Screening op Amyloid Aggregation door semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese

Hallo, ik ben Randall Hoffman, promovendus in het laboratorium van Susan Linus van de afdeling biologie aan het MIT. Vandaag introduceer ik u bij semi-denaturerende detergent-agarosegelelektroforese, of SDD-AGE. Ons laboratorium gebruikt deze techniek om te screenen op prionen en andere amyloïde eiwitten.

Onze versie van SDD-age is eenvoudig en betrouwbaar en kan worden geschaald om elk aantal monsters te kunnen verwerken. Amyloïden zijn uitzonderlijk resistent tegen denaturatie door SDS, waardoor ze met behulp van SDDH van andere eiwitten kunnen worden gescheiden. Gegevens van SDDH kunnen echter op zichzelf niet worden gebruikt om te bevestigen dat iets een amyloïde is.

Om dat te doen, moet u andere technieken gebruiken. Met dat in gedachten, laat ik het u zien. S-D-D-H-S-D-D-H kan worden uitgevoerd met standaardapparatuur voor horizontale DNA-elektroforese.

Assembleer eerst de gietplaat voor de gel. De grootte van de apparatus hangt af van het aantal monsters dat u heeft. Voor een groot aantal monsters gebruiken we een plaat van 20 bij 24 centimeter en tot vier kammen van 50 putjes.

Om de gel voor te bereiden, heeft u medium- of high-gelsterkte lage EEO agros, één XTAE-buffer en een 10% stockoplossing van SDS nodig. Maak een 1,5% AROS-oplossing en één XTAE. Maak de gel zo dik mogelijk, zodat u de maximale hoeveelheid monster kunt laden en de detectie kunt optimaliseren. Verhit het mengsel in de magnetron totdat de aros volledig is opgelost.

Voeg de 100 XSDS-stamoplossing snel toe aan 0,1% en draai het mengsel rond om te mengen. Als er tijdens deze stap wat neerslag ontstaat, los dit dan op op een warmteplaat. Let erop dat de vloeistof niet gaat koken.

Giet deze oplossing in de gietplaat terwijl deze nog warm is, aangezien de oplossing na toevoeging van SDS gemakkelijk kan overkoken. Gebruik vervolgens een kam om eventuele luchtbellen te verwijderen die later tijdens de geltransfer hinderlijk kunnen zijn. Zodra de gel volledig is afgekoeld en gestold, verwijdert u voorzichtig de kammen en plaatst u de gel in het tankreservoir.

Dompel de gel volledig onder in een XTAE met 0,1% SDS. U kunt nu de monsters laden. De eiwitmonsters die worden gebruikt in SDDH worden op dezelfde manier voorbereid als bij een SDS-PAGE, met twee belangrijke uitzonderingen.

Ten eerste dient u het verhitten van de monsters te vermijden, aangezien dit de aggregaten kan denatureren tot eiwitmonomeren. Ten tweede dient u voorzichtig te zijn om proteinedegradatie te voorkomen. Omdat de hier gebruikte denaturerende omstandigheden onvoldoende zijn om alle proteasen te inactiveren, raden wij aan om ten minste twee keer de aanbevolen concentratie van een complete protease-remmercocktail te gebruiken.

In deze demonstratie gebruiken we lysaten van gistcellen die een specifiek eiwit van belang overexpresseren. Over het algemeen gebruiken we twee ml overnight-culturen gekweekt in 96-wells blokken verkrijgbaar via VWR, maar bij het analyseren van eiwitten met een lage abundantie moeten grotere cultuurvolumes worden gebruikt.

Oogst de cellen door de cultuur vijf minuten te centrifugeren bij 2000 RCF bij kamertemperatuur. Verwijder na centrifugatie het supernatant en was de cellen door ze opnieuw te resuspenderen in water en opnieuw te centrifugeren. Verwijder na de tweede spin het supernatant en resuspendeer de cellen in plating-oplossing. De enzymen in de oplossing verteren de celwanden, wat een efficiënte lysering van de cellen in een klein volume lysisbuffer mogelijk maakt. Incubeer gedurende 30 minuten bij 30 °C.

Centrifuge de overgebleven plastic cellen ditmaal bij 800 RCF gedurende vijf minuten om een pellet te vormen. Verwijder het supernatant volledig en resuspendeer elke pellet in 100 µL lysisbuffer. Dek vervolgens het blok af met tape en vortex bij hoge snelheid gedurende twee minuten.

Dit helpt om alle plastic bolletjes samen met het celdebris neer te slaan bij 4.000 RCF gedurende twee minuten. Breng het supernatant voorzichtig over naar een 96-well PCR-plaat.

In ons laboratorium analyseren we gewoonlijk honderden monsters tegelijk, waarvoor we gebruikmaken van een vloeistofhandelingssysteem. Bepaal indien gewenst de eiwitconcentratie van de lysaten. Voeg vervolgens vier x monsterbuffer toe aan de monsters om lysaten te verkrijgen die één x monsterbuffer bevatten en incubeer deze vijf minuten bij kamertemperatuur.

