Name: Primaire los middenhersenen Dopamine celculturen van knaagdieren pasgeborenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Leer primaire middenhersenen dopamine celculturen genereren van knaagdierneonaten voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methode maakt real-time monitoring van dopaminevrijgavekinetiek en bestudering van exocytoseregulatoren mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het werk werd ondersteund door DK065872 (ENB), een Smith Family Foundation Award of Excellence in Biomedical Research (ENB), F31 DA023760 (BMG, ENP) en P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).

<ol><li>Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+defective+mesolimbic+dopamine+exocytosis+in+obesity-prone+rats%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats.</a> FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).</li>
<li>Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+dopamine+quantal+size+in+midbrain+and+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons.</a> Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).</li>
<li>Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+vesicle+transporter+expression+regulates+vesicle+phenotype+and+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).</li>
<li>Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+recording+of+quanta+from+midbrain+dopamine+neurons+and+modulation+of+the+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size.</a> The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+mechanisms+that+regulate+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Presynaptic mechanisms that regulate quantal size.</a> Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).</li>
</ol>

De hier beschreven methoden zorgen voor prima resolutie van morfologische en neurochemische kenmerken van centrale dopamine neuronen die anders niet beschikbaar zijn in een systemische of in vivo benadering.

Materialen zijn opgenomen in het protocol tekst.

primaire los middenhersenen dopamine celculturen van knaagdieren pasgeborenen

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

De mogelijkheid om primaire celculturen van dopamine neuronen te creëren zorgt voor de studie van de presynaptische kenmerken van dopamine neuronen geïsoleerd van de systemische input van elders in de hersenen. In ons lab, gebruiken we deze neuronen aan dopamine vrijgavekinetiek met behulp van koolstof vezel amperometrie, alsook expressie van dopamine verwante genen en eiwitten met behulp van kwantitatieve PCR en immunocytochemie te beoordelen. In deze video laten we u zien hoe we deze culturen genereren op basis van knaagdieren pasgeborenen. Het proces omvat een aantal stappen, waaronder de beplating van de corticale gliale astrocyten, de conditionering van neuronale cel-cultuur media door de gliale substraat, de ontleding van de middenhersenen bij pasgeborenen, de spijsvertering, extractie en plating van dopamine neuronen en de toevoeging van neurotrofe factoren om zorgen voor overleving van de cel. De applicaties die geschikt zijn voor een dergelijk preparaat onder de elektrofysiologie, immunocytochemie, kwantitatieve PCR, video microscopie (dat wil zeggen, van real-time vesiculaire fusie met de plasmamembraan), levensvatbaarheid van de cellen assays en andere toxicologische schermen.

Primaire los middenhersenen dopamine celculturen zorgen voor de studie van de presynaptische kenmerken van dopamine neuronen. Ze kunnen worden gebruikt om real-time dopamine-afgifte kinetiek en een eiwitfractie / mRNA niveaus van de regulatoren van dopamine exocytose monitor. Hier tonen we u hoe u deze culturen genereren uit knaagdier pasgeborenen.

Primaire los middenhersenen Dopamine celculturen van knaagdieren pasgeborenen

De mogelijkheid om primaire celculturen van dopaminerge neuronen te creëren, maakt het mogelijk om de presynaptische kenmerken van dopaminerge neuronen in isolatie te bestuderen ...

Hoi, ik ben Lauren Frank van het laboratorium van Emmanuel Pothos van de afdeling Farmacologie en Experimentele Therapeutica aan de School of Medicine van Tufts University. En ik ben Emmanuel Pothos. Vandaag laten we u een procedure zien voor het genereren van primaire dopamine-celculturen uit de middenhersenen van pasgeboren knaagdieren.Deze procedure omvat de volgende stappen: het voorbereiden van instrumenten en reagentia, het dissekeren van de middenhersenen van rodenten in het stadium P0 tot P2, het tritureren van de hersensegmenten en het uitplaten van de gedissocieerde neuronen. Laten we beginnen.Voor deze procedure moeten een aantal voorbereidingsstappen twee tot drie weken vóór het genereren van de dopamine-neuronencultuur worden uitgevoerd; de gliacellen moeten worden uitgeplaat zodat ze de tijd hebben om te prolifereren en de bodem van de schalen te bedekken. De primaire dopamine-neuronen worden één tot zeven dagen vóór het kweken van de primaire neuronale cellen op een monolaag van gliacellen gekweekt. Verwijder de dag vóór de AC-cultivering het medium van de gliacellen en vervang dit door 2 mL vers neuronaal medium; alle items, behalve de dissectie-instrumenten, moeten

primary-dissociated-midbrain-dopamine-cell-cultures-from-rodent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode om organotypische segmenten van de E12.5 muriene embryonale middenhersenen genereren is beschreven. De organotypische slice culturen kan worden gebruikt om het gedrag van dopaminerge neuronen of andere ventrale middenhersenen neuronen te observeren.

