Name: Van MEF tot Matrigel 2: Splitsen van hESC s van MEFs op Matrigel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-09T18:48:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer het onderhoud van menselijke embryonale stamcellen in feeder-vrije omstandigheden op Matrigel met continue passage en immunofluorescentie voor pluripotentieverificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Menselijke embryonale stamcellen studies in de Teitell lab worden ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde (CIRM) Seed Grant RS1-00313. Wij danken de leden van de globale Centrum voor Regeneratieve Geneeskunde en Stamcelonderzoek aan de UCLA, in het bijzonder Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, en leden van de UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility voor hun steun aan onze studies.

hESC cultuur dagelijks onderhoud <ol><li> hESC cultuur media moeten worden veranderd om de 24 uur. Van de ES media voorraad fles bewaard bij 4 ° C, neemt de hoeveelheid oplossing nodig is (~ 20 ml per 6-well plaat), plaats in een 50 ml falcon buis, en warm tot 37 ° C in een waterbad. Zodra de media is opgewarmd, voeg bFGF opgeslagen bij 4 ° C tot een uiteindelijke concentratie van 10ng/ml. Plaats de bFGF voorraad bij 4 ° C direct na gebruik! </li><li> Alle uit de 6-well platen, maar ~ 500μl van de media. Zorg ervoor dat u werveling van de cultuur schotel om vuil te schorsen voor verwijdering. Zorg ervoor dat de bFGF in de hESC cultuur media wordt grondig gemengd en weer toe te voegen 3 ml van verse media aan elk putje van een 6-wells plaat. Zet de plaat terug in de incubator. </li></ol> Splitsen van hESC &#39;s van MEFs op Matrigel Meestal een confluente 6-well plaat van hESC &#39;s op MEFs kunnen worden gesplitst 1u02-01u03 op Matrigel 6-well platen, met de putten worden samenvloeiing weer 4-5 dagen na het splitsen. <ol><li> Bij het splitsen van hESC &#39;s op Matrigel, MEF-geconditioneerde media (CM) wordt gebruikt om te behouden pluripotentie. MEF-geconditioneerde medium wordt gemaakt op voorhand. Op de eerste dag, zijn 1,5 × 10 7 γ-bestraalde MEFs gezaaid in een T75 fles. Op de tweede dag, zijn MEFs een keer gewassen met kamertemperatuur 1 × PBS, pH 7,4, en vervolgens 15 ml van ES media aangevuld met 5ng/ml bFGF wordt toegevoegd aan de kolf. (NB: MEFs kunnen worden verzilverd in kleinere of grotere flessen, maar verhouding tussen cel-dichtheid en volume van de ES media moet constant zijn.) Het flesje is geïncubeerd bij 37 ° C voor een ander 24 uur. Op de derde dag, is de CM verzameld en vervangen door 15 ml van de verse ES media aangevuld met 5ng/ml bFGF. De verzamelde CM wordt bewaard bij 4 ° C. MEF-geconditioneerde media van een beplating van MEFs worden geoogst gedurende zeven opeenvolgende dagen tot 15 × 7 = 105ml te genereren. Na zeven dagen worden alle CM fracties samen, steriel gefiltreerd, gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 ° C. CM media bereid zoals beschreven kunnen worden opgeslagen en gebruikt voor 1 maand. </li><li> Een dag voor hESC splitsen, zet Matrigel porties in Eppendorf buisjes bij 4 ° C te ontdooien &#39;s nachts (een portie bevat 76.2mg van Matrigel, en dit is het bedrag dat nodig voor een 6-wells plaat). Op de dag van splitsing, neem een ​​flacon van de ontdooide Matrigel voor een 6-wells plaat, zet de flacon en 6 ml van de koude DMEM/F12 media op ijs. Breng de Matrigel in de DMEM/F12 media en meng goed. Voeg 1 ml van de oplossing aan elke well van een 6-wells plaat. Swirl de plaat Matrigel verspreiden op het oppervlak en incubeer de Matrigel bedekte plaat bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur voor het splitsen van de hESC &#39;s. </li><li> hESC &#39;s op MEF worden eenmaal gewassen met 1 x PBS, pH 7,4. Vervolgens 1 ml warm collagenase IV (1mg/ml) wordt toegevoegd aan elk putje van de 6-well plaat en daarna de plaat wordt geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten. </li><li> Voeg 1 ml van ES media zonder bFGF aan elke well. Gebruik een 1 ml pipet om de stamcellen te blazen van de plaat. Verzamel alle media die klompen hESC &#39;s en dode MEFs in een 50 ml falcon buis. Laat grote massa&#39;s van cellen regelen voor 5-10 min, zodat de hESC klonten vormen een pellet op de bodem van de buis, terwijl de MEF blijven hangen in het supernatant. Gooi het supernatant, en was door resuspenderen de hESC pellet met behulp van ES media ontbreekt bFGF, gevolgd door centrifugatie bij kamertemperatuur op 200 g gedurende 5 minuten. </li><li> Tot op het bord van de stamcellen op Matrigel borden, Was eerst de Matrigel platen met kamertemperatuur DMEM/F12 (1 ml per putje) en het toevoegen van 2,5 ml van CM aangevuld met 10ng/ml bFGF per putje. Resuspendeer de pellet in een geschikt volume van CM aangevuld met 10ng/ml bFGF, pipet de celsuspensie op en neer een paar keer totdat de klonten worden uniform en klein van formaat. Aliquot de suspensie bij 0,5 ml per goed op de Matrigel plaat. Merk op dat de kolonie dichtheid op Matrigel hoger is dan de dichtheid van de kolonies door de gebruikelijke splitsen op MEFs. Plaats de plaat in een 37 ° C weefselkweek incubator. </li><li> Handhaving van de hESC &#39;s op Matrigel, is CM media aangevuld met 10ng/ml bFGF veranderd elke 24 uur tot 4-5 dagen. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts++%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts .</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).</li>
</ol>

