Reaggregate Thymus Culturen
28 augustus 2008
In deze video de bereiding van 2-dGuo behandelde reaggregate thymus culturen is aangetoond.
Hallo, ik ben Andrea White en ik kom van het lab van Graham Anderson en Eric Jenkinson bij het MRC Center for Immune Regulation aan de Universiteit van Birmingham. Vandaag presenteer ik een protocol voor het verkrijgen van re-geaggregate thymische orgaanculturen, die kunnen worden gebruikt om complexe cellulaire interacties te bestuderen die optreden tijdens T-celdifferentiatie. Voorafgaand aan het begin van deze procedure werden embryonale thymische lobben geïsoleerd en behandeld om alle lymfocyten te verwijderen.
Dit is te zien op een aparte video. De alienoid-lobben worden vervolgens gedisaggregeerd om een stroma-celpreparaat te produceren. En tenslotte worden de cellen geaggregeerd om een re-geaggregeerde fmic-orgaancultuur te vormen.
Laten we beginnen. Na vijf tot zeven dagen in cultuur, zou de LO klaar moeten zijn om te disaggregeren voor submerg de 0,8 micrometer filters in een petrischaal met RPMI 1640 plus 10%FCS Gebruik pincetten om voorzichtig eventuele vezelhellingen los te drukken die niet blijven zweven. Gebruik een mil per huisdier om de lobben over te brengen naar een 1,5 mil eend orph buis.
We raden niet meer dan 50 lobben per eend orph-buis aan. Laat de lobben onder eenheidszwaartekracht naar de bodem van de buis zinken en verwijder het medium. Was de lobben met één mil PBS en laat ze vervolgens weer naar de bodem zinken.
Herhaal dit voor een totaal van drie PBS-washes, verwijder de laatste PBS-wash en voeg 600 microliters van een 0,25% trips-oplossing toe. Plaats de einorbuis in een 37 graden incubator gedurende 25 minuten. Tritreer de lobben voorzichtig met een mil blauwe tip op een perpetuum gedurende 10 seconden, en plaats ze vervolgens na 20 minuten terug in de incubator, pipet de lobben op en neer om ze volledig te disaggregeren.
Het zou ongeveer 30 seconden moeten duren. Om een enkele celsuspensie te bereiken, voeg 400 microliters ijskoud, RPMI 1640 plus 10%FCS toe om het trypsin imp te neutraliseren, bezink de cellen door centrifugatie bij duizend RPM, 10 minuten bij vier graden C, verwijder het supernatant en suspendeer het pellet in een mil. RPMI 1640 plus 10%FCS indien gewenst. Tel de cellen.
Typisch zouden we ongeveer 50.000 cellen per dioxazine-lob verwachten, beginnend vanaf een E 15-fibroos. Nu zijn we klaar om de aggregate fmic-organculturen te vormen in een anderhalf mil eend orph-buis. Gemengde, vers bereide fijne stromacellen.
Samen met vooraf geselecteerde CD vier positieve CD acht positieve fibrocyten. We raden een verhouding van ongeveer een-op-een van stromacellen tot fibrocyten aan. Het aantal cellen dat u zult gebruiken, hangt af van het aantal beschikbare cellen en de te verrichten experimenten.
We raden ten minste honderdduizend cellen in totaal aan en niet meer dan 1,5 miljoen cellen. Je wilt dat de V-aggregaten groot genoeg zijn om reproduceerbaar te zijn, maar niet zo groot dat het centrum zal sterven. Bezink cellen door centrifugatie bij duizend RPM gedurende 10 minuten. Bij vier graden C, bouw de orgaancultuurfilter voorzichtig samen.
Verwijder alle a SUP natin in stage met een P 200 per pet. De vortexcelpellet gedurende 10 seconden om een slurry te vormen. Het volume moet ongeveer een tot twee microliters mond zijn.
Pipet de slurry in een fijn getrokken pet, houd de suspensie van cellen op het uiteinde van de pet. Onder onze dissectiemicroscoop, pipet de celslurry voorzichtig met de mond op het midden van een 0,8 micrometer filter. Ideaal zouden cellen moeten worden geplaatst als een staande druppel in een cirkel van één tot twee millimeter in diameter.
Als de slurry begint te verspreiden, laat het vocht in de slurry drainen door de pos voordat je de resterende cellen deponeert. Plaats de schaal in een plastic sandwichbox en sluit af. Wat betreft thymus-orgaanculturen, en plaats een doos in een incubator, we aggregatieculturen vormen intacte structuren binnen 18 uur van cultuur.
