Name: Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen door toepassing van fluor-Gold op het oppervlak van Superior colliculus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-17T17:19:00.000+00:00
Duration: 14 min 5 s
Description: Leer retrograde labeling van retinale ganglioncellen met fluoro-gold op het colliculus superior. Deze methode maakt visualisatie van neuronale paden en evaluatie van celoverleving mogelijk voor neuroprotectieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag bedanken voor de steun van National Glaucoom Program van de Amerikaanse Health Assistant Foundation.

<ol><li> Verdoof de rat door intraperitoneale injectie van ketamine (80mg/kg) en xylazine (8mg/kg) (volume ratio 2:1). Breng een steriel glijmiddel oog zalf om uitdroging te voorkomen van het hoornvlies tijdens de operatie. </li><li> Scheer het hoofd bont (van oog tot het oor-niveau) en bevestig de kop op de kop stadium door een hoofd klem en zijn snijtanden in de snijtand bar. </li><li> Gedesinfecteerd de operatie gebied met 10% povidonjood-oplossing, gevolgd door 70% alcohol. </li><li> Snijd de huid en de spieren om de schedel en de hechtingen (sagittale, coronale en dwarse naden) (Figuur 1) bloot te leggen. Van toepassing zijn pijnstillende, bupivicaine als een splash om incisiegebied (niet tot 2 mg / kg bedraagt). </li><li> Boor een gat schedel (ø 2x2 mm, 0,5 mm van zowel de sagittale en transversale hechtingen) aan elke kant van pijlnaad. Vermijd breuk van hersenvliezen en de sinus ligt onder de hechtingen. <img src="/files/ftp_upload/old/819_2008_6_18_3/ratSkull.png" alt="Kenmerken van levend rat schedel." width="469" height="317" /> Figuur 1. Kenmerken van levend rat schedel. </li><li> Opengesneden de hersenvliezen in het voorjaar een schaar, niet scheurt. </li><li> Zuig het cerebrale inhoud die ligt over het dorsale oppervlak van de superieure colliculus zorgvuldig door de vacuümpomp en drie check-points kan worden waargenomen: <ol><li> de kleur van hersenweefsel verandert van grijs naar wit naar grijs </li><li> stop opzuigen als de kleurloze hersenvocht naar buiten komen </li><li> zorgvuldig vergroten van de laagste zuigkracht horizontaal naar de geelachtige superieure colliculus gedekt door de dura bloot </li></ol></li><li> Aspireren de hersenen inhoud via SC tot vier randen van SC kan worden waargenomen direct onder de microscoop. Het deel van de verwijderde hersenschors moet worden beperkt tot minimum aan ongewenste neveneffecten (bijv., motorische stoornissen) te vermijden. Wees voorzichtig dat u de sinus te raken. </li><li> Absorberen de vloeistof in het gat met fijne steriele katoenen streep om het oppervlak van de SC zo droog mogelijk. Plaats dan een dun laagje gelatine spons pre-doorweekt met 6% Fluoro-Gold aan het oppervlak van SC (FG wordt ingenomen door het axon terminals van retinale ganglioncellen en bilateraal retrogradely getransporteerd naar de SOMA in het netvlies). </li><li> Vul het gat met gelfoam en sluit de huid wond met hechtdraad clips. </li><li> De dieren werden toegelaten om te herstellen onder gloeilamp warm te houden. Pijnstillende, buprenorfine (100mcg/kg), wordt oraal toegepast in het drinkwater gedurende 5 dagen na SC etikettering. </li></ol>

<ol><li>Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+double+labeling+of+retinal+ganglion+cells+in+the+newborn+and+adult+albino+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat.</a> Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).</li>
<li>Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+Lycium+barbarum+Lynn+on+protecting+retinal+ganglion+cells+in+an+ocular+hypertension+model+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma.</a> Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).</li>
<li>Forrester, J., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+fibers+in+the+optic+nerve+of+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nerve fibers in the optic nerve of rat.</a> Nature. 214, 245-247 (1967).</li>
<li>Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNTF+promotes+survival+of+retinal+ganglion+cells+after+induction+of+ocular+hypertension+in+rats%3A+the+possible+involvement+of+STAT3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway.</a> European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).</li>
<li>Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanopsin-Expressing+Retinal+Ganglion+Cells+Are+More+Injury-Resistant+in+a+Chronic+Ocular+Hypertension+Model.+Investigative%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative.</a> Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).</li>
</ol>

