Toepassing van een C. elegans Dopamine neuron degeneratie Assay voor de validatie van Potentieel de ziekte van Parkinson Genen

In het Caldwell Lab, ook wel de Worm Shack genoemd, bestuderen we neurologische ziektemechanismen in C. elegans. En na een lange dag van vruchtbare experimenten belonen we onszelf met een recreatieve activiteit. Hallo, ik ben Adam Knight, bachelorstudent van het Calwell Laboratory van de afdeling Biological Sciences aan de University of Alabama.

Vandaag zullen ik en mijn collega's laten zien hoe een assay voor dopaminerge neuronale degeneratie in C. elegans wordt uitgevoerd. Ik zal een dopaminerge neurodegeneratieve wormstam kruisen met transgene stammen die kandidaat-ziektegerelateerde genen en dopaminerge neuronen overexpresseren. Hallo, ik ben Adam Harrington, promovendus in het Caldwell-lab.

Vandaag laat ik u zien hoe u transgene wormen klaarmaakt voor de analyse van dopamine-neuronen. Hallo, ik ben Shu Amichi en ik ben een promovendus. Hier laat ik u zien hoe u dopamine-neuronen in C. elegans assayt, die bekendstaan als CEPs en ADEs.

Over het algemeen vertonen wormen die alleen GFP in de dopaminerge neuronen tot expressie brengen geen celdood. Echter, in aanwezigheid van CLE zullen deze en leeftijdsafhankelijke neurodegeneratie waarneembaar zijn. Met behulp van deze assay kan een transgen worden co-geëxpressieerd in de dopaminerge neuronen om te bepalen of dit de door CLE geïnduceerde toxiciteit kan versterken of onderdrukken. Laten we beginnen.

Voordat de analyse van de dopamine-neuronen wordt uitgevoerd, moeten we eerst de juiste GaN-stammen kruisen om acht wormen te verkrijgen die zowel alphas nucle als GFP tot expressie brengen onder controle van de dopamine-neuron-specifieke promoter dat one op een paringsplaat te plaatsen. Voeg nu twee L4-stadium transgene ca-a nematode toe die dopamine-neuron-specifieke expressie van ons kandidaatgen van belang vertonen, evenals expressie van de DS red two fluorescente selecteerbare marker in de spiercellen van de lichaamswand. Het is belangrijk om op te merken dat we voor elk transgeen construct drie stabiele transgene lijnen genereren.

Deze genetische kruising moet individueel worden uitgevoerd voor elk van de drie afzonderlijke gecreëerde stabiele lijnen. Verwijder en gooi de mannetjes na twee dagen weg, gevolgd door nog eens twee tot drie dagen. Inspecteer de F1-generatie.

Er zijn meerdere mannelijke nakomelingen en de paring was succesvol. Breng vervolgens individueel vijf dieren vanuit Aphrodite L4 en vier dieren van elke kruising over naar nieuwe platen, mits zij zowel de GFP-fluorescentiemarker van de mannelijke ouder als de DS red 2-fluorescente marker voor de lichaamswandspieren van de hamadi-ouder vertonen. De overgeplaatste dieren moeten zich in het L4-stadium bevinden om er zeker van te zijn dat zij nog niet zijn gepaard.

Laat de dieren, terwijl de mannetjes op de plaat aanwezig zijn, drie tot vier dagen lang zelf bevruchten om F2-nakomelingen te produceren. Verwijder nu de F2-nakomelingen om dit te doen. Transfer vijf tot 10 dieren die beide cent-markers vertonen naar hun eigen individuele platen.

Screen vervolgens de F3-generatie op platen waarin honderd procent van de dieren GFP tot expressie brengt in de dopaminerge neuronen en waarbij sommige dieren de DSred2-fluorescentiemarker tot expressie brachten in de spiercellen van de lichaamswand. Deze dieren zullen homozygoot zijn voor de alfa-synucleïne- en de GFP-genen en zullen ook het nieuw gecreëerde transgen stabiel doorgeven. Zodra de screening is voltooid, kunnen we overgaan tot de analyse van de dopaminerge neuronen.

Om de neuronanalyse te starten, bereid een vers plaatje voor van de drie dieren die in de vorige stap zijn geïdentificeerd. Stel een plaatje in voor elk van de drie transgene lijnen. Plaats daarnaast de alpha-synuclein GFP-stam alleen als controle en laat de wormen uitgroeien tot volwassenen.