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

This video outlines a method for cultivating dopaminergic neurons from mouse embryonic brain tissue. The process includes treating the midbrain with a proteolytic enzyme, detaching the cells, and culturing them on polymer-coated coverslips in a nutrient-rich medium with antibiotics for their growth and long-term viability.

Culturing and Maintaining Dopaminergic Neurons from Mouse Embryonic Brain Tissue

The video demonstrates the process of isolating and culturing dopamine neurons from the midbrain of mouse embryos. The isolated ventral midbrain floors are dissociated using enzymes. The resulting dopamine neurons are harvested and transferred into micro-islands inside multi-well plates. The cells are incubated with a dopamine neuron medium to maintain the cells at a high density inside the micro-islands.

Isolation and Culture of Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

This video demonstrates the process of quantifying alpha-synuclein accumulation in embryonic mouse dopamine neurons pre-treated with alpha-synuclein pre-formed fibrils. It outlines the steps for fixing, staining, and quantifying the dopamine neurons containing alpha-synuclein aggregates using immunofluorescence.

Studying Alpha-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Dopamine Neurons

Wij hebben, op basis van kennis uit de ontwikkelingsbiologie en gepubliceerd onderzoek, een geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om efficiënt A9 middenhersen-dopaminerge neuronen te genereren uit zowel menselijke embryonale stamcellen als menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat nuttig zou zijn voor ziektemodellering en celvervangende therapie voor de ziekte van Parkinson.

Geregisseerd Dopaminerge Neuron Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen

Dopaminerge neuronen spelen een essentiële regulerende rol in de hersenen. Hun verlies wordt geassocieerd met de ziekte van Parkinson. In deze video laten we zien hoe je primaire culturen van centrale dopaminerge neuronen kunt genereren vanuit embryonaal muizen mesencephalon. Dergelijke culturen zijn nuttig om de extreme kwetsbaarheid van deze neuronen voor verschillende stressfactoren te bestuderen.

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

De oorzaken van degeneratie van dopaminerge neuronen in de middenhersenen tijdens de ziekte van Parkinson zijn niet volledig begrepen. Cellulaire kweeksystemen bieden een essentieel hulpmiddel voor de studie van de neurofysiologische eigenschappen van deze neuronen. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol dat kan worden gebruikt voor in vitromodellering van neurodegeneratie.

Isolatie, Cultuur en onderhoud op lange termijn van de Primary mesencefale dopaminerge neuronen uit embryonale knaagdieren Brains

Bij de ziekte van Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) dopaminerge neuronen degenereren, waardoor motorische stoornissen. Hier melden wij een protocol voor het kweken van ventrale middenhersenen neuronen van een muis tot expressie eGFP gedreven door een tyrosine hydroxylase (TH) promotor sequentie, het oogsten van individuele fluorescerende neuronen uit de culturen, en het meten van hun transcriptoom met behulp van RNA-seq.

Betrouwbare identificatie van de levens- dopaminerge neuronen in de middenhersenen Cultures Met behulp van RNA Sequencing en TH-promotor-driven eGFP Expression

Het protocol presenteert de herprogrammering van perifere bloed mononucleaire cellen voor het opwekken van neurale stamcellen door Sendai virus infectie, differentiatie van iNSCs in Dopaminerge neuronen, transplantatie van de voorlopers van de DA in de eenzijdig-lesioned De ziekte van Parkinson, en de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van de in de SC afgeleide DA-precursoren voor PD-behandeling.

Generatie van geïnduceerde neurale stamcellen uit perifere mononucleaire cellen en differentiatie naar precursoren voor Dopaminerge neuron voor transplantatie studies

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neuronale α-synucleinaccumulatie in primaire muis dopamine neuronen te bestuderen. Fosforyleerde α-synuclein aggregaten in neuronen worden geïnduceerd met voorgevormde α-synucleinfibrils. Geautomatiseerde beeldvorming van immunofluorescently gelabelde cellen en onbevooroordeelde beeldanalyse maken dit robuuste protocol geschikt voor medium-to-high doorvoerscreening van geneesmiddelen die α-synucleinaccumulatie remmen.

Het bestuderen van voorgevormde Fibril Geïnduceerde α-Synuclein Accumulatie in primaire embryonale muis Midbrain Dopamine Neuronen

Dit protocol beschrijft de celkweek van dopaminerge neuronen in de middenhersenen, gevolgd door immunologische kleuring en het genereren van neuronale fenotypische profielen op basis van verworven microscopisch kleine beelden met een hoog gehalte die de identificatie van fenotypische variaties als gevolg van genetische of chemische modulaties mogelijk maken.

Fenotypische profilering van dopaminerge neuronen in de middenhersenen van menselijke stamcellen

Leer primaire middenhersenen dopamine celculturen genereren van knaagdierneonaten voor neurowetenschappelijk onderzoek. Deze methode maakt real-time monitoring van dopaminevrijgavekinetiek en bestudering van exocytoseregulatoren mogelijk.

Primaire los middenhersenen Dopamine celculturen van knaagdieren pasgeborenen

Meer video's verkennen