Primaire los middenhersenen Dopamine celculturen van knaagdieren pasgeborenen

Hoi, ik ben Lauren Frank van het laboratorium van Emmanuel Pothos van de afdeling Farmacologie en Experimentele Therapeutica aan de School of Medicine van Tufts University. En ik ben Emmanuel Pothos. Vandaag laten we u een procedure zien voor het genereren van primaire dopamine-celculturen uit de middenhersenen van pasgeboren knaagdieren.

Deze procedure omvat de volgende stappen: het voorbereiden van instrumenten en reagentia, het dissekeren van de middenhersenen van rodenten in het stadium P0 tot P2, het tritureren van de hersensegmenten en het uitplaten van de gedissocieerde neuronen. Laten we beginnen.

Voor deze procedure moeten een aantal voorbereidingsstappen twee tot drie weken vóór het genereren van de dopamine-neuronencultuur worden uitgevoerd; de gliacellen moeten worden uitgeplaat zodat ze de tijd hebben om te prolifereren en de bodem van de schalen te bedekken. De primaire dopamine-neuronen worden één tot zeven dagen vóór het kweken van de primaire neuronale cellen op een monolaag van gliacellen gekweekt. Verwijder de dag vóór de AC-cultivering het medium van de gliacellen en vervang dit door 2 mL vers neuronaal medium; alle items, behalve de dissectie-instrumenten, moeten worden gesteriliseerd met UV-licht, inclusief 12 dissectieschalen.

Twee dissociatiebuisjes met een micro-magnetische roerstaaf. Twee buisdopjes met twee kleine gaatjes in de bovenkant. Uitgespreide glijringen.

En vergeet niet de doos met objectglasringjes open te laten staan. Al deze instrumenten worden gecoat met 70% ethanol voordat men op de dag van de cultivatie begint. Haal eerst alle bestanddelen voor de pepaine-oplossing, die gebruikt zal worden om de primaire neuronoplossing te dissociëren, uit de vriezer en laat deze ontdooien.

Stel een warmteplaat in om een bekerglas water te verwarmen tot 34 °C voor de digestie en bereid met carbogeen verzadigd water voor de oxygenatie van de pepane-oplossing. Tijdens de digestie worden 15 steriele buisjes gevuld met vier tot zes milliliters steriele PBS voorbereid en op ijs geplaatst voor het wassen van de hersenen voorafgaand aan de dissectie. Er worden 20 tot 30 milliliters vers neuronaal medium afgemeten en in de incubator geplaatst.

Vervolgens wordt het dissociatiebuisje voorbereid door de pepaine-oplossing te filteren met een steriele flip-filtratie-unit, waarna deze met een 25 milliliter spuit naar het dissociatiebuisje wordt overgebracht. Sluit het buisje af met een dop, steek er een steriele spuit in door een gat in de dop te maken, welke is verbonden met een 0,2 micron filter. Sluit de carbogen aan op het filter en zet dit vast met parafilm. Plaats het buisje in de styrofoam schijf.

Zodra het dissociatiebuisje is geplaatst, dient u te controleren of de magnetische roerkolf beweegt. Het gas stroomt het buisje in en de temperatuur is gestabiliseerd op 34 °C. De dissectiemicroscoop wordt in de zuurkast geplaatst en de dissectie-instrumenten worden op aluminiumfolie klaargelegd.

Leg vervolgens één groot vierkant aluminiumfolie en 12 kleinere vierkanten klaar. Leg een schaar bij de aluminiumfolie voor de decapitaties. Plaats een piepschuimdoos met ijswater buiten de zuurkast.

Bereid vervolgens het anestheticum voor, dat bestaat uit een mengsel van 0,075 milliliter ketamine en 0,075 milliliter xylazine. Verzamel daarna ten minste 12 P0 tot P2 pups voor 135 millimeter platen met een glazen well van 23 millimeter. Zorg er bij muizen voor dat het genotype voor het gehele nest overeenstemt.

Als het genotype onbekend is, moeten de cellen van elk dier op aparte schalen worden geplaatst en moeten nauwkeurige verslagen worden bijgehouden om de cellen te kunnen koppelen aan de daaropvolgende genotyperingsresultaten. Om te beginnen met de dissectie, wordt het eerste dier geanestheseerd met een intraperitonele injectie van ketamine Xylazine. Wanneer het dier niet reageert op een tail flick-test, wordt het gedurende 30 seconden in ijswater geplaatst tot het hypotheem is.

Spoel vervolgens een klein vierkantje aluminiumfolie, de decapitatieschaar en de kop van het dier af met 70% ethanol om contaminatie van het hersenweefsel tijdens de dissectie te voorkomen. Decapiteer met de schaar, laat de kop op het aluminiumfolie vallen en verplaats deze naar de zuigkast. Verwijder de hersenen voorzichtig door eerst de huid met de kleine schaar door te snijden om de schedel bloot te leggen. Snijd 360 graden rondom de schedel.

Verwijder vervolgens de schedelkap met een pincet. Til de hersenen met een kleine spatel uit de schedel en plaats deze in een buisje van 15 milliliter met ijskoud PBS. Plaats het buisje terug op het ijs voordat de volgende S hersenen worden verwijderd.