<ol><li> Waarom gebruik maken van deze chirurgische methode om retinale ganglion cellen? In de rat ongeveer 98% van retinale ganglioncellen (RGC) is bekend dat het project aan de contralaterale superieure colliculus (SC). Toepassing van fluor-goud op het oppervlak van SC kan bijna alle label van het RGC, zodat we kunnen op deze meest kwetsbare netvlies neuron focus in glaucoom. Vergelijk met retrograde etikettering van RGC Door FG op stronk van doorsneden oogzenuw voor 2 dagen, is de interferentie van RGC overleven geminimaliseerd....

retrograde labeling van retinale ganglioncellen door toepassing van fluor-gold op het oppervlak van superior colliculus

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus

Retinale ganglion cel (RGC) tellen is essentieel om retinadegeneratie evalueren vooral in glaucoom. Betrouwbare RGC etikettering is fundamenteel voor het evalueren van de effecten van een eventuele behandeling. In de rat, is ongeveer 98% van RGC waarvan bekend is dat het project aan de contralaterale superieure colliculus (SC) (Forrester en Peters, 1967). Het toepassen van fluoro-goud (FG) op het oppervlak van SC kan label bijna alle RGC, zodat we kunnen op deze meest kwetsbare netvlies neuron focus in glaucoom. FG wordt ingenomen door het axon terminals van retinale ganglioncellen en bilateraal retrogradely getransporteerd naar de SOMA in het netvlies. Vergelijk met retrograde etikettering van RGC Door FG op stronk van doorsneden oogzenuw voor 2 dagen, is de interferentie van RGC overleven geminimaliseerd. Vergelijk met cresyl violet vlekken die vlekken RGC, amacrine cellen en endotheel van het bloedvat in de retinale ganglion cel laag, deze labeling methode is meer specifiek voor de RGC. Deze video beschrijft de methode van retrograde etikettering van RGC door het toepassen van FG op het oppervlak van SC. De chirurgische procedures omvatten het boren van de schedel, aspiratie van de cortex naar de SC bloot te leggen en het toepassen van gelatine spons over de gehele dorsale oppervlak van SC worden getoond. Nuttige tips voor het vermijden van grote intracraniële bloeden en aspiratie van de SC zijn gegeven.

Deze video beschrijft de methode van retrograde etikettering van RGC door het toepassen van fluoro-goud (FG) op het oppervlak van superieure colliculus (SC). Techniek omvat het boren van de schedel, opzuigen van de cortex, en het toepassen van gelatine spons over de gehele dorsale oppervlak van de SC.

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen door toepassing van fluor-Gold op het oppervlak van Superior colliculus

Het tellen van retina-ganglioncellen (RGC's) is essentieel voor het evalueren van retina-degeneratie, in het bijzonder bij glaucoom. Betrouwbare RGC-labeling is fundamenteel voor ...

