Name: Reaggregate Thymus Culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Leer reaggregaat thymusculturen met 2-dGuo-behandeling voor T-celdifferentiatieonderzoek. Deze methode genereert CD4- en CD8-positieve subsets binnen 18 uur voor immunologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Voor meer informatie over het voorbereiden reggregate thymus culturen kunt u terecht op <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a> .

De auteurs hebben niets te melden.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures.</a> A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
Stromal cells within lymphoid tissues are organized into three-dimensional structures that provide a scaffold that is thought to control the migration and development of haemopoeitic cells. Importantly, the maintenance of this three-dimensional organization appears to be critical for normal stromal cell function, with two-dimensional monolayer cultures often being shown to be capable of supporting only individual fragments of lymphoid tissue function. In the thymus, complex networks of cortical and medullary epithelial cells act as a framework that controls the recruitment, proliferation, differentiation and survival of lymphoid progenitors as they undergo the multi-stage process of intrathymic T-cell development. Understanding the functional role of individual stromal compartments in the thymus is essential in determining how the thymus imposes self/non-self discrimination. Here we describe a technique in which we exploit the plasticity of fetal tissues to re-associate into intact three-dimensional structures in vitro, following their enzymatic disaggregation. The dissociation of fetal thymus lobes into heterogeneous cellular mixtures, followed by their separation into individual cellular components, is then combined with the in vitro re-association of these desired cell types into three-dimensional reaggregate structures at defined ratios, thereby providing an opportunity to investigate particular aspects of T-cell development under defined cellular conditions. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/905/">Reaggregate Thymus Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Reaggregate Thymus Cultures

reaggregate thymus culturen

Reaggregate Thymus Cultures

In de thymus, onvolwassen CD4 +8 + thymocyten uiten willekeurig herschikte T-cel-receptor α-en b-keten genen ondergaan positieve en negatieve selectie gebeurtenissen op basis van hun vermogen om self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) moleculen uitgedrukt door de thymus te herkennen stromale cellen. In vivo analyse van de rol van de thymus stromale cellen tijdens intrathymic selectie wordt bemoeilijkt door de cellulaire complexiteit van de thymus micro-omgeving in de steady-state voor volwassenen thymus, en door het ontbreken van passende richten op strategieën om de genexpressie in het bijzonder thymus stromale compartimenten te manipuleren. We hebben aangetoond dat de thymus micro-omgeving kan gemakkelijk worden gemanipuleerd in vitro door het gebruik van reaggregate thymus orgaan culturen, die de voorbereiding van de drie-dimensionale thymus lobben van toegezegd stromale en lymfoïde cellen mogelijk te maken. Hoewel de andere in-vitro-systemen ondersteunen een aantal aspecten van de T-cel ontwikkeling, reaggregate thymus orgelcultuur blijft de enige in vitro systeem in staat om een ​​efficiënte ondersteuning van MHC klasse I en II-gemedieerde thymocyt selectie van evenementen, en kunnen dus gebruikt worden als een effectief instrument om te studeren de cellulaire en moleculaire regulatie van positieve en negatieve selectie in de thymus.

In deze video de bereiding van 2-dGuo behandelde reaggregate thymus culturen is aangetoond.

Reaggregate Thymus Culturen

Stromale cellen binnen lymfoïde weefsels zijn georganiseerd in driedimensionale structuren die een steiger vormen waarvan wordt gedacht dat deze de migratie en ...