Herhaal de dissecties totdat er drie hersenen in afzonderlijke buisjes op ijs aanwezig zijn. Giet één brein en PBS in de eerste dissectieschaal. Plaats de hersenen onder de microscoop op een platform van sill guard-lijm als kussen, zodat het mes scherp blijft.

Gebruik een transferpipet om de segmenten in een nieuw buisje met PBS te plaatsen om de segmenten te wassen voordat ze worden overgebracht naar de pepaine-oplossing. Start een timer zodra de eerste segmenten worden toegevoegd en ga door met de dissecties totdat alle hersenen worden verteerd in de papaine.

De eerste hersensegmenten zullen ongeveer een uur hebben geïncubeerd voor digestie. Laat de digestie nog een uur doorgaan nadat de laatste segmenten zijn toegevoegd. Zorg ervoor dat de temperatuur in het pepane bad is gestabiliseerd op 34 °C.

Om te beginnen met de tation-stap, gebruik een transferpipet om de hersensegmenten in een steriele buis van 15 milliliter te plaatsen. Probeer te voorkomen dat er te veel pepane-oplossing wordt overgebracht. Mocht dit toch gebeuren, verwijder dan het overschot aan pepane.

Was vervolgens de segmenten door twee milliliter verwarmd neuronaal medium uit de incubator toe te voegen. Laat de segmenten bezinken en verwijder daarna voorzichtig zoveel mogelijk van de oplossing zonder de segmenten te verstoren. Voer in totaal drie wasbeurten uit.

Vergeet niet om tussen de wasstappen de pipet te wisselen om contaminatie te voorkomen door een nieuwe pipet te gebruiken. Begin de herhalingen in 2 mL neuronaal medium. Tritureer 25 keer en voorkom dat er luchtbellen ontstaan.

Laat de niet-geassocieerde segmenten vervolgens drie minuten bezinken. Gebruik een transferpipet om zoveel mogelijk supernatant te verzamelen zonder de segmenten op de bodem te verstoren. Bewaar het supernatant in een nieuwe steriele buis van 15 milliliter.

Herhaal de vorige stap met een 1000 µL pipetpunt en vervolgens met een 200 µL punt, waarna de segmenten met het blote oog volledig gedissocieerd moeten lijken. Het supernatant van alle bewerkingen wordt verzameld in dezelfde 15 mL buis. We zijn nu klaar om de cellen uit te platen. Ten slotte wordt het mengsel 10 keer herhaaldelijk overgebracht met een transferpipet om een homogene celsuspensie te verkrijgen voor het tellen.

Gebruik een steriele gele pipetpunt om elke punt van de pincet te bedekken. Plaats voorzichtig een slide-ring zo gecentreerd mogelijk op het glas. Binnen elke schaal worden deze ringen gebruikt om een gebied in de kweekschaal te isoleren waar de neuronen zullen worden geplaatst.

Gebruik de pipetpunt om ringen over de centrale put van elke schaal te schuiven. Voeg vervolgens voorzichtig het juiste volume cellen toe aan de schaal. Voeg de cellen toe in het midden van de ring die u reeds in de schaal heeft geplaatst.

Vergeet niet de tips te wisselen voor elk schaaltje. Voeg vervolgens 100 µL van de verdunde GDNF-oplossing zo dicht mogelijk bij de buitenkant van de ring in elk schaaltje toe om de proliferatie van neuronen te bevorderen. Vervolgens wordt de mitoseremmer fluoro dioxine of FDU buiten de ring toegevoegd om te voorkomen dat gliacellen overgroeien.

Plaats de pipetpuntjes vaak terug in de incubator en laat de cellen de volgende dag gedurende de nacht bezinken. Gebruik steriele pipetpuntjes om de punten van de pincet af te dekken, verwijder de ringen, plaats de schalen terug in de incubator en stoor ze zo min mogelijk tot het tijd is voor de experimenten. Controleer de schalen dagelijks op mogelijke contaminatie en verwijder problematische schalen onmiddellijk indien dit wordt waargenomen. De culturen zijn binnen drie weken klaar voor gebruik in elektrofysiologie, moleculaire biologische experimenten en immunocytochemie.

Nu de cellen zijn uitgeplaat, bekijken we enkele representatieve voorbeelden van de cellen in kweek. Hier zien we een primaire kweek die 14 dagen geleden is uitgeplaat. Dit is een voorbeeld van een goede kweek, omdat duidelijk cellichamen te zien zijn met daaruit voortvloeiende uitlopers.

Let daarnaast op de afwezigheid van schimmelgroei in de schaal, wat zou kunnen duiden op een infectie. We hebben zojuist laten zien hoe u primaire gedissocieerde dopaminerge celculturen van de middenhersenen kunt genereren uit pasgeboren knaagdieren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden: houd een steriele omgeving in stand, gebruik alleen neonaten van P0 tot P2, zaai uit op gezonde gliale substraten met gliaal geconditioneerd medium en hanteer een consistente zaaidichtheid.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.