Name: Voorbereiding en onderhoud van achterwortelganglia Neuronen in Gecompartimenteerde culturen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Leer hoe u dorsale wortelganglia-neuronen kweekt in gecompartimenteerde kamers met behulp van E15-rattenembryo's. Deze methode maakt axonale groei en neurotrofine-signaalonderzoek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Katharina Cosker en Stephanie Courchesne bedanken voor nuttige discussies.

Bereiding van reagentia <ol><li> Collageen coating: collageen laag p35 weefselkweek-platen en plaats in een oven bij 37 ° C gedurende 2 dagen vóór smeren de verdelers. De uiteindelijke concentratie van collageen moet op 0,71 mg / ml verdund in 0,001 N HCl. Dan, voeg 1 ml mengsel per plaat. </li><li> Grease laders: Om het vet loader te vullen, een 60ml spuit moet eerst worden gevuld met Corning vacuüm vet. Gebruik de spuit om het vet loader te vullen, wikkel in folie en vervolgens gedurende 45 minuten autoclaaf. </li><li> Teflon verdelers: de verdelers kan opnieuw worden gebruikt na elk experiment, maar moet eerst goed worden gereinigd. Verwijder de verdeler van de plaat, veeg alle resterende vet en plaats in zwavelzuur voor 2 dagen. Na het verwijderen van het zuur, spoelen met water 3X, kook gedurende 20 minuten, laten drogen, in een glazen p100 petrischaal en autoclaaf gedurende 20 minuten. </li><li> N2-methylcellulose: Weeg 1,5 g van methylcellulose en het in een 500ml fles plaats. Voeg een roerstaafje en autoclaaf gedurende 20 minuten droog (vanaf dit punt al het werk moet steriel). Voeg vervolgens 500 ml van serum vrije media (N 2), en roer in een koude kamer tot het oplost. Aliquot in 50 ml conicals en invriezen bij -20 ° C. Voor het werken voorraad, hoeveelheid een van de 50 mL conicals in 1 ml buizen en invriezen bij -20 ° C. </li><li> DRG media: DMEM, 5% door warmte geïnactiveerd paard serum, en 1% penicilline streptomycine. </li><li> 100ng/mL DRGN media: De voorraad concentratie van zowel zenuw groeifactor (NGF) en brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is 1mg/ml. Vul telkens van de neurotrofinen 1:10.000 in de DRG media. Culturen kan worden gekweekt in NGF alleen, dit verandert het complement van neuronen die overleven in de culturen. Opmerking: Indien nodig, de concentratie van (cytosinearabinoside) AraC is 1uM en gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 0.3uM. Dit zal de groei vertragen van de Schwann-cellen en andere glia. </li><li> 10ng/mL DRGN media: Verdun de 100ng/mL DRGN media (1:10) met DRG media. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_27_6/951_Figure-01.png" alt="Figuur 1" width="392" height="294" /> Figuur 1. Benodigd gereedschap voor het set-up </li></ol> Het instellen van de compartimenten kamers (start dit proces 1-2 dagen voor de dissectie) <ol><li> Maak een kras in het midden van een collageen gecoat p35 schotel met een buitenwaartse beweging. </li><li> Plaats 30ul van de N2-methylcellulose op het midden van de kras. Gereserveerd gerechten tot divider is ingevet. </li><li> Bevestig een 23-gauge luer-pin adapter om het vet te loader. Pak de Teflon verdeler met een paar van de hoek van 90 ° hemostats en leg hem plat met de verdeler naar boven onder een microscoop. Trace van de verdeler met vet ervoor te zorgen dat elke keer dat de adapter is geplaatst op een nieuw startpunt van de adapter is aangesloten op het vet uit de vorige stap, zodat er een ononderbroken lijn van vet (zie diagram). Zodra het vet is toegepast op de gehele verdeler, draai een van de bereide gerechten p35 ondersteboven en plaats deze, zodat de N2-methylcellulose is over het midden compartiment. Druk op de bodem van de schotel met een pincet. Zorg ervoor dat u aan de binnenkant van de verdeler pers in vier hoeken (linksboven, rechtsonder, rechtsboven, linksonder, aangegeven in diagram met &quot;X&quot;). <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_2/951_Figure-02.png" alt="Figuur 2" width="171" height="183" /> Figuur 2: Stappen om het smeren van de verdeler Opmerking: Het is belangrijk om stevig genoeg drukt, zodat het vet een volledige afdichting met de schotel maakt, maar als er teveel druk wordt toegevoegd, de axonen niet kruisen in de zijvakken. Pak de hemostats, draai hem om en ontspan de verdeler. Ten slotte, plaats de schaal met de verdeler stevig onder de microscoop zich richt op de onderkant van de middelste compartiment. Met het vet loader, dus zorg een kleine barrière (0,25 cm) dat wanneer de cellen zijn geplaatst in het middelste compartiment ze niet kunnen lekken. </li><li> Na het opzetten verschillende culturen, plaats DRG media in elk van de zijvakken en plaats het in een incubator waarin de cellen zullen worden gehandhaafd. Laat de culturen om te zitten voor een paar uur en daarna op lekkage te controleren. Als de media heeft gelekt in het middelste compartiment, dan is de cultuur is onbruikbaar. Opmerking: Bij het ​​eerste deze techniek te leren, is het belangrijk om het opzetten van meer culturen dan nodig zijn voor een experiment, zoals meerdere zal worden lek. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_3/951_Figure-03.png" alt="Figuur 3" width="254" height="191" /> Figuur 3: &quot;Good vs lek &#39;cultuur </li></ol> Behoud van DRG neuronen in compartimenten culturen <ol><li> Dag 1: Vervang DRG media in de zijvakken met 100ng/mL DRGN media + AraC. Voer dissectie en voeg cellen tot het centrum compartiment (100.000 cellen). </li><li> Dag 2: Voeg 10ng/mL media + AraC aan de buitenkant van de Teflon verdeler tot de media stroomt over het vet barrière en uitwisselingen vloeistof met het midden compartiment. </li><li> Dag 3: Vervang media in de zijvakken te 100ng/mL DRGN weglating van de AraC en de surround met 10ng/mL DRGN het weglaten van het AraC. </li><li> Dag 6: Vervang media in de zijvakken te 1ng/mL + AraC en de surround met DRG media + AraC. </li><li> Dag 9: Gebruik voor experimenten. <img src="/files/ftp_upload/old/951_2008_10_9_5/951_Figure-04.png" alt="Figuur 4" width="267" height="148" /> Figuur 4: IHC beelden van cellichamen en distale axonen Opmerking: Bij het wijzigen van de media, is het belangrijk om de vloeistof te zuigen uit de top van de beide zijden compartiment. Ook nooit veranderen de media uit de middelste compartiment zelf, alleen van de surround, en laat het stromen over het vet barrière naar het centrum. </li></ol>

