Name: Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-08-28T19:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Leer de voorbereiding van 2-dGuo-behandelde thymusorgaankweken voor immunologisch onderzoek. Deze methode maakt het mogelijk om T-celontwikkeling en lymfoïde celinteracties in vitro te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ga naar <a href="http://www.springerprotocols.com/">Springer Protocols</a> voor meer informatie over de voorbereiding van de ex vivo thymus orgaan culturen.

De auteurs hebben niets te melden.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error. The abstract was corrected to:
In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).
from 
In the thymus, immature CD4+8+ thymocytes expressing randomly rearranged T-cell receptor &alpha;- and b-chain genes undergo positive and negative selection events based on their ability to recognize self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by thymic stromal cells. In vivo analysis of the role of thymic stromal cells during intrathymic selection is made difficult by the cellular complexity of the thymic microenvironment in the steady-state adult thymus, and by the lack of appropriate targeting strategies to manipulate gene expression in particular thymic stromal compartments. We have shown that the thymic microenvironment can be readily manipulated in vitro through the use of reaggregate thymus organ cultures, which allow the preparation of three-dimensional thymus lobes from defined stromal and lymphoid cells. Although other in vitro systems support some aspects of T-cell development, reaggregate thymus organ culture remains the only in vitro system able to support efficient MHC class I and II-mediated thymocyte selection events, and so can be used as an effective tool to study the cellular and molecular regulation of positive and negative selection in the thymus.

A correction was made to: <a href="http://www.jove.com/video/906/">Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures</a>. A revised abstract was republished due to a publisher error.

Erratum: Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

bereiding van 2-dguo behandelde thymus organ culturen

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In de thymus, onvolwassen CD4 +8 + thymocyten uiten willekeurig herschikte T-cel-receptor α-en b-keten genen ondergaan positieve en negatieve selectie gebeurtenissen op basis van hun vermogen om self-peptide/major histocompatibility complex (MHC) moleculen uitgedrukt door de thymus te herkennen stromale cellen. In vivo analyse van de rol van de thymus stromale cellen tijdens intrathymic selectie wordt bemoeilijkt door de cellulaire complexiteit van de thymus micro-omgeving in de steady-state voor volwassenen thymus, en door het ontbreken van passende richten op strategieën om de genexpressie in het bijzonder thymus stromale compartimenten te manipuleren. We hebben aangetoond dat de thymus micro-omgeving kan gemakkelijk worden gemanipuleerd in vitro door het gebruik van reaggregate thymus orgaan culturen, die de voorbereiding van de drie-dimensionale thymus lobben van toegezegd stromale en lymfoïde cellen mogelijk te maken. Hoewel de andere in-vitro-systemen ondersteunen een aantal aspecten van de T-cel ontwikkeling, reaggregate thymus orgelcultuur blijft de enige in vitro systeem in staat om een ​​efficiënte ondersteuning van MHC klasse I en II-gemedieerde thymocyt selectie van evenementen, en kunnen dus gebruikt worden als een effectief instrument om te studeren de cellulaire en moleculaire regulatie van positieve en negatieve selectie in de thymus.

Deze video toont de dissectie en verwijdering van de foetale thymus en de voorbereiding van de ex vivo kweken van 2-dGuo behandeld thymus.

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

In de thymus is bekend dat interacties tussen ontwikkelende T-celprecursoren en stromale cellen, waaronder corticale en medullaire epitheelcellen, een rol spelen bij ...