Na vier tot vijf dagen van cultuur zullen ze zowel CD vier positieve acht negatieve als CD vier negatieve acht positieve volwassen cyte-subsets genereren. Beginnend met 50 met dioxazine behandelde lobben zou genoeg stromacellen moeten opleveren om drie tot vijf re-geaggregeerde culturen voor te bereiden. Deze culturen verschijnen typisch als coherente hoopjes cellen die met behulp van pincetten van de filters kunnen worden geduwd zonder ze te verstoren.
We hebben zojuist de methode beschreven om positieve selectie door F-epitheelcellen te bestuderen. Deze methode kan ook worden gebruikt om dendritische cel-gemedieerde negatieve selectie te bestuderen. Ten slotte, door het gebruik van TCR-transgene FIBROCYTEN of MHC-klasse één-deficiënte of MHC-klasse twee-deficiënte stromacellen.
Dit systeem maakt aparte onderzoeken naar CD vier positieve of CD acht positieve T-celselectie mogelijk. Bedankt voor het meeleven.
Overzicht
Deze video toont de voorbereiding van geregenereerde thymusculturen behandeld met 2-dGuo. Deze culturen zijn essentieel voor het bestuderen van T-celdifferentiatie en cellulaire interacties.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Thymus Organ Culturen
Achtergrond
- Thymus organ culturen worden gebruikt om T-cel ontwikkeling te bestuderen.
- Geregenereerde culturen maken de onderzoeking van cellulaire interacties mogelijk.
- 2-dGuo behandeling wordt gebruikt om thymuskwabben voor te bereiden.
- Het begrijpen van T-celdifferentiatie is cruciaal voor immunologisch onderzoek.
Doel van het onderzoek
- Om geregenereerde thymus organ culturen af te leiden.
- Om T-celdifferentiatieprocessen te onderzoeken.
- Om cellulaire interacties in een gecontroleerde omgeving te verkennen.
Gebruikte methoden
- Isolatie en behandeling van embryonale thymuskwabben.
- Disaggregatie om stromaceelvoorbereidingen te produceren.
- Aggregatie van cellen om geregenereerde culturen te vormen.
- Incubatie en observatie van cultuurontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- Geregenereerde culturen vormen intacte structuren binnen 18 uur.
- CD4 positieve en CD8 positieve T-cel subsets worden gegenereerd.
- De methode maakt het mogelijk om positieve en negatieve selectie te bestuderen.
- Gebruik van TCR transgene fibrocyten voor verdere onderzoekingen.
Conclusies
- Het protocol toont effectief T-celdifferentiatie.
- Geregenereerde culturen bieden een waardevol hulpmiddel voor immunologische studies.
- Verder onderzoek kan deze methode gebruiken voor verschillende T-cel selectie studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Reaggregate thymus cultures enable precise dissection of stromal-hematopoietic interactions critical for T-cell lineage commitment and selection. This three-dimensional in vitro system supports mechanistic de-risking at the target validation stage by allowing controlled manipulation of cellular composition and microenvironment. The approach enhances predictive confidence for immunology-focused discovery portfolios by modeling key aspects of thymic selection and self/non-self discrimination.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of stromal compartment roles in T-cell development and selection.
- Enables functional validation of candidate targets involved in thymic microenvironment signaling.
- Supports mechanistic de-risking by isolating effects of specific cell types or genetic backgrounds.
- Provides a platform for hypothesis-driven manipulation of thymic selection processes.
Screening & Assay Development
- Generates reproducible three-dimensional cultures for standardized functional assays.
- Allows quantitative assessment of T-cell subset differentiation under defined conditions.
- Supports assay development for evaluating modulators of thymic selection or stromal function.
- Enables scalable preparation of organotypic cultures for downstream screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Models disease-relevant thymic microenvironments for translational biomarker exploration.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of immune-modulating interventions.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by clarifying mechanisms of T-cell selection.
- Supports alignment of in vitro findings with in vivo immune development processes.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling controlled, quantitative studies of thymic selection mechanisms in a physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stromal-hematopoietic interactions and pathway elucidation.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible organotypic cultures for functional evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative readouts of T-cell subset generation and selection outcomes.
- Translational Research: Aligns in vitro findings with disease-relevant immune development and biomarker identification.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse genetic backgrounds and experimental variables.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes three-dimensional culture preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying functional roles of thymic compartments.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immune-modulating candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryonic tissue handling and three-dimensional culture techniques.
- Needs access to cell separation, counting, and organ culture infrastructure.
- Demands cross-team standardization of cell ratios and culture conditions for reproducibility.
- Adaptable to various genetic models, including transgenic or MHC-deficient backgrounds.
- Limited by the scalability of primary tissue sourcing and manual aggregation steps.
