Name: Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Leer patch clamp-opname van ionkanalen uitgedrukt in Xenopus laevis eicellen. Deze methode omvat het verwijderen van de vitelline membraan en het vormen van een gigaohm-seal voor elektrofysiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Krimpen oplossing recept komt uit het lab van RW Aldrich. Wij bedanken de volgende financierende instanties en stichtingen voor ondersteuning: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, spierdystrofie Vereniging, de Donald B. en Delia E. Baxter Foundation, het Fonds en de Klingenstein McKnight Endowment for Neuroscience.

Deel 1: Het verwijderen van de vitelline membraan <ol><li> Bereid twee sets van de tang. Wij geven de voorkeur nr. 5 tang, waar een set enigszins is aangescherpt met een vijl. Ook voorbereiden van een glas transferpipet door trimmen en brand-polishing een 7 &quot;Pasteur pipet. </li><li> Aanbevolen: Om te voorkomen dat de eicellen uit te glijden, snijd een cirkel van rooster (1 mm vierkantjes) en lijm in de bodem van een 60 mm petrischaal. Dit gerecht kan onbeperkt worden hergebruikt als u ze schoonmaken tussen toepassingen. </li><li> Halverwege Vul de petrischaal met hyperosmotische oplossing (zie recept) en plaats onder een dissectie microscoop. </li><li> Verwijder 1-3 Xenopus oöcyten uit hun incubatie-oplossing met een gepolijste Pasteur pipet en plaats in de schaal. </li><li> Wacht 15s - 2 min voor de cellen om te beginnen te krimpen. Langere tijden maken cellen gemakkelijker te pellen; kortere leiden tot een gezondere cellen voor het patchen. </li><li> Als de cel krimpt, zal de vitelline membraan begint te worden nauwelijks zichtbaar als een transparante laag over de cel. Selecteer een gezonde cel (zonder kransen of defecten) voor het schillen. </li><li> Met een pincet voorzichtig pakt u de vitelline membraan zonder beschadiging van de plasmamembraan. Met de andere, pak de buurt van de dezelfde plek en voorzichtig uit elkaar scheuren de duidelijke membraan en vrij van de cel. </li><li> Met het Pasteur pipet voorzichtig verplaatst de cel om de opname kamer. Merk op dat de cel zal fragiele na vitelline verwijdering. </li></ol> Deel 2: Gigaseal generatie <ol><li> Vul een opname pipet met een zoutoplossing. Gebruik het minimale volume van de oplossing die een goed elektrisch contact maakt met de draad om pipet capaciteit te minimaliseren. </li><li> Flick de pipet enkele malen te laten bellen om te drijven en schuif op de elektrode draad. Oefen druk uit op de gevulde pipet. Dit kan gedaan worden via de mond of met een aquarium pomp uit een dierenwinkel. Deze druk is van cruciaal belang om de pipet reinigt als het kruist de vloeistof-interface en verhuist naar de cel. </li><li> Zoek de eicel in de kamer en de focus sterk op de rand van de cel. </li><li> Met het pipet uit het bad, in het midden van de (van de focus) tip boven de cel. Dit minimaliseert de tijd doorgebracht in het bad voor de afdichting generatie. </li><li> Laat de pipet naar beneden in scherp naast de cel. Breng het in de nabijheid (~ 50 micron). Ziet u een kleine verdraaiing van de oplossing naar buiten geduwd van de pipet door de tegendruk. </li><li> Met behulp van de patch clamp software, controleer dan de weerstand van de pipet (ons doel is ongeveer 3-4 MΩ) en nul het huidige gebruik van compensatie van de spanning. </li><li> Met een positieve druk op de pipet, langzaam de tip naar de cel, terwijl het toezicht op de weerstand visueel of met behulp van een audio-monitor die een toon waarvan de frequentie is evenredig met de weerstand genereert. Als de tip begint te raken de cel, zal weerstand te verhogen. </li><li> Plotseling maar voorzichtig overschakelen van positief naar negatief druk van ongeveer dezelfde absolute waarde. Weerstand moet verhogen tot de vorming verzegelen. </li><li> Het merendeel van de tijd, sluit de vorming plaatsvindt binnen enkele seconden, zo nu en dan 30-60 seconden nodig. </li><li> Zodra de weerstand op 1GΩ, kan de druk worden vrijgegeven naar neutraal. Je hebt nu een on-cell patch. Voor een inside-out patch, weg te trekken uit de cel snel. Voor buiten-out, zie hieronder. </li></ol> Deel 5: Buiten-out topologie (optioneel) <ol><li> Onmiddellijk na het behalen van een gigaseal, scheuren het membraan. Dit kan gedaan worden met scherpe zuigen, maar wij de voorkeur aan een een V-puls voor 1 ms. De weerstand moet dalen tot iets meer dan de aanvankelijke weerstand pipet. </li><li> Beweeg de pipet uit de buurt van de cel langzaam en gelijkmatig. Ziet u een deel van de cel te trekken met de pipet. Plotseling, en binnen een paar seconden, zal de cel terug snap en de weerstand moet onmiddellijk en tegelijkertijd terug te keren naar GΩs. </li><li> Je hebt nu een patch in de buitenwereld-out configuratie. De ectodomains van een eventueel opgenomen ionkanalen wordt blootgesteld aan het bad. </li></ol> Deel 6: de verwachte resultaten In het algemeen hogere weerstand afdichtingen zijn voorkeur en langer leefden. 10 GΩ is een goede richtlijn voor hoogwaardige afdichtingen. In onze ervaring, is de kans op het krijgen van zegels van deze kwaliteit variëren met vele factoren, in het bijzonder cel en pipet kwaliteit. Patch acquisitie tarieven kunnen meer dan 95% met gezonde cellen, schoon pipetten, en een ervaren onderzoeker. Deze patches kan duren voor vele minuten en zijn geschikt voor elke elektrofysiologische studie van ionenkanalen, uitgedrukt in Xenopus oöcyten, waaronder single-channel opnamen.

