Methode voor Whole Mount antilichaam kleuring in Chick
2 februari 2009
Deze video toont ganse berg immunohistochemie, een methode waarmee de ruimtelijke en temporele expressiepatroon van een antigeen kan worden gevisualiseerd in jonge kippenembryo's. Deze methode werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Jane Dodd en Tom Jessell.
Deze video demonstreert de verschillende stappen van whole mount immunohistochemie in een kippenembryo met behulp van HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen. Eerst wordt het embryo gefixeerd in paraformaldehyde. Daarna wordt de endogene peroxidaseactiviteit geneutraliseerd.
Het embryo wordt vervolgens geïncubeerd in het primaire antilichaam. Na meerdere wasbeurten wordt het embryo geïncubeerd in het secundaire antilichaam geconjugeerd aan HRP. De kleurreactie wordt zichtbaar gemaakt met DAB-substraat, waarbij de antilichaamkleuring oranje verschijnt. Het voordeel van deze methode ten opzichte van het gebruik van fluorescerende antilichamen is dat embryo's kunnen worden voorbereid voor paraffinesectionering, waardoor de studie van antigene locaties in dwarsdoorsneden mogelijk is.
Hallo, ik ben Delphine van het Laboratory of FIN aan het Center for Environmental and Genomic Medicine van Texas A&M in Houston. Vandaag laten we u een procedure zien voor het uitvoeren van hormoonmontage-antilichamen-kleuringen in kikkervisjesembryo's met behulp van HRP-geconjugeerde antilichamen. Wij gebruiken deze procedure in het laboratorium om de morfologie van embryo's te bestuderen na behandeling met antiepileptische geneesmiddelen.
Laten we beginnen met het uitvoeren van whole mount immunohistochemie op kiजembryo's. Open eerst een ei door met een pincet tegen de schaal te tikken en stukjes van de schaal te verwijderen. Verwijder het dikke albumen met een pincet en kantel de dooierzak met een grove pincet zodat het embryo naar boven is gericht.
Gebruik vervolgens een fijne schaar om een vierkant van de dooierzak rond het embryo uit te snijden. Verwijder het embryo uit de dooier met een lepel en plaats het in een schaaltje met PBS onder een dissectiemicroscoop. Verwijder voorzichtig de membranen in de dooier en breng het embryo over naar een schoon schaaltje met PBS.
Nadat het embryo is overgebracht, wordt het embryo met een pincet en insectenspeldjes vastgezet en wordt de PBS geaspireerd. Vervang dit door 4% PFA in PBS en laat het embryo één uur fixeren bij kamertemperatuur om mogelijke microbiële contaminatie te minimaliseren. Gebruik gedeïoniseerd H2O bij alle volgende stappen nadat het embryo is gefixeerd; aspireer de fixatieve oplossing en voer deze op de juiste wijze af als chemisch afval.
Vul het schaaltje met BS.Next. Snijd vervolgens met een microdissectiemes een vierkant rond het embryo om extra embryonale membranen te verwijderen. Verwijder de insectenspeldjes met een pincet nadat deze zijn losgemaakt. Gebruik een stompe transferpipet om het embryo over te brengen naar een scintillatiebuisje met PBT.
Was het embryo drie keer gedurende telkens 10 minuten met PBT. Verwijder het PBT uit het scintillatiebuisje en vervang dit door PBTX met 0,3%H 2 0 2 om potentieel endogeen peroxidase te inactiveren. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat.
Was het embryo eerst drie keer gedurende 10 minuten telkens met PBT, en vervolgens drie keer gedurende 30 minuten telkens. Om het embryo met antilichamen te kleuren, begint u met het wassen van het embryo gedurende één uur in blokkeringsbuffer of 1%BSA 1%NGS.
We gebruiken NGS omdat het secundaire antilichaam in geit is opgewekt. Incubeer één uur bij kamertemperatuur op een rotator; verdun na incubatie het primaire antilichaam één-op-één in blokkeringsbuffer en incubeer het embryo gedurende twee dagen bij vier graden Celsius in deze oplossing op een rotator.
De verdunningsfactor van het primaire antilichaam hangt af van de keuze van het primaire antilichaam. Hier gebruiken we een antilichaam uit de developmental studies hybrid DOMA-bank, dat als supernatant wordt geleverd. We verdunnen dit één-op-één in blokkeringsbuffer.
