Name: Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Leer SDD-AGE voor het screenen van amyloïde aggregaten in eiwitonderzoek. Deze schaalbare methode scheidt SDS-resistente polymeren betrouwbaar en helpt onderzoekers bij het detecteren van prion-eiwitten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Simon Alberti voor hulp bij het ontwikkelen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de National Institutes of Health (GM25874), een Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (tot SL), en een National Science Foundation predoctorale opleiding subsidie ​​(RH).

<html> Deel 1: Voorbereiden van de gel <ol><li> Monteer de gel gieten lade. Standaard uitrusting voor horizontale DNA elektroforese kunnen worden gebruikt. Voor grote aantallen monsters, bereiden we een 20 cm x 24 cm plaat met maximaal vier 50-well kammen. Zorg ervoor dat de plaat geen krassen heeft, want deze kunnen de blot afbeelding te vervormen. </li><li> Maak een 1,5% agarose-oplossing (medium of hoge gel-sterkte, laag EMO) in 1X TAE. Het volume moet voldoende zijn om volledig onder water de kam tanden - wil je zo veel monster belasting mogelijk om detectie te maximaliseren. Magnetron van het mengsel tot de agarose volledig is opgelost. </li><li> Snel toevoegen SDS tot 0,1% ten opzichte van een 10% voorraad. Swirl te mengen. Als sommige agarose stolt tijdens deze stap, weer wordt opgelost met behulp van een kookplaat en wees voorzichtig om te voorkomen dat koken. </li><li> Giet de oplossing in de casting lade. Gebruik een kam te harken uit eventuele luchtbellen, als ze maar konden later interfereren met transfer. </li><li> Na de gel heeft, te verwijderen kammen en plaats de gel in de gel tank. Volledig onderdompelen van de gel in 1X TAE met 0,1% SDS. </li></ol> Deel 2: Voorbereiding van monsters <ol><li> Voor de high-throughput analyse van gist lysaten, beginnen we met 2-ml culturen gedurende de nacht gekweekt met snelle agitatie in 96-well blokken. In dit geval, elke cultuur is overexpressie een eiwit van belang. Bij het analyseren van lage abundantie eiwitten, moet grotere cultuur volumes worden gebruikt </li><li> Oogst cellen door centrifugeren bij 2000 RCF gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Weer Resuspendeer cellen in water en centrifuge. </li><li> Resuspendeer in 1 ml spheroplasting oplossing. Incubeer gedurende ongeveer 30 minuten bij 30 ° C (u kunt spheroplasting efficiency bevestigen met microscopie). </li><li> Centrifugeer bij 800 RCF gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Volledig te verwijderen supernatant. </li><li> Resuspendeer gepelleteerd spheroplasts in 100 ml lysis buffer. </li><li> Bedek het blok met tape en vortex op hoge snelheid gedurende 2 minuten. </li><li> Pellet cellulaire puin bij 4000 RCF gedurende 2 minuten. </li><li> Voorzichtig supernatant te verwijderen om een ​​nieuwe container, bijvoorbeeld, een 96-well PCR-plaat. </li><li> Indien gewenst, bepalen de eiwitconcentratie van de lysaten. </li><li> Voeg 4X sample buffer om de monsters te lysaten met 1X sample buffer te genereren. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Lading gel. Indien gewenst, op te slaan helft van de steekproef volume en kook het voor SDS-PAGE analyse. Om de mate van overdracht te controleren later, onder andere een pre-gekleurde SDS-PAGE marker. Bovendien kan een moleculair gewicht marker die bestaat uit een zeer grote eiwitten (bijvoorbeeld kip pectoralis extract) worden gebruikt om de grootte van de complexen opgelost te schatten. </li><li> Op een laag voltage (≤ 3 V / cm gel lengte) tot de kleurstof voorkant bereikt ~ 1 cm van het einde van de gel. Dit zal enkele uren duren. Het is belangrijk dat de gel koud blijven, omdat anders de verspreiding van een laag moleculair gewicht eiwit (bijv. monomeren) kunnen beperken hun detectie. </li></ol> Deel 3: Overdracht <ol><li> Knip een stuk van nitrocellulose met dezelfde afmetingen als de gel. </li><li> Knip 20 stukjes van GB004 en 8 stukjes GB002 vloeipapier, met dezelfde afmetingen als de gel. Snij een extra stukje GB004 om te worden gebruikt als een lont, maken ongeveer 20 centimeter breder dan de gel. </li><li> Dompel de nitrocellulose, lont, en 4 stuks van de GB002 in 1X TBS. </li><li> In een plastic container, assembleren een stapel papieren als volgt: 20 stuks van droge GB004, dan 4 stuks van droge GB002, dan is een stuk van de pre-wet GB002. Leg de nitrocellulose op de top van deze stapel. </li><li> Spoel de gel op de casting bak kort in om het overtollige water loopt buffer te verwijderen. Dan, voorzichtig beginnen met de gel glijden de lade op de stack. Terwijl schuiven de gel uit de lade, blussen het membraan met TBS als nodig is. De extra buffer helpt te voorkomen dat bellen van vast komen te zitten onder de gel. Een overdracht pipet werkt goed voor dit doel. </li><li> Nadat de gel is verplaatst naar de stapel, grondig te controleren op luchtbellen. Als er aanwezig zijn, til de rand van de gel en opnieuw buffer totdat de bellen kunnen worden uitgewerkt. </li><li> Doe de overige drie pre-bevochtigd GB002 stukjes op de top van de gel. Zorg voor een goed contact tussen alle lagen door het werpen van een pipet stevig aan de bovenkant van de stapel. </li><li> Flank de overdracht stapel met twee verhoogde bakken met TBS. Drapeer de pre-nat wiek over de hele stack zodanig dat beide uiteinden van de pit wordt ondergedompeld in TBS. </li><li> Dek de verzamelde overdracht schoorsteen met een extra plastic bak met extra gewicht (bijvoorbeeld een 500 ml fles water). </li><li> Laat de overdracht aan te gaan voor een minimum van drie uur of &#39;s nachts. </li><li> Na de overdracht, kan het membraan worden verwerkt door standaard Western blotting. </li></ol> Spheroplasting Solution 1,2 M D-sorbitol 0.5 mM MgCl 2 20 mM Tris, pH 7,5 50 mM BME (add vers) 0,5 mg / ml Zymolyase 100T (add vers) coration: onderstrepen; &quot;&gt; Lysis Buffer 100 mM Tris 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME (add vers) proteaseremmers (toe te voegen vers) 4X Sample Buffer 2X TAE 20% glycerol 8% SDS broomfenolblauw de voorkeur