<ol><li>Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+of+the+Local+Environment+of+Somas+and+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Independent Control of the Local Environment of Somas and Neurites.</a> Methods in Enzymology. 58, 302-307 (1979).</li>
<li>Watson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+use+the+Erk5+pathway+to+mediate+a+retrograde+survival+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins use the Erk5 pathway to mediate a retrograde survival response.</a> Nature Neuroscience. 4, 981-988 (2001).</li>
<li>Heerssen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+motors+transport+activated+Trks+to+promote+survival+of+target-dependent+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dynein motors transport activated Trks to promote survival of target-dependent neurons.</a> Nature Neuroscience. 7, 596-603 (2004).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury%2C+regeneration+and+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature Methods. 2, 599-605 (2006).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nat Protoc. 4, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Ure, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J Neuroscience. 4, 1282-1290 (1997).</li>
</ol>

In deze video, hebben we aangetoond hoe voor te bereiden en gecompartimenteerd kamers te behouden voor het gebruik in het kweken van DRG neuronen. Goed uitgevoerd, dit systeem kan de scheiding van de cel lichaam van de axon om de mechanismen die neurotrofinen signaal over lange axonen te bestuderen. Omdat er vloeibare isolatie tussen de compartimenten, het zorgt voor selectieve stimulatie of behandeling van een compartiment zonder dat de andere compartimenten wordt aangetast. Gecompartimenteerd kamer culturen kunnen ondersteunen andere soor...

