zijn.

We hebben u zoju biodegradation hoe u een chromatine-immunoprecipitatie uitvoert bij menselijke embryonale stamcellen. Bij het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om een antilichaam met een hoge affiniteit te gebruiken, chromatine met het juiste groottebereik en wasstappen met een hoge stringentie. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.