<ol><li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+%5BPSI%2B%5D+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li>
<li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast%3A+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li>
<li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle%3A+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+%5BPSI%2B%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li>
<li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+%5BRNQ%2B%5D+seeds+necessary+for+prion+propagation.%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li>
<li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li>
<li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+%28eRF3%29+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li>
<li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li>
<li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li>
<li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein%28a%29+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li>
</ol>

SDD-AGE werd voor het eerst gerapporteerd door Kryndushkin et al.. 1, aan SDS-resistente complexen van de studie van de [PSI +] prion in gist, en is sindsdien gevonden wijdverbreide gebruik het bestuderen van zowel prion-en non-prionen aggregaten 2-9. Echter, de overdracht van de eiwitten aan een membraan na elektroforese in een agarosegel is problematisch, en kan resulteren in een vertekend blot afbeelding 5. Daarnaast is de verzonken electroblotting techniek die het meest gebruikt introduceert praktische beperkingen voor de grootte van de gel en dus het aantal monsters dat kan worden verwerkt. We hebben deze problemen aangepakt door het gebruik van dalende capillaire overdracht 10, een eenvoudige procedure die een stapel droge blotting papers gebruikt om eiwitten overdracht van de gel tot een nitrocellulose membraan. Capillaire overdracht voorkomt vervorming en zorgt dat grote gels te gemakkelijk worden verwerkt. Er zijn een paar dingen te overwegen voordat u SDD-AGE. Voor ruwe monsters (bijv. lysaten), immunodetectie van specifieke eiwitten nodig. SDD-AGE is niet volledig het eiwit complexen van belang denatureren, zodat het eiwit (s) te detecteren moet een epitoop-tag buiten de regio amyloidogenic dragen. Lysaten kunnen in het algemeen worden bereid als zij zouden worden voor een normaal SDS-PAGE, met twee belangrijke verschillen. Ten eerste moet extra zorg worden genomen om degradatie te voorkomen door proteolyse. De gedeeltelijk denaturerende omstandigheden hier gebruikt zijn niet voldoende om proteasen inactiveren, en kan ook doeleiwitten gevoeliger voor proteolyse. Gebruik een compleet proteaseremmer cocktail op ten minste twee maal de aanbevolen concentratie. Ten tweede, het verwarmen van de monsters moet worden vermeden. Indien een all-monomeer negatieve controle gewenst is, bijvoorbeeld om te bevestigen dat een hoog-moleculair-gewicht soorten die niet zijn te wijten aan covalente modificaties, een 10-minuten incubatie bij 95 ° C kan worden gebruikt, die de meeste amyloids zal herstellen monomere eiwit.