Hoi, ik ben Will Jenkinson van de groep van Graham Anderson en Eric Jenkinson bij het MRC Center for Immune Regulation aan de Universiteit van Birmingham. Vandaag laat ik u een techniek zien voor het opzetten van foetale thymuskleierorganocultures. Daarnaast laat ik u zien hoe u deze organocultures kunt behandelen met twee dioxazine.En dit is een stof die selectief toxisch is voor lymfoïde cellen in de organkweek. Er zijn verschillende toepassingen van deze techniek in het laboratorium. Een van deze toepassingen is de productie van re-aggregaat organkweken.Andere toepassingen omvatten de studie naar de verschillende stadia van celontwikkeling en door gebruik te maken van foetale thymuskleierculturen kunnen we reagentia toevoegen die verschillende pathways remmen of stimuleren, wat betekent dat we de rol van specifieke moleculen in dit proces kunnen bestuderen. Laten we beginnen. De eerste stap bij het voorbereiden van thymuskleierculturen is het oogsten van muisembryo's van dag 14 of 15 van één tot twee drachtige moeders.Besproei eerst de geëuthanaseerde muis met 70% ethanol. Gebruik vervolgens een pincet om de vacht op te tillen en maak met een schaar een V-vormige incisie in de buikregio, beginnend bij de blaas en doorlopend langs de twee laterale hoorns van de uterus. Verwijder de uterushoorn en plaats deze in een steriele Petrischaal van 10 centimeter.Snijd langs de lengte van de baarmoederwand en verwijder de embryo's die zich nog in hun vruchtzakken bevinden. Was deze in een Petrischaal met 10 ml PBS met behulp van twee paren fijne pincetten. Scheur de vruchtzak voorzichtig open en bevrijd het embryo uit de zak en de placenta.Breng de embryo's vervolgens over naar een schone petrischaal met 10 ml van een 50:50 mengsel van PBS met RPMI 1640. Medium met 10% FCS onder een dissectiemicroscoop waarbij het embryo in het medium is ondergedompeld, decapiteer het embryo met een pincet. Open het voorvlak van de borstwand door de punten van een gesloten pincet in de borstholte te plaatsen en open het pincet om de interne borstholte bloot te leggen.Verwijder de volledige thoracale boom, het hart, de longen, de trachea en de thymus door voorzichtig onder het hart vast te pakken en plaats deze in een schaal van 35 millimeter met 5 ml RPMI 1640 plus 10% FCS van een embryo van 14 tot 15 dagen. De rudimentaire thymuslobben bevinden zich net boven het hart aan weerszijden van de trachea.Verwijder de afzonderlijke thymuslobben met een fijne pincet en verwijder ook overtollig bindweefsel en eventueel aanhechtend bloed voordat u overgaat tot orgaankweek. Nu zijn we klaar voor de orgaankweek. Om een lymfoïde detox te maken, neemt u een voorraadoplossing van 9 mM Thor van twee dioxazine en brengt u 600 µL aan in een bacteriële plastic Petrischaal van 90 mm.Voeg vier ml voorverwarmd DMEM-medium toe en draai de schaal zodat het gehele oppervlak met het medium is bedekt. Uiteraard. Als u lymfoïde culturen wilt maken om de T-celontwikkeling te bestuderen, verwijdert u de twee dioxazines met een pincet. Plaats twee steriele art-wraps, sponzen, voorgesneden op één vierkante centimeter, in de schaal.Laat het medium ongeveer 30 seconden in de spons trekken. Draai de spons vervolgens om om beide zijden te bevochtigen. Gebruik opnieuw een pincet om ervoor te zorgen dat het medium in de schaal het weefsel kan bereiken.Plaats een vooraf gesteriliseerd filter van 0,8 micron op het oppervlak van elke spons. De filters worden met de glanzende kant naar boven op de sponsondersteuningen geplaatst om de thymuslobben naar het orgcultuurfilter over te brengen; wij maken gebruik van een glazen controlepipet om glazen pipetten te vervaardigen. Verhit de glazen buis boven de vlam van een bunsenbrander en wanneer het glas kneedbaar is, haal het glas uit de vlam en trek aan beide uiteinden om het glas uit te rekken tot maximaal 10 centimeter, waarna het glas kan afkoelen.Trek vervolgens aan beide uiteinden om het glas te breken. Hierdoor ontstaan twee taps toelopende glazen pipetpunten. Het dunne gedeelte van elk is ongeveer vijf centimeter lang met een tip van ongeveer 0,5 millimeter in diameter.Om het pipetapparaat klaar te maken, plaatst u een plastic pipetpunt aan het andere uiteinde als mondstuk en steekt u het stompe uiteinde van een glazen pipet in de slang. Pak voorzichtig individuele thymuslobben op met de mondpipet en plaats deze op het oppervlak van het 0,8 micron filter. Voor organenkweek raden wij aan om vijf tot zes thymuslobben op elk filter te plaatsen, voor een totaal van 10 tot 12 thymuslobben per schaal.Dit biedt voldoende ruimte voor de groei van de organkweken en stelt de twee dioxazines in staat om alle endogene lymfoïde cellen te elimineren. Zodra de kweken zijn opgezet, wordt een sandwichbox-deksel geassembleerd met het deksel van een Petri-schaal van 10 centimeter als platform en dubbel gedestilleerd water net onder het niveau van het platform. Plaats maximaal drie schalen in de box en sluit het deksel op de box af met tape.In het deksel moeten twee luchtgaten van vijf millimeter in tegenovergestelde hoeken zijn geboord. Plaats de bakjes gedurende vijf tot zeven dagen in een incubator van 37 °C met 10% CO2, waarna we deze culturen disaggregeren en vervolgens opnieuw aggregeren om stromale thymische locatie-interacties te bestuderen in een gecontroleerde driedimensionale omgeving. Na een kweekperiode, doorgaans vijf tot zeven dagen, worden de F-talks geoogst door de filters in medium onder te dompelen en de lobben voorzichtig met een pincet los te duwen; u kunt zien dat lymfoïde f-tos doorgaans kleiner en cystisch zijn in vergelijking met niet-dioxazine-behandelde lymfoïde lobben.Ik heb u zojuist de techniek getoond voor het opzetten van foetale thymische organkleuren. In dit protocol hebben we laten zien hoe de foetale thymische organkleuren worden behandeld met twee dioxazine, wat alle lymfoïde cellen uitput, gewoonlijk na vijf tot zeven dagen kweek van de thymus. We gebruiken deze organkleuren om re-aggregatie-organkleuren te produceren.Dit is echter niet de enige techniek. We gebruiken ook foetale thymische organkweken die niet met dioxazine zijn behandeld om deze onder het nierkapsel van thymische muizen te transplanteren. Daarnaast maken we gebruik van lymfoïde foetale thymische organkweken om de T-celontwikkeling in vitro onder gecontroleerde omstandigheden te bestuderen, vrij van eventuele secundaire effecten die in vivo kunnen optreden.Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