Laad nu de monsters in de gel. Indien gewenst kunnen de helft van de monsters worden bewaard voor SDS-PAGE-analyse. Laad daarnaast molecuulgewichtmarkers, waaronder vooraf gekleurde markers en een marker met een zeer hoog molecuulgewicht, zoals kippenflector-extract.

Indien gewenst is het belangrijk om de gel koel te houden om diffusie van eiwitten met een laag molecuulgewicht te voorkomen, dus u kunt de gel eventueel in de koelruimte draaien. Draai de gel bij een laag voltage van minder dan drie volt per centimeter gellengte. Draai de gel gedurende enkele uren totdat de kleurstof ongeveer één centimeter van het einde van de gel bereikt.

Omdat amyloïde niet denatureert door 2% SDS bij kamertemperatuur, blijft het intact terwijl andere complexen, waaronder de meeste niet-amyloïde aggregaten, dissociëren in de aanwezigheid van 2% SDS. Hierdoor zullen de meeste eiwitten monomerisch zijn en snel door de gel migreren, terwijl de SDS-resistente amyloïden met een hoog molecuulgewicht langzamer migreren.

Daarna is de gel klaar voor overdracht. Hoewel er meerdere overdrachtsmethoden kunnen worden gebruikt, behalen we de beste resultaten met capillaire overdracht. Omdat capillaire overdracht geschikt is voor elke gelgrootte, is het praktisch om honderden monsters via capillaire overdracht te analyseren.

Een stapel droge blottingpapers dient om buffer door de gel te trekken, waardoor eiwitten worden afgezet op een nitrocellulosemembraan dat tussen de papers en de gel is geplaatst. U moet een stuk nitrocellulose, zoals high bond C, extra, knippen met dezelfde afmetingen als de gel. Daarnaast moet u 20 stukken GBO 04 en acht stukken GBO 02 blottingpaper op dezelfde grootte als de gel knippen.

GB 04 is zeer dik en absorberend. Terwijl GB 02 veel dunner is en een fijnere textuur heeft, wat zorgt voor een gelijkmatiger contact met het membraan. Snijd een extra stuk GB 04 om als lont te gebruiken en maak dit ongeveer 20 centimeter breder dan de ondergedompelde gel.

Plaats de nitrous UL WIC, vier stukken GBO o2 en één XTBS in een plastic bak en stel een stapel papier als volgt samen: 20 stukken droge GBO o4, vervolgens vier stukken droge GBO o2 en tot slot één stuk vochtige GBO o2.

Plaats de nitrocellulose bovenop deze stapel. Spoel de gel op de gietplaat kort af met water om overtollige loopbuffer te verwijderen. Begin vervolgens voorzichtig de gel van de plaat op de stapel te schuiven, terwijl u het membraan indien nodig bevochtigt met TBS tijdens het losschuiven van de gel van de plaat.

De extra buffer helpt te voorkomen dat er luchtbellen in de gel opgesloten raken. De transferpipet is hiervoor zeer geschikt nadat de gel volledig naar de stack is verplaatst. Controleer grondig op de aanwezigheid van luchtbellen.

Til de rand van de gel op en voeg opnieuw buffer toe totdat de luchtbellen zijn verwijderd. Plaats de overige drie voorbevochtigde GBO-stukken bovenop de gel. Zorg voor een volledig contact tussen alle lagen door een pipet stevig over de bovenkant van de stapel te rollen.

Plaats aan weerszijden van de transferstack twee verhoogde bakjes met TBS en draper de vooraf bevochtigde lont over de stack, zodat beide uiteinden van de lont ondergedompeld zijn in TBS. Bedek de geassembleerde transferstack met een extra plastic plateau met daarop een gewicht, zoals een fles water van 500 ml. De lont zal buffer uit de bakjes trekken en het droge blotpapier zal de buffer gedurende enkele uren door de gel trekken.

Hiermee worden de eiwitten op het membraan afgezet; laat de overdracht minimaal drie uur of een nacht doorgaan. Nadat de capillaire overdracht is voltooid, kan het membraan worden verwerkt via standaard western blotting. Hier ziet u een typische blot van eiwitten die overexpressie vertoonden in een giststam die bepaalde eiwitten predisponeert voor de vorming van amyloïde.

U kunt duidelijk zien dat sommige van onze kandidaten zeer goed amyloïde of SDS-resistente soorten met een hoog molecuulgewicht vormen, zoals hier en hier getoond. Anderen vormen echter geen aggregaten en zijn volledig monomerisch, zoals deze en deze. Daarnaast is te zien dat de grootte van de amyloïde polymeren verschilt afhankelijk van het eiwit, wat u kunt zien in deze twee banen.

We hebben u zojuist een eenvoudige methode getoond voor het analyseren van onoplosbare aggregaten met een hoog molecuulgewicht, zoals amyloïden van kandidaatprionen. We hopen dat u onze presentatie met interesse heeft bekeken en dat u deze techniek nuttig vindt voor studies naar immunogene amyloïde-eiwitten. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw onderzoek.