<table><tbody><tr><td>zymolyase 100T</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493-1</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>Hybond-C extra nitrocellulose</td><td>Amersham</td><td>RPN303E</td><td></td></tr><tr><td>GB004 blotpapier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>10427926</td><td></td></tr><tr><td>GB002 (3MM Chr) blotpapier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-917</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (UltraPure)</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr></tbody></table>

screening op amyloid aggregation door semi-denaturerende detergent-agarosegelelektroforese

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloïd aggregatie wordt in verband gebracht met tal van eiwit misfolding pathologieën en ligt ten grondslag aan de infectieuze eigenschappen van prionen, die conformationeel zichzelf templating eiwitten die worden verondersteld om gunstige rollen in lagere organismen hebben. Amyloids zijn notoir moeilijk te bestuderen door hun onoplosbaarheid en structurele heterogeniteit. Echter, resolutie van amyloid polymeren op basis van grootte en detergent onoplosbaarheid mogelijk gemaakt door de semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese (SDD-AGE). Deze techniek is het vinden van wijdverbreide gebruik voor de detectie en karakterisering van amyloïde conformationele varianten. Hier tonen we een aanpassing van deze techniek die het gebruik ervan vergemakkelijkt in grootschalige toepassingen, zoals screens voor nieuwe prionen en andere amyloidogenic eiwitten. De nieuwe SDD-AGE methode maakt gebruik van capillaire transfer voor grotere betrouwbaarheid en gebruiksgemak, en kan elke grote gel te worden ondergebracht. Zo kan een groot aantal monsters, bereid uit cellen of gezuiverde eiwitten, gelijktijdig worden verwerkt voor de aanwezigheid van SDS-onoplosbare conformeren van gemerkte eiwitten.

SDD-AGE is een nuttige techniek voor de detectie en karakterisering van amyloid-achtige polymeren in de cellen. Hier laten we zien een aanpassing dat maakt deze techniek vatbaar is voor grootschalige toepassingen.

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Amyloïde-aggregatie is geassocieerd met talrijke pathologieën door verkeerde eiwitvouwing en vormt de basis voor de infectieuze eigenschappen van prionen, die ...