<table><tbody><tr><td>collageen</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>N2-methylcellulose 400CPS</td><td>Reagens</td><td>Sel-Win Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teflon-scheider</td><td>Overig</td><td>Tyler Research</td><td>CAMP10</td><td>er zijn veel andere soorten scheiders beschikbaar</td></tr><tr><td>Pin rake</td><td>Gereedschap</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-PR</td><td></td></tr><tr><td>Vetlader</td><td>Gereedschap</td><td>Tyler Research</td><td>Camp-GLSS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagens</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-01</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Reagens</td><td>PeproTech Inc</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Hoogvacuümvet</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>AraC</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1768</td><td></td></tr><tr><td>Luer-stub adapter 23 gauge</td><td>Gereedschap</td><td>Fisher Scientific</td><td>427565</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatische klemmen met hoek van 90&amp;#x00B0;</td><td>Gereedschap</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-7035</td><td></td></tr></tbody></table>

voorbereiding en onderhoud van achterwortelganglia neuronen in gecompartimenteerde culturen

Preparation and Maintenance of Dorsal Root Ganglia Neurons in Compartmented Cultures

Neuronen verlengen axonale processen die ver verwijderd zijn van het cellichaam te richten weefsels, waar de target-derived growth factoren die nodig zijn voor neuronale overleving en functie innerveren. Neurotrofinen zijn specifiek nodig zijn om de overleving en differentiatie van sensorische neuronen innerveren handhaven, maar de vraag hoe deze doelgroep afgeleide neurotrofinen mee aan het cellichaam van de neuronen innerveren is een fase van actief onderzoek meer dan 30 jaar. De meest geaccepteerde model van hoe neurotrofine signalen bereiken het cellichaam stelt voor dat de signalering endosomen retrogradely voeren dit signaal langs de axon. Om de retrograde transport studie werd een cultuur dat oorspronkelijk ontwikkeld door Robert Campenot, in welke cel lichamen zijn geïsoleerd van hun axonen. De techniek van het voorbereiden van deze gecompartimenteerd kamers voor het kweken van sensorische neuronen recapituleert de selectieve stimulatie van de zenuwuiteinden die zich voordoet in vivo volgende release van target-afgeleide neurotrofinen. Retrograde signalering gebeurtenissen die lange afstand microtubule afhankelijk retrograad transport nodig hebben belangrijke implicaties voor de behandeling van neurodegeneratieve aandoeningen.

Hier beschrijven we de techniek van het opstellen en onderhouden van gecompartimenteerd kamers voor het kweken van sensorische neuronen van de achterwortelganglia.

Voorbereiding en onderhoud van achterwortelganglia Neuronen in Gecompartimenteerde culturen

Neuronen strekken axonale uitlopers uit die ver verwijderd zijn van het cellichaam om doelweefsels te innerveren, waarbij groeifactoren afkomstig uit het doelweefsel vereist zijn voor ...

Deze procedure begint met het maken van een kras met een pinrake in het centrum van een collageen-gecoate plaat, en het pipetteren van 30 µL Methylcellulose op het centrum van de krassen. Smeer elke scheidingswand in met een vetlader en bevestig deze aan een collageen-gecoate plaat. Plaats 100.000 cellen van E 15 rattenembryo's in het middelste compartiment.Na negen dagen zullen de cellen axonen hebben uitgestrekt in het zijcompartiment en klaar zijn voor experimenten. Hallo, ik ben Maria Murphy van het laboratorium van Dr. Rosalyn Siegel van de afdeling Pediatrische Oncologie aan het Dana-Farber Cancer Institute. Vandaag laten we u een procedure zien voor de preparatie en het onderhoud van Dosa-wortelknoppenneuronen in gecompartimenteerde culturen.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om neurotrophine-signalering te bestuderen. Laten we beginnen. Voordat de compartimentele kamers worden ingericht, moeten P 35 weefkweekplaten worden gecoat met collageen.Voer dit uit door één milliliter van een oplossing van collageen (0,71 mg/mL) in 0,001 N HCl aan de plaatjes toe te voegen en deze gedurende twee dagen bij 37 °C te incuberen. Maak na twee dagen met een pin-rake een kras