Deze video laat zien hoe passage hESC &#39;s van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen. Merk op dat de kolonie dichtheid op Matrigel hoger is dan de dichtheid van de kolonies door de gebruikelijke splitsen op MEFs. Immunofluorescentiekleuring en microscopie of flowcytometrie voor hESC pluripotentie markers, zoals Oct-4 en SSEA-4, zijn nodig om het onderhoud van hESC &#39;s in een ongedifferentieerde staat te bevestigen in feeder-vrije kweekomstandigheden.

<table><tbody><tr><td>Knockout Serum Replacer (KSR)</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax </td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Reagens</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631107</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Reagens</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Reagens</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline / Streptomycine </td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagens</td><td>Chemicon International</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>Oct-4 antilichaam</td><td>Reagens</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9081</td><td></td></tr><tr><td>anti-h/mSSEA-4 Phyc&amp;#8211;rythrine-geconjugeerde muis IgG3</td><td>Reagens</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>FAB1435P</td><td></td></tr><tr><td>FITC-geconjugeerde antirabbit IgG</td><td>Reagens</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-152</td><td></td></tr></tbody></table>

van mef tot matrigel 2: splitsen van hesc &#39;s van mefs op matrigel

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen, hoe passage hESC&#39; s van MEF platen om feeder celvrije Matrigel platen.

Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC&#39; s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 2 van 3.

Van MEF tot Matrigel 2: Splitsen van hESC &#39;s van MEFs op Matrigel

Deze video demonstreert hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC's) kunnen worden gekweekt op feeder-cellen van embryonale fibroblasten van muizen (MEF), en hoe hESC's van MEF kunnen worden overgezet...