Hallo, ik ben Randall Hoffman, promovendus in het laboratorium van Susan Linus van de afdeling biologie aan MIT. Vandaag introduceer ik u bij semi-denaturerende detergent-agarosegelelektroforese, of SDD-AGE. Ons laboratorium gebruikt deze techniek om te screenen op prionen en andere amyloïde eiwitten.Onze versie van SDD-leeftijd is eenvoudig en betrouwbaar en kan worden geschaald om elk aantal monsters te accommoderen. Amyloïden zijn uitzonderlijk resistent tegen denaturatie door SDS, waardoor ze met behulp van SDDH kunnen worden gescheiden van andere eiwitten. Gegevens van SDDH kunnen echter op zichzelf niet worden gebruikt om te bevestigen dat iets een amyloïde is.Om dat te doen, moet u andere technieken gebruiken. Met dat in gedachten, laat ik het u zien. S-D-D-H-S-D-D-H kan worden uitgevoerd met standaardapparatuur voor horizontale DNA-elektroforese.Ten eerste moet u de gietbak voor de gel assembleren. De grootte van de apparatus hangt af van het aantal monsters dat u heeft. Voor een groot aantal monsters gebruiken we een plaat van 20 bij 24 centimeter en maximaal vier kammen met 50 putjes.Om de gel voor te bereiden, heeft u een agarose met gemiddelde of hoge gelsterkte en een laag EEO-gehalte, een 1x TAE-buffer en een 10% stockoplossing van SDS nodig. Maak een 1,5% agarose-oplossing in 1x TAE. Maak de gel zo dik mogelijk, zodat u de maximale hoeveelheid monster kunt laden en de detectie kunt optimaliseren. Verwarm het mengsel in de magnetron tot de agarose volledig is opgelost.Voeg de 100 XSDS-stamoplossing snel toe aan 0,1% en draai het mengsel rond om te mengen. Als er tijdens deze stap wat neerslag ontstaat, los dit dan op een warmteplaat op. Let erop dat het mengsel niet gaat koken.Giet deze oplossing in de gietplaat terwijl deze nog heet is, aangezien de oplossing na toevoeging van SDS gemakkelijk kan overkoken. Gebruik vervolgens een kam om eventuele luchtbellen te verwijderen die later during de geltransfer hinderlijk kunnen zijn. Wanneer de gel volledig is afgekoeld en gestold, worden de kammen voorzichtig verwijderd en wordt de gel in het tankje geplaatst.Dompel de gel volledig onder in één XTAE met 0,1% SDS. U kunt nu de monsters laden. De eiwitmonsters die worden gebruikt in SDDH worden op dezelfde manier voorbereid als bij een SDS-page, met twee belangrijke uitzonderingen.Ten eerste dient u te voorkomen dat de monsters worden verhit, omdat dit de aggregaten kan denatureren tot eiwitmonomeren. Ten tweede moet u er zorg voor dragen dat eiwitdegradatie wordt voorkomen. Omdat de hier gebruikte denaturerende condities onvoldoende zijn om alle proteasen te inactiveren, raden wij aan om ten minste twee keer de aanbevolen concentratie van een complete protease-remmercocktail te gebruiken.In deze demonstratie gebruiken we lysaten van gistcellen die een specifiek eiwit van belang overexpresseren. Over het algemeen gebruiken we twee ml overnight-culturen, gekweekt in 96-well blocks verkrijgbaar bij VWR, maar bij het analyseren van eiwitten met een lage abundantie moeten grotere cultuurvolumes worden gebruikt.Oogst de cellen door de cultuur vijf minuten lang te centrifugeren bij 2000 RCF bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugering het supernatant en was de cellen door ze opnieuw te suspenderen in water en opnieuw te centrifugeren. Verwijder na de tweede spin het supernatant en resuspendeer de cellen in plating-oplossing. De enzymen in de oplossing verteren de celwanden, wat een efficiënte lyse van de cellen mogelijk maakt met een klein volume lysisbuffer. Incubeer gedurende 30 minuten bij 30 °C.Centrifuge de resterende plastic cellen deze keer 5 minuten bij 800 RCF om een pellet te vormen. Verwijder het supernatant volledig en resuspendeer elke pellet in 100 µL lysisbuffer. Bedek vervolgens het blok met tape en vortex op hoge snelheid gedurende twee minuten.Dit helpt om alle plastic bolletjes samen met het celdebris bij 4,000 RCF neer te slaan. Gedurende twee minuten. Breng het supernatant voorzichtig over naar een 96-wells PCR-plaat.Meestal analyseren we in ons laboratorium honderden monsters tegelijk, waarvoor we gebruikmaken van een vloeistofbehandelingssysteem. Bepaal indien gewenst de eiwitconcentratie van de lysaten. Voeg vervolgens vier x monsterbuffer toe aan de monsters om lysaten te verkrijgen die één x monsterbuffer bevatten en incubeer deze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Laad nu de monsters in de gel. Indien gewenst kunnen de helft van de monsters worden