preparation-maintenance-dorsal-root-ganglia-neurons-compartmented

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

This video demonstrates constructing a three-compartment cell culture system using collagen and non-reactive grease. This system is used to observe interactions between glioma cells and axons in real-time.

Preparation of Collagen-Coated Compartmented Culture Dishes for Neuronal Cell Culture

The video demonstrates the co-culturing of dorsal root ganglion (DRG) neurons with Schwann cells. DRG neurons are first grown on a pre-stretched membrane for aligned axon growth. Schwann cells are then introduced, which attach to the axons, insulating them and promoting neural cell survival and function.

Co-Culture of Schwann Cells with DRG Neurons on a Pre-Stretched Membrane

This video demonstrates a method for harvesting neurons from the dorsal root ganglia (DRG). DRG from a rat's spinal column is isolated, treated with enzymes, and then mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The neurons are separated from glial cells using density gradient centrifugation and cultured in a growth medium.

A Technique for Harvesting and Dissociating Dorsal Root Ganglia for Neuronal Cultures

This video demonstrates the coculturing model of a dorsal root ganglion explant and Schwann cells. In coculture conditions, ascorbic acid promotes the differentiation of Schwann cells into myelinating forms. Myelinating Schwann cells wrap the axons multiple times to create a myelin sheath, which is essential for nerve function.

Co-culturing of a Dorsal Root Ganglion Explant with Schwann Cells for Neuron Myelination

This video demonstrates a technique for isolating and culturing dorsal root ganglia (DRG) cells from the rat spinal column. DRGs excised from the spinal column are treated with enzymes and mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The cells are cultured in a medium containing inhibitors and growth factors that limit glial cell proliferation and promote neuronal growth, respectively.

Establishing a Primary Dorsal Root Ganglia Cell Culture from a Rat Spinal Column

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Dorsal root ganglia (DRG) primaire culturen worden vaak gebruikt om te studeren fysiologische functies of pathologie-gerelateerde gebeurtenissen in de sensorische neuronen. Wij tonen hier, het gebruik van lumbale DRG culturen te detecteren het vrijkomen van neurotransmitters nadat neuropeptide FF receptor 2 stimulatie met een selectieve agonist.

Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Hier presenteren we een ex-vivo gemengd monolaag cultuur systeem voor de studie van Human glioom Cell (HGC) migratie in real-time. Dit model biedt de mogelijkheid om interacties tussen Hgc's en zowel myelinehoudende als niet-myelinehoudende axonen in een gecompartimenteerde kamer te observeren.

Real-time monitoring van menselijke Glioom Celmigratie op Rugwortel ganglion axon-oligodendrocyte co-culturen

Dit protocol biedt een techniek om geëxplanteerd dorsaal wortelganglion (DRG) van volwassen Sprague Dawley-ratten te oogsten en te kweken in een apparaat met meerdere compartimenten (MC).

Het oogsten, inbedden en cultiveren van dorsale wortelganglia in apparaten met meerdere compartimenten om perifere neuronale kenmerken te bestuderen

Leer hoe u dorsale wortelganglia-neuronen kweekt in gecompartimenteerde kamers met behulp van E15-rattenembryo's. Deze methode maakt axonale groei en neurotrofine-signaalonderzoek mogelijk.

Voorbereiding en onderhoud van achterwortelganglia Neuronen in Gecompartimenteerde culturen

Meer video's verkennen