Hoi, ik ben Tu van het GOSO Lab aan de Universiteit van Hong Kong. Vandaag ga ik uitleggen hoe je ratenretinale ganglioncellen met een retrograde grid labelt.Retinale ganglioncellen worden retrogradewijs gelabeld door een fluorescerende kleurstof aan te brengen op het oppervlak van het superieure colliculus, zodat we later de retinale ganglioncellen op de vlakgeprepareerde retina kunnen tellen om celdood of het effect van het toegediende geneesmiddel te evalueren. Dit is een foto die het traject van de retina naar het superieure colliculus illustreert. Fluorescerende kleurstoffen kunnen retrogradewijs worden getransporteerd van het superieure colliculus via het tractus opticus.Voer de optische chama via de nervus opticus door naar het netvlies in het oog. We gebruiken een operatiemicroscoop voor de chirurgische ingreep. Gebruik een pomp voor het aspireren van de cerebrale cortex over het dorsale oppervlak van de CLE-headstage om de rode kap op positie te houden.Ke en sine voor het boren in de rat om de school te openen en een absorbeerbare jaloezie pon voor het aanbrengen van fluorescerende kleurstof FG op het oppervlak van de clickless. De instrumenten werden voor de operatie geautoclaveerd, waaronder fijne pincetten, veer-scharen, vacuümnaalden, boorkoppen en hechtclips. Het chirurgische mesje voor het opensnijden van de huid, een liniaal voor de meting en watten bevonden zich tevens in gesteriliseerde toestand.We analyseerden de rat door tonale injectie van ketamine en sinegel. Na het scheren van de huid van ooghoogte tot oorhoogte desinfecteerden we het operatiegebied met povidonjodium, gevolgd door 70% alcohol. Vervolgens werd de rattenhouder op de hoofdstage geplaatst.Snijd de huid open in de middenlijn van de kop, beginnend vanaf het niveau van het oog tot het niveau van de oren. Hierdoor ontstaat een goede blootstelling van de chrono-naad, de sagittale naad, de transversale naad; dit is de BMA en dit is de Lambda. Markeer de schroef op 0,5 tot 1 millimeter vanaf het AL-uiteinde van de transversale naad en label deze vervolgens aan beide zijden opnieuw om er zeker van te zijn dat de markering ten minste 0,5 millimeter van de naden verwijderd is.Vervolgens kunnen we beginnen met het boren van een gat langs de markerzijde, waarbij de snelheid en richting van de boor worden gecontroleerd om een brede opening in de meninges en de sinusbekleding onder de naad te creëren. Stop met boren wanneer de diameter ongeveer twee millimeter bedraagt. Controleer vervolgens opnieuw de andere zijspiegel om er zeker van te zijn dat het gat de juiste maat heeft en op de juiste plaats is.Knip de hersenvliezen open met de veerschaar. Gebruik een fijne pincet om het botresidu in het gat te verwijderen. Nu kunnen we beginnen met de aspiratie met behulp van de vacuumpomp. De eerste laag van de BR is de groene stof, die opnieuw samen met de hersenvliezen wordt doorgesneden.Vervolgens is te zien dat de kleur van de tcel verandert naar wit. Dit is het witte stof van het sero. Voer de aspiratie voorzichtig en langzaam uit.Nu kunnen we de grijze stof weer zien. De kleur wordt minder wit. Je kunt zien dat het aan de onderkant grijs is.Ik begrijp het. Zoals u ziet, komt het heldere CSF naar buiten. Dat betekent dat we het dorsale oppervlak van de superieure corus bereiken.Er is opnieuw sprake van een vergroot gat op dit niveau. Onderaan kunnen we zien dat de geelachtige dura de superior clus bedekt. Voer de horizontale aspiratie op dit niveau uit om te voorkomen dat de inhoud van de superior clus wordt vernietigd.Vervolgens kunnen we het geheel starten. Je ziet de groene materie. Het heeft daadwerkelijk een groene kleur.Vervolgens komen we bij de witte stof. De kleur van het weefsel is wit. Nu is goed te zien dat het CSF zich netjes onder die grijze kleur bevindt.Verwijder die laatste laag grijze stof, waarna de gele dura bloot komt te liggen. Wees nu voorzichtig bij het openen van de dura boven de afzonderlijke clickers en vergroot vervolgens het gat. Probeer ervoor te zorgen dat de volledige rand van de clickers onder de microscoop kan worden waargenomen.Bevestig de klem van het hoofdplatform onder verschillende hoeken en voer een laatste aspiratie uit totdat de vier randen van de CLE direct onder de microscoop kunnen worden waargenomen. Absorbeer de vloeistof in het gat met een fijn katoenen stripje om het oppervlak van de CLE zo stevig mogelijk te maken. Neem een stukje gelatine, dat vooraf is verzadigd met 6% fuel gold, en verdeel dit in kleine stukjes.Breng het aan als een dunne laag met een afmeting die iets groter is dan het gehele dorsale oppervlak van het superieure deel. Plaats het voorzichtig op het oppervlak van de superieure clickers en vervolgens op de tegenovergestelde zijde. Plaats het in het gat, waarbij het gehele oppervlak van de clus wordt bedekt, door de gaten met een sterkere spuitstroom.Sluit tenslotte de huidwond met hechtklemmen en reinig de wond na de operatie, plaats de rat terug in een schone kooi en laat deze herstellen onder warme omstandigheden. De rat vertoont een normaal gedrag na de operatie zodra deze wakker is.Zeven dagen na de SC-labeling dissekeren we het netvlies en monteren we dit plat, waarna we de retinale ganglioncellen tellen met een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een UV-filter. Aangezien 98% van de retinale ganglioncellen naar de superieure colliculi projecteert, is een betrouwbare ST-labeling essentieel voor de evaluatie van de ziekteprogressie en het effect van geneesmiddelen. Dit is een voorbeeld van retro-gelabelde retinale ganglioncellen op een plat gemonteerd netvlies.

retrograde-labeling-retinal-ganglion-cells-application-fluoro-gold-on

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Negentig procent van de retinale ganglioncellen (RGC), waarvan de axonen volledig doorsneden (axotomy) sterven binnen 14 dagen na axotomy. Dit model is lastig om experimentele manipulaties en zeer reproduceerbaar.