<ol><li>Neher, E., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+currents+recorded+from+membrane+of+denervated+frog+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres.</a> Nature. 260, 799-802 (1976).</li>
<li>Sackmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSackmann%2C+B+%22Single-channel+Recording%22">Single-channel Recording</a>. , Plenum Press. New York. (1983).</li>
</ol>

Er zijn vele parameters van elektrofysiologische opname hier niet besproken. Rig setup, systeem beheer van vliegtuiggeluid, kanaal expressie, en het opnemen van protocollen zijn ook allemaal van cruciaal belang voor een goede experimentele resultaten. In onze ervaring zijn dit de meest kritische parameters voor het vormen van een betrouwbare zegels: hoge kwaliteit eicellen, het verwijderen van de vitelline membraan snel (aka, &#39;peeling&#39;), gebruik dan pas getrokken pipetten beschermd tegen stof, glad pipetten, toegepaste posit...

<table><tbody><tr><td>Patch-clampversterker &amp;amp; software</td><td>Instrument</td><td>HEKA Instruments</td><td>EPC-10</td><td>Of een ander soortgelijk apparaat (bijv. HEKA EPC-9 of Axopatch 200B)</td></tr><tr><td>Forceps nr. 5 (twee paren)</td><td>Gereedschap</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oöcyt-krimpoplossing</td><td>Reagens</td><td></td><td></td><td>Ingrediënt In mMN-methyl-D-glucamine 220HEPES 10MgCl2 1EGTA 10Asparginezuur 220KCl 2pH op 7.4 met N-methyl-D-glucamine</td></tr><tr><td>geweven gaas</td><td>800 um</td><td>Spectrum Labs</td><td>146481</td><td></td></tr></tbody></table>

patch clamp opname van ionenkanalen uitgedrukt in xenopus eicellen

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Sinds de ontwikkeling door Sakmann en Neher 1, 2, is de patch clamp worden opgericht als een zeer nuttige techniek voor elektrofysiologische metingen van enkele of meervoudige ion kanalen in cellen. Deze techniek kan worden toegepast op ionkanalen, zowel in hun eigen omgeving en uitgedrukt in heterologe cellen, zoals eicellen geoogst uit de klauwkikker, Xenopus laevis. We beschrijven hier de gevestigde techniek van patch clamp opnames van Xenopus oöcyten. Deze techniek wordt gebruikt om ofwel het meten van de eigenschappen van ionenkanalen uitgedrukt in populaties (macropatch) of individueel (single-channel-opname). We richten ons op technieken om de kwaliteit van de eicel voorbereiding en zegel generatie te maximaliseren. Met alle factoren geoptimaliseerd, deze techniek geeft een kans van een succesvolle afsluiting generatie meer dan 90 procent. Het proces kan verschillend worden geoptimaliseerd door iedere onderzoeker op basis van de factoren die hij of zij vindt het belangrijkste, en presenteren we de aanpak die moet leiden tot het grootste succes in onze handen.