Hoi, ik ben Andrea White en ik kom van het lab van Graham Anderson en Eric Jenkinson bij het MRC Center for Immune Regulation aan de University of Birmingham. Vandaag presenteer ik een protocol voor het verkrijgen van re-geaggregeerde thymische organculturen, die gebruikt kunnen worden om complexe cellulaire interacties te bestuderen die plaatsvinden tijdens de differentiatie van T-cellen. Voorafgaand aan deze procedure werden embryonale thymuskwabben geïsoleerd en behandeld om alle lymfocyten te verwijderen.Dit is te zien in een aparte video. De alienoïde lobben worden vervolgens gedisaggregeerd om een stromale celpreparaat te verkrijgen. Ten slotte worden de cellen weer geaggregeerd om een re-aggregaat fmic orgaankweek te vormen.Laten we beginnen. Na vijf tot zeven dagen in cultuur zouden de LO's klaar moeten zijn om te worden gedisaggregeerd voor shoal-celpreparaties; dompel de 0,8 micrometer filters onder in een Petrischaal met RPMI 1640 plus 10% FCS. Gebruik een pincet om voorzichtig alle vezels weg te duwen die niet spontaneously lossnijden. Gebruik een pipet van 1 ml om de lobben over te brengen naar een Eppendorf-buisje van 1,5 ml.Wij raden aan om niet meer dan 50 lobuwen per Eppendorf-buis te gebruiken. Laat de lobuwen onder normale zwaartekracht naar de bodem van de buis zakken en verwijder het medium. Was de lobuwen met 1 mL PBS en laat de lobuwen vervolgens opnieuw naar de bodem zakken.Herhaal dit voor in totaal drie PBS-wasbeurten, verwijder de laatste PBS-wasbeurt en voeg 600 µL van een 0,25% trypsin-oplossing toe. Plaats de Eppendorf-buis gedurende 25 minuten in een incubator op 37 °C. Tritureer de lobben voorzichtig gedurende 10 seconden met een 1 mL blauwe tip op een pipet, en plaats ze vervolgens terug in de incubator; pipetteer de lobben na 20 minuten op en neer om ze volledig te desaggregeren.Om een enkelcellige suspensie te verkrijgen, voegt u 400 µL ijskoud RPMI 1640 plus 10% FCS toe om de trypsine te neutraliseren. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende 10 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet indien gewenst in 1 mL RPMI 1640 plus 10% FCS. Tel de cellen.Normaal gesproken zouden we ongeveer 50 000 cellen per dioxazine-lobe verwachten, uitgaande van een E 15 foetus. We zijn nu klaar om het aggregaat van fmic Corgan-culturen te vormen in een 1,5 ml Eppendorf-buis. Meng de vers bereide fijnmazige stromale cellen.Samen met vooraf geselecteerde CD4-positieve CD8-positieve fibrocyten. Wij raden een verhouding van ongeveer één-op-één tussen stromale cellen en fibrocyten aan. Het aantal cellen dat u gebruikt, is afhankelijk van het aantal beschikbare cellen en de uit te voeren experimenten.Wij raden aan om in totaal ten minste honderdduizend cellen en maximaal 1,5 miljoen cellen te gebruiken. De V-aggregaten moeten groot genoeg zijn om reproduceerbaar te zijn, maar niet zo groot dat het centrum zal afsterven. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende 10 minuten bij 4 °C en assembleer vervolgens zorgvuldig het filter voor de organcultuur.Verwijder alle supernatant in deze fase met een P 200 pipet. Vortex de celpellet 10 seconden lang om een suspensie te vormen. Het volume moet ongeveer één tot twee microliter bedragen.Pipetteer het slib in een fijnmazige pipetteerpipet, waarbij de celsuspensie in de punt van de pipet blijft. Pipetteer het celslib onder onze dissectiemicroscoop voorzichtig op het midden van een 0,8 micrometer filter. Idealiter moeten de cellen als een staande druppel in een cirkel met een diameter van één tot twee millimeter worden geplaatst.Als de slurry begint uit te vloeien, laat het vocht in de slurry dan door de pos weglopen voordat de resterende cellen worden gedeponeerd. Plaats de schaal in een plastic sandwichdoos en sluit deze af. Voor thymus-organcultures wordt een doos in een incubator geplaatst; geaggregeerde culturen vormen binnen 18 uur van cultuur intacte structuren.Na vier tot vijf dagen cultuur zullen ze zowel CD4-positieve CD8-negatieve als CD4-negatieve CD8-positieve rijpe T-cel-subsets genereren. Het starten met 50 met dioxazine behandelde lobben zou voldoende stromale cellen moeten opleveren om drie tot vijf reaggregaatculturen voor te bereiden. Deze culturen verschijnen doorgaans als coherente hoopjes cellen die met een pincet van de filters kunnen worden geduwd zonder ze te beschadigen.We hebben zojuist de methode beschreven om positieve selectie door F-epitheelcellen te bestuderen. Deze methode kan ook worden gebruikt om dendritische cel-gemedieerde negatieve selectie te bestuderen. Ten slotte kan dit worden gedaan door gebruik te maken van TCR-transgene FIBROCYTEN of MHC-klasse I-deficiënte of MHC-klasse II-deficiënte stromale cellen.Dit systeem maakt afzonderlijke onderzoeken mogelijk naar de selectie van CD4-positieve of CD8-positieve T-cellen. Bedankt voor het kijken.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Deze video toont de dissectie en verwijdering van de foetale thymus en de voorbereiding van de ex vivo kweken van 2-dGuo behandeld thymus.