preparation-of-2-dguo-treated-thymus-organ-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video de bereiding van 2-dGuo behandelde reaggregate thymus culturen is aangetoond.

Reaggregate Thymus Culturen

We hebben nieuwe laboratorium instrumenten en protocollen voor intravitale imaging verkrijging van thymus. Onze techniek zou moeten helpen bij de identificatie van 'niches' in de thymus, waar T-cel ontwikkeling optreedt.

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

This video demonstrates a protocol for generating functional antigen-specific T cells from iPSC-derived immature T cells using a three-dimensional thymic culture system. Co-culturing the iPSC-derived immature T cells with endogenous lymphocyte-depleted mice fetal thymic lobes resulted in successful maturation of the T cells to form CD8αβ+ MHC class I+ iPSC-derived thymic emigrants (iTEs).

Three-Dimensional Thymic Culture System to Generate iPSC-Derived Thymic Emigrants

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

Het bestuderen van medullaire thymische epitheelcellen in vitro is grotendeels onsuccesvol geweest, omdat huidige 2D-kweeksystemen het in vivo scenario niet nabootsen. Het 3D-kweeksysteem dat hierin wordt beschreven - een gemodificeerd organotypisch model voor huidcultuur - heeft zich superieur getoond in het nadoen van mTEC-proliferatie, differentiatie en het behoud van promiscue genregulatie.

3D Organotypische Co-cultuur Model Supporting Medullary Thymic epitheelcelproliferatie, Differentiatie en Promiscuous Gene Expression

We beschrijven de bereiding van thymus segmenten die in combinatie met flowcytometrie, kan worden gebruikt om positieve en negatieve selectie van T-cellen ontwikkelen modelleren. Thymus segmenten kunnen ook worden aangepast voor de in situ analyse van thymocyten migratie, lokalisatie en signalering via immunofluorescentie en twee-foton microscopie.

Voorbereiding en Toepassingen van organotypische thymus Slice Culturen

Dit artikel beschrijft een nieuwe methode voor het genereren van tumor antigeen-specifieke geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige Thymus emigants (iTE) door een driedimensionaal (3D) Thymus cultuur systeem. iET zijn een homogene deelverzameling van T-cellen die nauw verwant zijn aan naïeve T-cellen met de capaciteit voor proliferatie, Geheugenvorming en tumor onderdrukking.

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

Wij bieden een eenvoudige en efficiënte methode voor het transplantatie van 2 '-deoxyguanosine behandeld E 18.5 Thymus in de niercapsule van een naakt muis. Deze methode moet worden assistent in de studie van zowel Thymus epitheliale cellen functie en T-cellen rijping.

Renale Subcapsulaire transplantatie van 2 '-Deoxyguanosine-behandelde Muriene embryonale Thymus in naakt muizen

Hier beschrijven we een protocol voor de vorming van humane iPSC-afgeleide thymusorganoïden gekweekt in 3D-fibrinehydrogels met als doel de rijping van thymusepitheelcellen (TEC) en langdurig onderhoud te ondersteunen, evenals thymopoëse in vitro.

Vorming van menselijke thymusorganoïden in driedimensionale fibrinehydrogels

Leer de voorbereiding van 2-dGuo-behandelde thymusorgaankweken voor immunologisch onderzoek. Deze methode maakt het mogelijk om T-celontwikkeling en lymfoïde celinteracties in vitro te bestuderen.

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

Meer video's verkennen