Om de kweek van menselijke embryonale stamcellen te onderhouden, moet het kweekmedium elke 24 uur worden ververst. Begin hiervoor met een voorraadflacon embryonale stamcelmedium, bewaard bij vier graden Celsius. Neem de benodigde hoeveelheid oplossing, wat gewoonlijk ongeveer 20 milliliters per zes is.Wellplaat en plaats die hoeveelheid in een Falcon-buis van 50 milliliter en verwarm de buis met de inhoud tot 37 graden Celsius in een waterbad. Zodra het medium is opgewarmd, voegt u de FGF toe, die bewaard is bij vier graden Celsius, tot een eindconcentratie van 10 nanogram per mil. Denk eraan om de BFGF-stock direct na gebruik terug te plaatsen bij vier graden Celsius.Zorg ervoor dat de BFGF in het kweekmedium voor menselijke amox-stamcellen grondig is gemengd. Verwijder vervolgens al het medium uit elke put, waarbij ongeveer 500 microliters per put overblijft. Voeg daarna drie milliliters vers medium toe aan elke put van een zes-putsplaat en plaats de plaat terug in de incubator.Nu we hebben laten zien hoe menselijke embryonale stamcellen op ONM's worden onderhouden, laten we u vervolgens zien hoe u deze overbrengt naar matrigel. Om menselijke embryonale stamcellen die op ONM's zijn gekweekt te splitsen naar matrigel, beginnen we met een confluente zeswellsplaat met stamcellen op mes, die in een verhouding van één op twee of één op drie gesplitst kunnen worden naar matrigel zeswellsplaten.Hierdoor kunnen de wells vier tot vijf dagen na het splitsen weer confluent worden. Bij het splitsen van menselijke embryonale stamcellen op matrigel wordt meth-geconditioneerd medium gebruikt om de pluripotentie te behouden; meth-geconditioneerd medium wordt vooraf bereid. Dit gebeurt door het medium, aangevuld met 5 ng/ml BFGF, gedurende zeven dagen dagelijks te verzamelen uit een groeiende meth-cultuur; het verwijderde meth-geconditioneerde medium wordt vervangen door embryonale stamcelmedium.Elke dag. Meth-geconditioneerd medium moet worden gebruikt tot één maand nadat het is verzameld en bevroren is opgeslagen. De dag vóór het splitsen van menselijke embryonale stamcellen verplaatsen we Matrigel-aliquots in EOR-buisjes van -20 °C naar 4 °C om ze gedurende de nacht te laten ontdooien.Eén aliquot bevat twee milligram Matrigel, wat de benodigde hoeveelheid is voor één 6-wells plaat. Neem op de dag van het splitsen één vial van de ontdooide Matrigel.Gebruik voor elk flesje een six-wellplaat en meng elk flesje met 6 mL koud D-M-E-M-F 12-medium. Vergeet niet dit op ijs te bewaren. Voeg 1 mL van de oplossing toe aan elke well van een six-wellplaat.Wals vervolgens de plaat om de Matrigel over het oppervlak te verspreiden en incubeer de plaat met Matrigel gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur voordat de humane embryonale stamcellen worden gesplitst. Was de stamcellen op MES één keer met één XPBS pH 7,4 voordat u de humane embryonale stamcellen splitst. Voeg vervolgens één milliliter warme collagenase four met een concentratie van 1 mg/mL toe aan elke put die u gaat splitsen, en incubeer de plaat vervolgens gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 °C.Voeg na incubatie één milliliter embryonaire stamcelmedium zonder BFGF toe. Gebruik voor elke put een pipet van één milliliter om de stamcellen van de plaat te blazen. Verzamel al het medium dat klonten stamcellen en dode mes bevat in een Falcon-buis van 15 milliliter. Laat grote celklonten vijf minuten bezinken, zodat de stamcelklonten een pellet vormen op de bodem van de buis, terwijl de mes in het supernatant gesuspendeerd blijven.Zodra de cellen zich lijken te hebben gevestigd, wordt het supernatant weggegooid en worden de cellen gewassen door het pellet van embryonale stamcellen opnieuw te suspenderen. Centrifugeer vervolgens met behulp van medium voor embryonale stamcellen zonder BFGF bij kamertemperatuur op 200 ×g gedurende vijf minuten. Terwijl de cellen centrifugeren, kunnen de Matrigel-platen voor het uitplaten van stamcellen worden voorbereid door de platen te wassen met D-M-E-M-F 12 op kamertemperatuur (1 mL per putje) en 2,5 mL geconditioneerd medium toe te voegen, aangevuld met 10 ng/mL.BFGF per putje na centrifugatie. Resuspendeer het pellet in een passend volume meth-geconditioneerd medium aangevuld met 10 nanograms per mil. BFGF; pipetteer de cel-suspensie meerdere keren op en neer totdat de klonters uniform en klein van formaat zijn. Verdeel vervolgens de suspensie in aliquots van 0,5 milliliters per putje op de matrigel-plaat om een eindvolume van drie mils per putje te bereiken. Voor matrigel gebruiken we een hogere koloniedichtheid dan bij het gebruikelijke splitsen op platen zodra de cellen zijn toegevoegd. Plaats de plaat in een weefselkweekincubator bij 37 °C.Om de menselijke embryonale stamcellen onder matrigel-condities te behouden, wordt het medium, aangevuld met 10 ng/ml bFGF, elke 24 uur ververst gedurende vier tot vijf dagen.Menselijke embryonale stamcellen zijn gewoonlijk verontreinigd met residuele hoeveelheden MEF's na de eerste splitsing op matrigel; de tweede splitsing van matrigel naar Matrigel zal alle sporen van feeder-cellen die de stamcelcultuur verontreinigen volledig verwijderen.

from-mefs-to-matrigel-2-splitting-hescs-from-mefs-onto-matrigel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video laten we zien hoe onze lab routinematig TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen passages met trypsine.

