Reaggregate Thymus Culturen

Hoi, ik ben Andrea White en ik kom van het lab van Graham Anderson en Eric Jenkinson bij het MRC Center for Immune Regulation aan de University of Birmingham. Vandaag presenteer ik een protocol voor het verkrijgen van re-geaggregeerde thymische organculturen, die gebruikt kunnen worden om complexe cellulaire interacties te bestuderen die plaatsvinden tijdens de differentiatie van T-cellen. Voorafgaand aan deze procedure werden embryonale thymuskwabben geïsoleerd en behandeld om alle lymfocyten te verwijderen.

Dit is te zien in een aparte video. De alienoïde lobben worden vervolgens gedisaggregeerd om een stromale celpreparaat te verkrijgen. Ten slotte worden de cellen weer geaggregeerd om een re-aggregaat fmic orgaankweek te vormen.

Laten we beginnen. Na vijf tot zeven dagen in cultuur zouden de LO's klaar moeten zijn om te worden gedisaggregeerd voor shoal-celpreparaties; dompel de 0,8 micrometer filters onder in een Petrischaal met RPMI 1640 plus 10% FCS. Gebruik een pincet om voorzichtig alle vezels weg te duwen die niet spontaneously lossnijden. Gebruik een pipet van 1 ml om de lobben over te brengen naar een Eppendorf-buisje van 1,5 ml.

Wij raden aan om niet meer dan 50 lobuwen per Eppendorf-buis te gebruiken. Laat de lobuwen onder normale zwaartekracht naar de bodem van de buis zakken en verwijder het medium. Was de lobuwen met 1 mL PBS en laat de lobuwen vervolgens opnieuw naar de bodem zakken.

Herhaal dit voor in totaal drie PBS-wasbeurten, verwijder de laatste PBS-wasbeurt en voeg 600 µL van een 0,25% trypsin-oplossing toe. Plaats de Eppendorf-buis gedurende 25 minuten in een incubator op 37 °C. Tritureer de lobben voorzichtig gedurende 10 seconden met een 1 mL blauwe tip op een pipet, en plaats ze vervolgens terug in de incubator; pipetteer de lobben na 20 minuten op en neer om ze volledig te desaggregeren.

Om een enkelcellige suspensie te verkrijgen, voegt u 400 µL ijskoud RPMI 1640 plus 10% FCS toe om de trypsine te neutraliseren. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende 10 minuten bij 4 °C, verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet indien gewenst in 1 mL RPMI 1640 plus 10% FCS. Tel de cellen.

Normaal gesproken zouden we ongeveer 50 000 cellen per dioxazine-lobe verwachten, uitgaande van een E 15 foetus. We zijn nu klaar om het aggregaat van fmic Corgan-culturen te vormen in een 1,5 ml Eppendorf-buis. Meng de vers bereide fijnmazige stromale cellen.

Samen met vooraf geselecteerde CD4-positieve CD8-positieve fibrocyten. Wij raden een verhouding van ongeveer één-op-één tussen stromale cellen en fibrocyten aan. Het aantal cellen dat u gebruikt, is afhankelijk van het aantal beschikbare cellen en de uit te voeren experimenten.

Wij raden aan om in totaal ten minste honderdduizend cellen en maximaal 1,5 miljoen cellen te gebruiken. De V-aggregaten moeten groot genoeg zijn om reproduceerbaar te zijn, maar niet zo groot dat het centrum zal afsterven. Pelleteer de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende 10 minuten bij 4 °C en assembleer vervolgens zorgvuldig het filter voor de organcultuur.

Verwijder alle supernatant in deze fase met een P 200 pipet. Vortex de celpellet 10 seconden lang om een suspensie te vormen. Het volume moet ongeveer één tot twee microliter bedragen.

Pipetteer het slib in een fijnmazige pipetteerpipet, waarbij de celsuspensie in de punt van de pipet blijft. Pipetteer het celslib onder onze dissectiemicroscoop voorzichtig op het midden van een 0,8 micrometer filter. Idealiter moeten de cellen als een staande druppel in een cirkel met een diameter van één tot twee millimeter worden geplaatst.

Als de slurry begint uit te vloeien, laat het vocht in de slurry dan door de pos weglopen voordat de resterende cellen worden gedeponeerd. Plaats de schaal in een plastic sandwichdoos en sluit deze af. Voor thymus-organcultures wordt een doos in een incubator geplaatst; geaggregeerde culturen vormen binnen 18 uur van cultuur intacte structuren.

Na vier tot vijf dagen cultuur zullen ze zowel CD4-positieve CD8-negatieve als CD4-negatieve CD8-positieve rijpe T-cel-subsets genereren. Het starten met 50 met dioxazine behandelde lobben zou voldoende stromale cellen moeten opleveren om drie tot vijf reaggregaatculturen voor te bereiden. Deze culturen verschijnen doorgaans als coherente hoopjes cellen die met een pincet van de filters kunnen worden geduwd zonder ze te beschadigen.

We hebben zojuist de methode beschreven om positieve selectie door F-epitheelcellen te bestuderen. Deze methode kan ook worden gebruikt om dendritische cel-gemedieerde negatieve selectie te bestuderen. Ten slotte kan dit worden gedaan door gebruik te maken van TCR-transgene FIBROCYTEN of MHC-klasse I-deficiënte of MHC-klasse II-deficiënte stromale cellen.

Dit systeem maakt afzonderlijke onderzoeken mogelijk naar de selectie van CD4-positieve of CD8-positieve T-cellen. Bedankt voor het kijken.