Zodra de wormen volwassen zijn, worden 30 tot 40 transgene dieren van elke lijn overgebracht naar een nieuwe plaat. Laat ze gedurende vijf uur eieren leggen bij 20 °C. Verwijder en gooi ze na vijf uur weg.

De volwassenen laten de embryo's drie tot vier dagen ontwikkelen bij 20 °C totdat ze het L4-stadium bereiken. Selecteer vervolgens ongeveer honderd transgene L4-dieren en breng deze over naar een plaat die 0,04 mg/mL 5-fluorodeoxyuridine bevat.

Deze nucleotide-analoog voorkomt de ontwikkeling van de volgende generatie door remming van de DNA-synthese. Aangezien FDUR-platen lichtgevoelig zijn, moeten ze tegen het licht worden beschermd door de platen afgedekt en volledig ingepakt te houden. Maak een agarpad voor de analyse van de wormen.

Deze worden vers gebruikt en mogen niet uitdrogen. Leg twee objectglazen klaar met een stuk plakband eroverheen, in de lengte. Het plakband dient als afstandhouder voor pads van gelijke dikte.

Plaats een derde objectglas tussen hen op de tafel. Ze zijn nu gepositioneerd. Drie naast elkaar.

Plaats een druppel gesmolten agar in het midden en leg snel een ander objectglas loodrecht daarop en over alle drie de glaasjes heen. Herhaal dit om meerdere extra pads te maken, zoveel als nodig is voor het aantal te analyseren monsters. Zodra de agar-pads klaar zijn, plaatst u een druppel van 6 µL van 3 mM, 11 molaire MS222-anesthesie op een dekglas van 22 bij 30 mm.

Kies 40 volwassen dieren in de druppel en keer vervolgens het dekglas om op het agros-pad. Herhaal dit voor elk van de andere lijnen. Score 30 dieren per lijn op de aanwezigheid van elk CEP- en D-neuron.

Met behulp van een samengestelde microscoop met epi-fluorescentie in een filterkubus die visualisatie van FITC of GFP mogelijk maakt, gebruiken we een endo G-F-P-H-Y-Q filterkubus om gegevens op een scoreformulier vast te leggen. Wildtype dieren behouden volledig GFP voor lessen in alle vier de CEP-neuronen en twee A DE-neuronen. Individuele dieren die verlies van D-neuronen vertonen, worden gescoord als bekend wildtype of degenererend.

Deze neuronen worden geregistreerd als LG of verlies van GFP. Evenzo kan de mate van degeneratie worden gescoord door het totaal aantal verloren gegane neuronen in elk dier te tellen, evenals de populatie; de analyse wordt nog twee keer herhaald. Hierbij worden 30 extra dieren per lijn per proef gebruikt.

Het totaal aantal wormen met dopamine-neuronen van het wilde type uit de drie analyserondes wordt gemiddeld. De statistische analyse voor neuroprotectie wordt vervolgens uitgevoerd met de student's T-test, waarbij een P-waarde van minder dan 0,05 als significant wordt beschouwd. Om controlewormen te vergelijken met stammen die kandidaatgenen overexpresseren in dopamine-neuronen, wordt deze analyse op verschillende dagen na de eilegging uitgevoerd, waarbij de geschikte analysedagen empirisch worden bepaald.

We hebben bijvoorbeeld vastgesteld dat respectievelijk 77%, 87% en 90% van de alpha CLE plus GFP-dieren gedegenereerde dopaminerge neuronen vertonen op dag zes, zeven en 10 na de ontwikkeling. Wanneer we daarom voorspellen dat het transgen van belang de neurodegeneratie kan versterken, zullen we de analyse op dag zes uitvoeren. Evenzo zullen transgenen die neurodegeneratie kunnen onderdrukken op dag zeven en 10 worden geanalyseerd.

We hebben zojuist aangetoond hoe een dopamine-neurodegeneratie-assay in C. elegans kan worden uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om, ten eerste, geschikte markers te gebruiken voor selectie tijdens genetische kruisingen. Ten tweede, gebruik gezonde mannetjes en L4-larven voor de kruisingen.

En ten derde: zorg ervoor dat u de CEP- en DE-neuronen zorgvuldig en consistent scoort. Met deze procedure kunt u snel screenen op genetische factoren die de door alpha-alpha CLE geïnduceerde neurodegeneratie kunnen versterken of onderdrukken. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.