Passage TINTEN menselijke embryonale stamcellijnen-lijnen met trypsine

Deze video laat zien hoe menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) groeien op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder-cellen. Deel 1 van 3.

Van MEF op I Matrigel: passage hESC &#39;s in de aanwezigheid van MEFs

Deze video laat zien hoe het handhaven van de groei van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de feeder cel-vrije omstandigheden en hoe je continu passage hESC' s in de feeder cel-vrije omstandigheden. Bevestiging van hESC pluripotentie gegroeid in feeder celvrije voorwaarden door immunofluorescentie microscopie is ook aangetoond. Deel 3 van 3.

Van MEF tot Matrigel 3: passage uit hESC &#39;s Matrigel op Matrigel

Dit artikel zal zich richten op het genereren van humane lever endoderm van menselijke embryonale stamcellen populaties.

Robuuste Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke embryonale stamcellen Populaties

De kwaliteit van muizen embryonische fibroblasten (MEF) wordt bepaald door de juiste spanning van muis zoals CF-1. Pluripotentie-ondersteunende MEFs en geconditioneerde media (CM), verkregen van deze moeten bevatten optimale concentraties van Activin A, Gremlin en Tgfβ1 nodig is voor de Activin / Nodal en FGF wegen naar co-operatief te behouden zelfvernieuwing en pluripotentie.

Voorbereiding van muis embryonale Fibroblast cellen die geschikt zijn voor het kweken van menselijke embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen

Ondanks aanhoudende inspanningen om de overgang culturen aan feeder-vrije omstandigheden, de afleiding en de cultuur van menselijke embryonale stamcellen (hESC) blijven grotendeels afhangen van co-culturen met muis embryonale feeders (MEF). Hier laten we zien een nieuwe methodologie voor het snel verwijderen van feeders van hESC culturen voorafgaand aan de experimenten.

Snelle Fibroblast Verwijdering uit High Density menselijke embryonale stamcellen culturen

Hier beschrijven we een protocol gebaseerd op epigenetische herprogrammering van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's) in de richting van het genereren van een homogene populatie van de skeletspieren voorlopers die onder permissieve cultuur omstandigheden vormen driedimensionale clusters van samentrekkende spiervezels (myospheres), die biologische kenmerken van de menselijke recapituleren skeletspieren.

Generatie Myospheres Van hESCs door Epigenetische herprogrammeren

Hier presenteren we protocollen voor de cultuur van humane pluripotente stamcellen (hPSC), gebaseerd op het groeien van gedissocieerde enkele cellen in een niet-kolonietype monolaag (NCM). Deze nieuwe methode, die gebruik maakt van Rho-geassocieerde kinase remmers of de laminine isovorm 521 (LN-521), is geschikt voor het produceren van grote hoeveelheden homogene hPSC's, genetische manipulatie en geneesmiddelontdekking.

Alternatieve Cultures for Human pluripotente stamcellen zijn Productie, Onderhoud, en genetische analyses

Reporter cellijnen bieden een middel om te visualiseren, te volgen en te isoleren cellen van belang zijn van de heterogene populatie. Echter, gen targeting met gebruikelijke homologe recombinatie in humane embryonale stamcellen is inefficiënt. Hierin beschrijven we richten CNS middenhersenen specifieke transcriptiefactor PITX3 locus met EGFP met zink-vinger nuclease verbeterde homologe recombinatie.

Zink-vinger Nuclease Enhanced gentargeting in menselijke embryonale stamcellen

Hier presenteren we een protocol om efficiënt humane trofoblastische cellen te genereren uit humane pluripotente stamcellen met behulp van botmorfogenetisch eiwit 4 en remmers van de Activin/Nodal-routes. Deze methode is geschikt voor de efficiënte differentiatie van humane pluripotente stamcellen en kan grote hoeveelheden cellen genereren voor genetische manipulatie.

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Leer het onderhoud van menselijke embryonale stamcellen in feeder-vrije omstandigheden op Matrigel met continue passage en immunofluorescentie voor pluripotentieverificatie.

Van MEF tot Matrigel 2: Splitsen van hESC 's van MEFs op Matrigel

Meer video's verkennen