bewaard voor SDS-PAGE-analyse. Laad daarnaast molecuulgewichtmarkers, waaronder vooraf gekleurde markers en een marker met een zeer hoog molecuulgewicht, zoals kippenflector-extract.Indien gewenst is het belangrijk om de gel koel te houden om diffusie van eiwitten met een laag molecuulgewicht te voorkomen, dus kunt u deze in de koelruimte laten lopen. Laat de gel lopen bij een laag voltage van minder dan drie volt per centimeter van de gellengte. Laat de gel enkele uren lopen totdat de kleurstof ongeveer één centimeter van het einde van de gel bereikt.Omdat amyloïd bij kamertemperatuur niet wordt gedenatureerd door 2% SDS, blijft het intact terwijl andere complexen, waaronder de meeste niet-amyloïde aggregaten, dissociëren in de aanwezigheid van 2% SDS. Hierdoor zullen de meeste eiwitten monomeer zijn en snel door de gel migreren, terwijl de SDS-resistente amyloïden met een hoog molecuulgewicht langzamer migreren.Daarna is de gel klaar voor overdracht. Hoewel meerdere overdrachtsmethoden kunnen worden gebruikt, behalen wij de beste resultaten met capillaire overdracht. Omdat capillaire overdracht geschikt is voor elke gelgrootte, is het praktisch om honderden monsters via capillaire overdracht te analyseren.Een stapel droge blotpapieren dient om de buffer door de gel te trekken, waardoor eiwitten worden afgezet op een nitrocellulosemembraan dat tussen de papieren en de gel is geplaatst. U moet een stuk nitrocellulose, zoals high bond C, extra, knippen op dezelfde afmetingen als de gel. U moet daarnaast 20 stukken GBO 04 en acht stukken GBO 02 blotpapier knippen op dezelfde grootte als de gel.GB 04 is zeer dik en absorberend. Terwijl GB 02 veel dunner is en een fijnere textuur heeft, wat zorgt voor een gelijkmatiger contact met het membraan. Snijd een extra stuk GB 04 om als lont te gebruiken en maak dit ongeveer 20 centimeter breder dan de ondergedompelde gel.Combine de nitrocellulose UL WIC, vier stukken GBO O2 en één XTBS in een plastic bak en stel een stapel papier als volgt samen: 20 stukken droge GBO O4, vervolgens vier stukken droge GBO O2 en tot slot één stuk voorgewette GBO O2.Leg de nitrocellulose bovenop deze stapel. Spoel de gel op de gietplaat kort af met water om overtollige loopbuffer te verwijderen. Begin vervolgens voorzichtig de gel van de plaat op de stapel te schuiven, terwijl u de gel bij anvoeging van TBS indien nodig van de plaat schuift.De extra buffer helpt te voorkomen dat er luchtbellen in de gel opgesloten raken. De transferpipet is hiervoor zeer geschikt nadat de gel volledig naar de stack is verplaatst. Controleer grondig of er luchtbellen aanwezig zijn.Til de rand van de gel op en voeg opnieuw buffer toe totdat de luchtbellen zijn verwijderd. Plaats de overige drie voorbevochtigde GBO oh twee-stukken bovenop de gel. Zorg voor een volledig contact tussen alle lagen door met een pipette stevig over de bovenkant van de stapel te rollen.Plaats aan weerszijden van de transferstapel twee verhoogde bakken met TBS en leg de vooraf bevochtigde lont over de stapel, zodanig dat beide uiteinden van de lont ondergedompeld zijn in TBS. Dek de geassembleerde transferstapel af met een extra plastic tray waarop een gewicht is geplaatst, zoals een fles water van 500 ml. De lont zal buffer uit de bakken trekken en het droge blotpapier zal de buffer gedurende enkele uren door de gel trekken.Hierdoor worden de eiwitten op het membraan afgezet; laat de overdracht minimaal drie uur of overnacht doorgaan. Nadat de capillaire overdracht is voltooid, kan het membraan worden verwerkt via standaard western blotting. Hier ziet u een typische blot van eiwitten die werden overexpressie in een giststam die bepaalde eiwitten predisponeert voor de vorming van amyloïde.U kunt duidelijk zien dat sommige van onze kandidaten zeer goed amyloïde of SDS-resistente soorten met een hoog molecuulgewicht vormen, zoals hier en hier getoond. Anderen vormen echter geen aggregaten en zijn volledig monomeer, zoals deze en deze. Daarnaast is te zien dat de grootte van de amyloïde polymeren verschilt afhankelijk van het eiwit, wat u kunt zien in deze twee banen.We hebben zojuist een eenvoudige methode gedemonstreerd voor het analyseren van onoplosbare aggregaten met een hoog molecuulgewicht, zoals amyloïden van kandidaat-prionen. We hopen dat u onze presentatie met interesse heeft bekeken en dat u deze techniek nuttig vindt voor studies naar immunogene amyloïde-eiwitten. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw onderzoek.