Voer vervolgens drie wasbeurten van 10 minuten uit in PBT, gevolgd door drie wasbeurten van één uur in PBT. Verdun na het wassen het secundaire antilichaam 1:2.500 in blokkeringsbuffer. In dit geval wordt peroxidase-geconjugeerde geit anti-US IgG gebruikt; incubeer het embryo hierna gedurende de nacht in deze oplossing bij 4 °C op een schudder.
Voer drie wasbeurten van 10 minuten uit in PBT, gevolgd door drie wasbeurten van één uur in PBT om de kleurreactie van het gekleurde embryo te ontwikkelen. Voer eerst twee wasbeurten van 20 minuten uit in trisbuffer (100 millimolar tris, HCL pH 7.4). Verwijder vervolgens de laatste TS-buffer-wasstap uit het flacon met het embryo en vervang deze door vijf milliliters DAB-oplossing.
Bewaar het 20 minuten in het donker op de mutator. Gooi de einor-tip weg in de emmer met een 10% bleekoplossing. Voeg 16 µL toe om DAB te contamineren.
Voeg H₂O₂ toe aan het flesje met embryo's in DAB. Bewaar dit in het donker. Controleer na 10 minuten de reactie onder de microscoop wanneer de kleurreactie voltooid is. Voeg de DAB af in een bleekemiddel-emmer en vervang deze door vijf milliliters.
Kraanwater. Voer vervolgens twee wasbeurten van 10 minuten uit in PBS ter voorbereiding op fotografie en wax-sectionering. Dehydrateer het gekleurde embryo in een ethanolreeks van 25%, 50%, 75% en 100% gedurende telkens 10 minuten.
Vervang na dehydratie de ethanol door 0,5 tot 1 milliliter cederhoutolie. Dit maakt het embryo transparant voor fotografie in cederhoutolie. Plaats het embryo na de fotografie terug in het vial en vervang de cederhoutolie door 100% ethanol.
Vervang tot slot de ethanol door 5% fast green FCF in 100% ethanol en laat dit drie minuten incuberen. Deze stap maakt de embryo's zichtbaar voor histologie. Vervang de fast green FCF-oplossing door 100% ethanol en verwerk deze voor histologie.
Hier zijn drie voorbeelden van gekleurde embryo's. Deze embryo's in stadium 11 zijn gelabeld met 15.3 B negen of niet. Eén is een node-chord-specifiek antilichaam, ontwikkeld in het laboratorium van Jane dod en Tom Gessel.
Na twee minuten in DAB is het embryo nog steeds transparant. Na 20 minuten in DAB verschijnt er een lichte kleuring in het nodale koord. Ten slotte is na 40 minuten de kleuring van het nodale koord voltooid.
In dit voorbeeld laten we zien hoe PAC seven, een antilichaam ontwikkeld in het laboratorium van Tom Jessel, vroege stadia van de sluiting van de neurale buis herkent, evenals de craniale neurale kamcellen die uit de middenhersenen voortkomen. Hier is het embryo gelabeld met de Croc 20-probe uit het laboratorium van David Wilkinson, gevolgd door een antilichaam. We hebben u zojuist laten zien hoe u whole mount immunohistochemie uitvoert op embryo's.
Deze procedure kan ook worden toegepast op embryo's die voorheen zijn verwerkt voor whole mount in situ hybridisatie. Fixeer het embryo in dat geval kort gedurende één uur na de in situ hybridisatie en ga vervolgens over tot de antilichaamkleuring. Dat is alles.
Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert whole mount immunohistochemie, een techniek die wordt gebruikt om de ruimtelijke en temporele expressiepatronen van antigenen in jonge kikelembryo's te visualiseren. De methode omvat verschillende stappen, waaronder fixatie en antibody-incubatie, om de kleuringsresultaten zichtbaar te maken.
Belangrijkste Onderdeel van de Studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Whole mount immunohistochemie maakt het mogelijk om de antigenverdeling in embryo's te bestuderen.
- Deze techniek werd oorspronkelijk geïntroduceerd door Jane Dodd en Tom Jessell.
- Het biedt inzicht in ontwikkelingsprocessen en genexpressie.
- HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen verbeteren de visualisatie van antigenen.
Doel van de studie
- Om de procedure van whole mount immunohistochemie te demonstreren.
- Om antigeenexpressie in kiजembryo's te visualiseren.