Dit is bedoeld als een kennismaking met klem opnemen patch van Xenopus laevis oöcyten. Het omvat vitelline membraan verwijderen, de vorming van een gigaohm afdichting (gigaseal), en de optionele conversie van de patch naar buiten-out topologie.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Sinds de ontwikkeling door Sakmann en Neher 1, 2 is de patchclamp gevestigd als een uiterst nuttige techniek voor elektrofysiologisch...

Deze procedure begint met het verwijderen van het viline-membraan van Opus Cytes om succesvol de giga-ohm resistente afsluitingen te vormen die nodig zijn voor patchclamp-metingen. Zodra de on-cell patchclamp-configuratie is bereikt, kan er zuigkracht op de pipet worden uitgeoefend om elektrische toegang te krijgen tot het cytoplasma van de cel, wat bekend staat als de whole-cell patch-configuratie. De pipetpunt kan vervolgens van het plasmamembraan worden weggetrokken tot deze terugspringt, om zo een klein stukje membraan te verkrijgen waarbij de ectodomeinen van kanalen zijn blootgesteld aan de badoplossing; dit staat bekend als de outside-out patch-configuratie. Hallo, ik ben Austin Brown van het laboratorium van Dr. Miriam Goodman van de afdeling Moleculaire en Cellulaire Fysiologie aan de Stanford University.En ik ben Brandon Johnson, ook van het Goodman Lab. In een vorige video hebben we gedemonstreerd hoe u patchclamp-pipetten en scherpe elektroden voor elektrofysiologie maakt. Vandaag presenteren we een inleiding tot de patchclamp-registratie van ionkanalen tot expressie gebracht in xéno-ops.Sinds de ontwikkeling door S Sacramento en Air aan het eind van de jaren 1970 is pa

patch-clamp-recording-of-ion-channels-expressed-in-xenopus-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ionische stroom van BK kanalen wordt geregistreerd met behulp van patch-clamp technieken. BK kanalen worden uitgedrukt...

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Geoptimaliseerd transfectie strategie voor Expressie en elektrofysiologische opname van recombinant voltage-gated ion kanalen in HEK-293T cellen

We beschrijven een methode om de activiteit van K+-countertransporterende P-type ATPasen te kwantificeren door heterologe expressie van de enzymen in Xenopus oöcyten en het meten van Rb+ of Li+ opname in individuele cellen door middel van atomaire absorptie spectrofotometrie. De methode is een gevoelige en veilige alternatief voor radio-isotoop flux experimenten waardoor complexe kinetische studies worden vergemakkelijkt.

Meten kationtransport van Na, K en H, K-ATPase in<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicellen door atomaire absorptiespectrometrie: Een alternatief voor Radio-isotopen Assays

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

De opengesneden Vaseline gap benadering wordt gebruikt om lage ruis opnames van ionische en gating stromen van spanningsafhankelijke ionkanalen uitgedrukt in Xenopus oöcyten met een hoge resolutie van snelle kanaal kinetiek verkrijgen. Met kleine wijzigingen, kunnen spanningsklem fluorimetrie worden gekoppeld aan de opengesneden eicel protocol.

De<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel opengesneden Vaseline Gap voltage-clamp techniek Met fluorometrie

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Dit artikel beschrijft een versterking van conventionele Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) waar Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) worden gebruikt in plaats van maleimide kleurstoffen, om structurele herrangschikkingen in ionenkanalen te onderzoeken. De procedure omvat Xenopus oocyt DNA injectie, RNA / fUAA coinjection, en gelijktijdige stroom en fluorescentie metingen.

Spanningsklem Fluorometrie in<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyten Met Fluorescerende Onnatuurlijke Aminozuren

In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

Hier presenteren we een protocol om gap junction-eiwitten in Xenopus-eicellen tot expressie te brengen en junctionele stroom tussen twee geapofesteerde eicellen te registreren met behulp van een commerciële versterker die is ontworpen voor dubbele oöcytspanningsklemopnamen in een hoge zijstroommeetmodus.

Opname gap junction stroom van Xenopus Oocyten

Methoden voor Patch Clamp capaciteit Recordings uit de Calyx

Leer patch clamp-opname van ionkanalen uitgedrukt in Xenopus laevis eicellen. Deze methode omvat het verwijderen van de vitelline membraan en het vormen van een gigaohm-seal voor elektrofysiologisch onderzoek.

Patch Clamp Opname van ionenkanalen Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

Meer video's verkennen