screening-for-amyloid-aggregation-semi-denaturing-detergent-agarose

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een techniek voor de bereiding van menselijke verduidelijkt corticale homogenaten, eiwit scheiding door SDS-PAGE, antigen retrieval en immunoblotting met een antilichaam tegen het Aß peptide. Met behulp van dit protocol, wij consequent te sporen monomere en multimere Aß in corticale weefsel van mensen met de ziekte van Alzheimer pathologie.

SDS-PAGE/Immunoblot Detectie van Aß multimeren in Human Corticale weefselhomogenaten met behulp van antigeen-epitoop

This video demonstrates a denaturing polyacrylamide-based separation technique for proteins. This technique helps in the preliminary identification of proteins based on their molecular weights.

Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis for Protein Analysis: A Technique to Separate and Visualize Proteins Based on Molecular Weight

This video demonstrates the two-dimensional semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis-based separation of amyloid fibers. The technique separates the polymorphic amyloid aggregates based on their heterogeneous size.

Two-Dimensional Semi-Denaturing Agarose Gel Electrophoresis: A Technique to Separate Polymorphic Amyloids Fibers Based on Size Heterogeneity

Eiwitten kunnen ofwel een natuurlijke structuur aannemen ofwel verkeerd vouwen in onoplosbare amyloyde. Omstandigheden die de verkeerd vouwende route bevorderen, leiden tot de vorming van verschillende soorten amyloyde fibrillen. De hier beschreven methoden maken een snelle omzetting van natuurlijke eiwitten in amyloyde in vitro mogelijk.

Snelle generatie van amyloïde uit native eiwitten in vitro

Eenvoudige methoden beschreven voor het aantonen van de productie van cytotoxische amyloids na infectie van pulmonaire endotheel door Pseudomonas aeruginosa.

Methoden voor het opsporen van cytotoxische Amyloids volgende infectie van pulmonaire endotheliale cellen door Pseudomonas aeruginosa

Hier gebruiken we de Elektroforese van het gel van de tweedimensionale semi-denatureren agarose bevestigen de aanwezigheid van amyloid-achtige vezels van heterogene grootte en uitsluiten van de mogelijkheid dat de heterogeniteit van grootte te wijten aan de dissociatie van de amyloïde vezels tijdens de gel is lopend proces.

Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Dit rapport beschrijft technieken om gesulfateerde glycosaminoglycanen (GAG's) uit biologische monsters te isoleren en te zuiveren en een polyacrylamidegel-elektroforesebenadering om hun grootte te benaderen. GAG's dragen bij aan de weefselstructuur en beïnvloeden signaleringsprocessen via elektrostatische interactie met eiwitten. GAG-polymeerlengte draagt bij aan hun bindingsaffiniteit voor verwante liganden.

Detectie van glycosaminoglycanen door polyacrylamide gel-elektroforese en zilverkleuring

Dit protocol beschrijft de extractie en visualisatie van geaggregeerde en oplosbare eiwitten uit Escherichia coli na behandeling met een proteotoxisch antimicrobieel middel. Het volgen van deze procedure maakt een kwalitatieve vergelijking mogelijk van de vorming van eiwitaggregaten in vivo in verschillende bacteriestammen en/of tussen behandelingen.

Extractie en visualisatie van eiwitaggregaten na behandeling van Escherichia coli met een proteotoxische stressor

Hier beschrijven we een gistsysteem dat menselijke γ-secretase reconstrueert. Dit systeem maakt het mogelijk om mutaties die de activiteit beïnvloeden te identificeren en te bestuderen en om γ-secretaseremmers (GSI's) te screenen. Door gebruik te maken van het functieverlies van familiale mutanten voor de ziekte van Alzheimer, is het mogelijk om te screenen op γ-secretasemodulatoren (GSM's).

Saccharomyces cerevisiae Modellen van de ziekte van Alzheimer om genen, mutaties en chemicaliën te screenen die de productie van amyloïde bèta beïnvloeden door γ-secretase

Deze studie beschrijft experimentele methoden om GFAP en de ziekteverwekkende mutaties biochemisch te karakteriseren, met de nadruk op filamentassemblage, aggregatie en posttranslationele modificatie. Hoogzuivere GFAP-eiwitten werden geanalyseerd, wat inzicht gaf in de mechanismen van de ziekte van Alexander die een kader kunnen bieden voor het bestuderen van potentiële therapeutische doelwitten en het begrijpen van GFAP-mutaties en gerelateerde aandoeningen.

Experimentele benaderingen voor biochemische analyse van gliale fibrillaire zure eiwitten en de ziekte-geassocieerde varianten

Leer SDD-AGE voor het screenen van amyloïde aggregaten in eiwitonderzoek. Deze schaalbare methode scheidt SDS-resistente polymeren betrouwbaar en helpt onderzoekers bij het detecteren van prion-eiwitten.

Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Meer video's verkennen