Optic Nerve transsectie: Een model van de volwassen Neuron Apoptosis in het centrale zenuwstelsel

Optic Nerve doorsnijding is een veel gebruikt model van de volwassen CNS verwonding. Dit model is ideaal voor het uitvoeren van een aantal experimentele manipulaties die het netvlies doel wereldwijd of direct de doelstelling van de gewonden neuronale populatie van retinale ganglioncellen.

Methoden voor experimentele manipulaties na Optic Nerve doorsnijding in het zoogdier CZS

Dit artikel geeft een beschrijving van hoe te ontleden en op te nemen van de geïsoleerde netvlies voorbereiding in de muis. In het bijzonder beschrijven we hoe de reacties aan het licht opnemen van een fluorescent gelabelde ganglion cel populatie en vervolgens te identificeren en analyseren van de morfologie.

Een geïsoleerde Retinale Voorbereiding op Light Response Opnemen van genetisch Labeled retinale ganglioncellen

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

Retrograde transport van fluorescente kleurstof labelt een sub-populatie van neuronen op basis van anatomische projectie. Gelabelde axons kunnen visueel worden...

Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen<em&gt; In vivo</em

Source: Inal, M. A. et. al., Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the method of retrograde labeling of Drosophila motor neurons using lipophilic dyes. The dye enters the axon, travels retrogradely, and labels the neurons green, allowing detailed visualization of their morphology and projections under a confocal microscope.

Retrograde Labeling of Drosophila Motor Neurons Using Fluorescent Lipophilic Dyes

Source: Laboissonniere, et. al. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates a fluorescent tracing technique to identify retinal ganglion cell (RGC) subtypes in a transgenic mouse retina. The process involves securing the isolated retina in a recording chamber, maintaining cell viability with oxygenated perfusion, and targeting fluorescently labeled RGCs using a pipette with a tracer. By analyzing dendritic morphology and...

Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing

We introduceren een efficiënte methode om retinale ganglioncellen (RGC's) bij volwassen zebravissen retrograad te labelen.

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen in Adult zebravis met fluorescente kleurstoffen

De postembedding immunogold-methode is een van de meest effectieve manieren om hoogwaardige analyses van de subcellulaire lokalisatie van specifieke moleculen te leveren. Hier beschrijven we een protocol om glutamaatreceptoren bij retinale lintsynapsen kwantitatief te analyseren.

High-Resolution Kwantitatieve immunogoud Analyse van membraanreceptoren op het netvlies Ribbon Synapses

Miljoenen mensen lijden aan retinale degeneratieve ziekten die leiden tot onomkeerbare blindheid. Een gemeenschappelijk element van veel van deze ziekten is het verlies van retinale ganglioncellen (RGC's). Dit gedetailleerde protocol beschrijft de isolatie van primaire murine RGC's door positieve en negatieve selectie met flowcytometrie.

Isolatie van Primaire Murine Retinale Ganglioncellen (RGC&#39;s) door Flow Cytometry

Secundaire degeneratie van het netvlies peesknoopcellen (RGCs) komt vaak voor bij glaucoom. Deze studie beschrijft een innovatieve operationele aanpak voor gedeeltelijke oogzenuw transect. Het gebruik van deze ruimtebesparende operationele aanpak strekt zich uit de modellenreeks van de toepassing en kunt verkenning van secundaire schade mechanismen in RGCs op een nieuwe manier.

Gedeeltelijke oogzenuw transect bij ratten: een Model tot stand gebracht met een nieuwe operationele aanpak om te beoordelen van secundaire degeneratie van het netvlies peesknoopcellen

Leer retrograde labeling van retinale ganglioncellen met fluoro-gold op het colliculus superior. Deze methode maakt visualisatie van neuronale paden en evaluatie van celoverleving mogelijk voor neuroprotectieonderzoek.

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen door toepassing van fluor-Gold op het oppervlak van Superior colliculus

Meer video's verkennen