- Om de voordelen van deze methode te vergelijken met fluorescente antilichaamtechnieken.
Gebruikte methoden
- Fixatie van embryo's in paraformaldehyde.
- Quenchen van endogene peroxidaseactiviteit.
- Incubatie in primaire en secundaire antilichamen.
- Kleurreactie onthuld met behulp van DAB-substraat voor visualisatie.
Belangrijkste resultaten
- Antilichaamkleuring verschijnt oranje, wat duidt op een succesvolle antigeendetectie.
- Embryo's kunnen na de kleuring worden verwerkt voor waxsecties.
- Deze methode maakt cross-sectionele studies van antigeenlocaties mogelijk.
- Demonstreert de effectiviteit van HRP-geconjugeerde antilichamen bij kleuring.
Conclusies
- Whole mount immunohistochemie is een waardevolle techniek voor het bestuderen van kiजembryo's.
- Het maakt een heldere visualisatie van antigeenexpressiepatronen mogelijk.
- De methode is voordelig voor daaropvolgende histologische analyse.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Whole mount immunohistochemie in kiजembryo's maakt ruimtelijke mapping van antigeenexpressie mogelijk, wat de validatie van targets in de ontwikkelingsneurowetenschap ondersteunt. De methode biedt mechanische risicovermindering door moleculaire targets te koppelen aan fenotypische uitkomsten in een ziekterellevant systeem. Compatibiliteit met paradesecties stelt cross-functionele teams in staat om immunohistochemische gegevens te correleren met histologische analyse, wat de translationele continuïteit bij preklinische targetbeoordeling verbetert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking en targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de antigeenverdeling in de ontwikkelende neurale buis en somieten te visualiseren.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe observatie van target-engagement in intacte embryo's.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in het target door ruimtelijk opgeloste expressiegegevens te leveren voor de identificatie van lead-moleculen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gestandaardiseerde, reproduceerbare kleuringspatronen met behulp van HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen en DAB-substraat.
- Kwantitatieve output: Maakt semi-kwantitatieve beoordeling van antigene locaties via kleurintensiteit mogelijk, wat bijdraagt aan de optimalisatie van de assay.
- Herbruikbaarheid van het platform: Compatibel met wax-sectionering, waardoor hetzelfde gekleurde monster kan dienen voor meerdere daaropvolgende analytische workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toepasbaar bij het bestuderen van embryotoxische effecten van verbindingen, zoals antiepileptische geneesmiddelen, in een gewervde modelorganisme.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen de ontdekkingsfase en de preklinische fasen door consistente antigeen-tracking mogelijk te maken in zowel hele preparaten als in coupes.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of geobserveerde fenotypes correleren met targetmodulatie in ontwikkelende weefsels.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking naar preklinische fase en ondersteunt de vroege stadia van targetvalidatie en assayontwikkeling voorafgaand aan de lead-optimalisatie.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten door spatiotemporele antigeenexpressie in de ontwikkelende hersenen en neurale buis bloot te leggen.
- Screening: Levert gestandaardiseerde immunohistochemische resultaten die reproduceerbare evaluatie van verbindingen in embryonale systemen ondersteunen.
- Analytics: Produceert een chromogeen signaal dat detecteerbaar is via veldlichtmicroscopie, waardoor kwantitatieve beeldanalyse voor de vergelijking van condities mogelijk wordt.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door antigenelokalisatie te laten valideren in zowel whole mount- als histologische coupes.
- Enterprise Reuse: Vormt een herbruikbaar, histologisch inzetbaar platform dat toepasbaar is op meerdere projecten die zich richten op ontwikkelingstoxiciteit of targetexpressie.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door de aanwezigheid van antigenen te koppelen aan specifieke embryonale structuren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde fixatie-, blokkerings- en antilichaamincubatiestappen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door histologische bevestiging van doelwitmodulatie te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risicogebaseerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van profielen van interactie met ontwikkelingsdoelwitten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in embryo-dissectie, immunohistochemie en chromogene detectie.
- Afhankelijk van toegang tot microscopen, mutatoren en ventilatie voor het hanteren van DAB en H2O2.
- Maakt standaardisatie van antilichaamverdunning en wasprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Aanpassing aan andere soorten kan optimalisatie van de permeabiliteit en blokkeringsstappen vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten langere incubatietijden en de noodzaak voor zorgvuldige DAB-afvoer om artefacten te voorkomen.