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

This video demonstrates a protocol for generating functional antigen-specific T cells from iPSC-derived immature T cells using a three-dimensional thymic culture system. Co-culturing the iPSC-derived immature T cells with endogenous lymphocyte-depleted mice fetal thymic lobes resulted in successful maturation of the T cells to form CD8αβ+ MHC class I+ iPSC-derived thymic emigrants (iTEs).

Three-Dimensional Thymic Culture System to Generate iPSC-Derived Thymic Emigrants

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

Het bestuderen van medullaire thymische epitheelcellen in vitro is grotendeels onsuccesvol geweest, omdat huidige 2D-kweeksystemen het in vivo scenario niet nabootsen. Het 3D-kweeksysteem dat hierin wordt beschreven - een gemodificeerd organotypisch model voor huidcultuur - heeft zich superieur getoond in het nadoen van mTEC-proliferatie, differentiatie en het behoud van promiscue genregulatie.

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

Dit artikel beschrijft in vivo en in vitro methodologie om de thymische vestigingsprogenitors te karakteriseren door de analyse van de kinetiek van generatie, fenotype en aantallen van hun T-cel nakomelingen.

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em&gt; In Vivo</em&gt; En<em&gt; In Vitro</em&gt; Testen

Deze video toont een protocol voor het verrijken van thymische epitheliale cellen (TEC's) met dichtheidsgradiënt voor FACS-isolatie. Het laat ook het gebruik van EAK16-II/EAKIIH6-peptiden zien om de TEC-aggregatievorming te bevorderen. De micro-omgevingen van EAK16-II/EAKIIH6-hydrogel bieden de 3-D configuratie die nodig is om de overleving en functie van de TEC's te handhaven.

Het bevorderen van 3-D Aggregation van FACS Gezuiverd thymus epitheelcellen met EAK 16-II / EAKIIH6 Self-assembleren Hydrogel

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Dit protocol beschrijft de isolatie van dubbelnegatieve thymocyten uit de thymus van de muis, gevolgd door retrovirale transductie en co-cultuur op het delta-achtige 4-tot expressie brengende beenmerg stromale cellijn co-cultuursysteem (OP9-DL4) voor verdere functionele analyse.

Co-cultuur en transductie van murine thymocyten op delta-achtige 4-tot expressie brengende stromale cellen om oncogenen in T-cel leukemie te bestuderen

Hier beschrijven we een protocol voor de vorming van humane iPSC-afgeleide thymusorganoïden gekweekt in 3D-fibrinehydrogels met als doel de rijping van thymusepitheelcellen (TEC) en langdurig onderhoud te ondersteunen, evenals thymopoëse in vitro.

Vorming van menselijke thymusorganoïden in driedimensionale fibrinehydrogels

Leer reaggregaat thymusculturen met 2-dGuo-behandeling voor T-celdifferentiatieonderzoek. Deze methode genereert CD4- en CD8-positieve subsets binnen 18 uur voor immunologische studies.

Reaggregate Thymus Culturen

Meer video's verkennen