Een techniek voor seriële verzamelen van hersenvocht uit de Cisterna Magna in de muis

De procedure begint met het anesthetiseren van de muis en de voorbereiding van de chirurgische plek. De muis wordt vervolgens in buikligging op het stereotaxische instrument geplaatst. Er wordt een sagittale incisie in de huid gemaakt onder het occiput, waarna het subcutane weefsel en de nekspieren via de middellijn stomp worden gescheiden.

Vervolgens wordt het achterste deel van het lichaam neergelegd zodat het lichaam een hoek van 135 graden vormt met de gefixeerde kop, waarna de dura mater van de CI sternum magna met de glazen capillair wordt gepenetreerd en het CSF wordt opgevangen. Na de CSF-afname worden de spieren opnieuw uitgelijnd en de huid gehecht; ongeveer één milliliter 0,9%NACL zoutoplossing wordt subcutaan geïnjecteerd om dehydratie te voorkomen en de muis wordt warm gehouden tot hij hersteld is. Hallo, mijn naam is Liu van het lab van Dr. Karen Duff aan The Top Institute van Columbia University.

Vandaag laat ik u zien hoe u cerebrospinale vloeistof kunt afnemen via de cisterna magna van de muis. Met deze techniek kunnen we tot drie keer seriële CSF-monsters afnemen van dezelfde muis met een interval van twee tot drie maanden. In ons laboratorium gebruiken we deze techniek om de CSF A bèta- of tau-waarden te bepalen op verschillende leeftijden van onze transgene muismodellen voor de ziekte van Alzheimer, en we correleren deze waarden met die van de hersenen.

Uiteindelijk zijn we geïnteresseerd in het potentieel van CSFA beta- of tau-niveaus als mogelijke biologische markers voor de ziekteprogressie en ook voor de therapeutische proeven bij de muizen. Laten we beginnen. Voor deze procedure is het noodzakelijk om capillairen te maken met een micropipet-puller.

De hier gebruikte capillairen zijn BOA silicaatglas B 175 10 van Sutter Instruments; trek de capillairen met een Sutter P 87 vlammicro-pipetpuller waarbij de hitte-index op 300 en de druk-index op 330 is ingesteld. Het glazen capillair is vijf centimeter lang en heeft een taps toelopende punt. De punt van het capillair wordt met een schaar afgeknipt zodat de binnendiameter ongeveer 0,5 millimeter is.

De chirurgische procedure begint met het anesthetiseren van de muis met ketamine 100 mg/kg en xylazine 10 mg/kg, toegediend via een intraperitoneale injectie; houd de muis tijdens de anesthesie warm in een incubator van 37 °C. Nadat is vastgesteld dat het dier volledig is geanestheseerd middels een terugtrekreflex bij een knijptest in de teen, wordt de nek kortgeschoren, waarna de muis op het stereotaxische instrument wordt geplaatst, zoals dit exemplaar van David Kink. Plaats een rectale temperatuursonde in direct contact met het verwarmingskussen, zodat de warmte van het kussen kan worden aangepast aan de lichaamstemperatuur van de muis.

Zet de kop vast met de kopadapters, reinig de huid van de nek drie keer met 10% povidonjodium en 70% ethanol en maak een sagittale incisie inferieur aan het posterieure deel van de kop of het occiput. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop met behulp van stompe pincetten. Scheid het subcutane weefsel en de spieren M by ventor services en M rectus capita dorsalis major, zodat de dura mater van de sternum magna wordt blootgesteld. Gebruik micro-retractoren om de spieren op de juiste wijze uit elkaar te houden.

Leg ten slotte de muis neer met de kop in een hoek van 135 graden ten opzichte van het lichaam. De muis is nu klaar voor de CSF-afname. Deze techniek voor het afnemen van CSF uit de cisterna magna is eerder gepubliceerd.

C figuur één A onder de dissectiemicroscoop. De dura mater verschijnt als een glanzende en heldere omgekeerde driehoek waardoor de medulla oblongata en een groot bloedvat zichtbaar zijn. Arteria dural spinella C figuur één B. De circulatoire pulsatie van de medulla en de aangrenzende CSF-ruimte is zichtbaar.

Dep de dura mater droog met een steriel wattenstaafje, steek de capillair door de dura mater in de cisterna magna, lateraal van de arteria dorsalis spinalis. Er zal een merkbare verandering in weerstand optreden wanneer de capillair correct is ingebracht, waarna het CSF in de capillair zal stromen. Nadat het CSF is verzameld, wordt de capillair voorzichtig verwijderd en verbonden met een spuit van drie milliliter met behulp van polyethyleenslangen met een binnendiameter van één millimeter.

Injecteer het CSF in een buisje van 0,5 milliliter. Label het buisje en vries het onmiddellijk in op droogijs. Zodra het bevroren is, brengt u het CSF over naar een vriezer van min 80 graden Celsius.

De zojuist gedemonstreerde bemonsteringstechniek is uiterst behoedzaam en maakt het mogelijk om gedurende een interval van twee tot drie maanden opeenvolgende CSF-monsters van dezelfde muis af te nemen. Na de bemonstering van de nek moeten de spieren en de huid dus weer in de juiste positie worden gebracht en met hechtingen worden gesloten. Nadat de incisie is gehecht, dient er ongeveer één milliliter zoutoplossing 0,9% NACL subcutaan te worden geïnjecteerd om de muis te rehydrateren.

Houd de muis warm bij ongeveer 37 °C tot deze hersteld is. Controleer het gewicht op dag één en dag zeven na de operatie. Ik heb u zojuist laten zien hoe u cerebrospinale vloeistof uit de cisterna magna van de muis kunt afnemen.

Bij het uitvoeren van deze procedure zijn er drie belangrijke zaken om te onthouden. Ten eerste moet de kop en het lichaam van de muis correct op het stereotactische frame worden gepositioneerd, zodat de ator van de Cy Magna zo veel mogelijk kan worden blootgesteld. Ten tweede moet u voorzichtig de bloedvaten vermijden wanneer u met de capillair door de durometer dringt.

Anders raakt uw monster verontreinigd door het bloed. Ten slotte dient u ervoor te zorgen dat de muizen tijdens de gehele procedure warm worden gehouden om hypothermie te voorkomen. Hypothermie is niet alleen schadelijk voor uw muizen, maar kan uw resultaten ook aanzienlijk beïnvloeden door een beta-productie of een tall-hypofosforyleringsrelatie te induceren.

Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.