Name: Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Leer de isolatie en kweek van sympathische neuronen uit de ganglia cervicalia superior van pasgeboren ratten. Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor neurobiologisch onderzoek in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NZ wil lab leden Subhas Biswas, Andrew Sproul, en Ryan Willet bedanken voor de opleiding van haar in te ontleden en te oogsten sympathische neuronen. Ondersteund door subsidies van de NIH-NINDS.

1. Voorbereiding voor de dissectie: <ol><li> Selecteer de juiste cultuur schotel (10 cm of 6-well of 24-well platen, enz.), afhankelijk van de aard van uw experimenten, en smeer ze met een rat-tail collageen 24 uur voor dissectie. De methoden voor het bereiden van rat-tail collageen en dat te gebruiken vacht cultuur gerechten zijn elders beschreven (1). </li><li> Bereid een 0,25% trypsine oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (geen EDTA) en filter steriliseren. Voor te bereiden 1 ml porties en bewaar bij -20 º C. </li><li> Bereid een oplossing die 2,5 mM elk van Uridine en 5-FDU in gedistilleerd / gedemineraliseerd H 2 O. Filter-steriliseren en bereiden 50 ui fracties. Bewaren bij -20 º C. </li><li> Bereid Compleet Medium: RPMI 1640 kweekmedium met 10% hitte-geïnactiveerd paard serum (warmte inactiveren door incuberen in een 56 º C waterbad gedurende 30 minuten) en 5% foetaal runderserum. </li><li> Bereid Final Medium: RPMI 1640 kweekmedium met 1% hitte-geïnactiveerd serum paard + NGF (100ηg/ml uiteindelijke concentratie) + penicilline / streptomycine (1 / 250) + 1 / 250 uridine/5-FDU oplossing (10 uM eindconcentratie) . Let op: dit medium moet worden samengesteld uit verse voor gebruik elke keer. Voor een experiment in een 24-well plaat formaat, zal men moeten 12 ml van dit medium te bereiden. Het wordt aanbevolen dat u een beetje extra voor te bereiden. NGF kunnen worden gekocht bij een verscheidenheid van commerciële bronnen (zie tabel aan het einde van dit protocol). </li><li> Uitrusting: Men zal een dissectiemicroscoop en lichtbron nodig hebben. Een dubbele zwanenhals glasvezel verlichting met scherpstellen tips heeft de voorkeur. Daarnaast zal een behoefte te reinigen en steriliseren (in de autoclaaf of onderdompelen in 70% ethanol gedurende tenminste 20 minuten) de volgende dissectie-instrumenten: twee paren van micro-ontleden RVS tang, en een paar van de ontleding schaar (ook roestvrij staal en zowel van Roboz). Twee steriele injectienaalden (26 gague x 1 ½ cm of iets dergelijks) zal ook nodig zijn. Het is noodzakelijk om een ​​dissectie bord, dat is een 3 &quot;x3&quot; stuk van piepschuim verpakt in aluminium folie en afgedekt met een Kimwipe. Spray het bord met 70% ethanol te saneren. Tot slot, bereiden een brand-gepolijst glas weiland pipet. Met het oog op brand-polijsten, neem de glazen pipet en houd de tip in de vlam een ​​paar seconden, tijdens het draaien. Bij de inspectie, zal de tip gladder en de opening zal worden smaller. Dit is nodig voor de stap, waar de cellen los worden gezien. Uitvoeren van brand-polijsten in een celkweek kap, zodat de pipet blijft steriel. </li></ol> 2. Dissectie van Superior Cervicale Ganglia: <ol><li> Verzamel neonatale rat pups die de leeftijd van P0 of P1. </li><li> Oogwenk de pup voor de dissectie met 70% ethanol om de kansen op besmetting te verminderen. </li><li> Snel onthoofden pup met een scherpe schaar (deze stap zal niet worden getoond in de video). Houd het hoofd met behulp van steriele pincet tegen steriel gaasje in het kort uitlekken overtollig bloed. </li><li> Plaats het hoofd op de dissectie pad met de buikzijde naar boven en de caudale einde gericht naar u toe. Het afgehakte luchtpijp moet gemakkelijk zichtbaar zijn. Gebruik de steriele injectienaalden op het afgehakte hoofd vast te zetten het ontleden pad op de volgende manier: een pin duw hoewel het dak van de mond in de pad en de tweede pin hoewel de luchtpijp doorgesneden in het pad te duwen. Plaats de elektrode onder de microscoop ontleden en beginnen dissectie. </li><li> Met behulp van zowel tang (een in elke hand) opruimen huid en vet rond de luchtpijp, zorg niet te gaan te diep. Door dit te doen zal blootstellen een paar van de spieren loopt bijna parallel aan elkaar aan weerszijden van de luchtpijp. Let op: tijdens de dissectie, moet u spoelen met een koude steriele PBS of koud, serumvrij RPMI 1640 medium geleverd met een steriele, Pasteur pipet weg te spoelen overtollig bloed en te houden het gebied schoon en vochtig. Dit kan slechts een keer of meer dan een keer worden gedaan, afhankelijk van hoe snel men werkt. Voor een ervaring dissector, het duurt maar ongeveer twee tot drie minuten te ontleden uit een paar ganglia. </li><li> Gebruik de tang te snijden en de spier verwijder dan eerst aan een kant. </li><li> Zodra de spier is verwijderd, wordt de halsslagader zichtbaar worden. Vaak is het licht roze en bevat bloed. Het kan erop lijken lichter van kleur dan de andere bloedvaten die u kunt zien in de omgeving en om deze reden de halsslagader misschien niet meteen merkbaar. Deze slagader loopt langs de luchtpijp en splitst in wat eruit ziet als een &quot;Y&quot;-vormige lint. Deze bifurcatie is een belangrijke mijlpaal en als het eenmaal is gevestigd, zal het relatief eenvoudig om de SCG te vinden. </li><li> Scheiden van de slagader op de meest caudale einde en til deze iets omhoog met de tang (de andere kant is nog steeds verbonden). Zodra u dit doet, ziet u een amandelvormig, glanzend zoek kleine massa van weefsel dat losjes is om de slagader aangesloten net op het punt van bifurcatie en dat heeft THREAD-achtige pre-en / of postganglionnaire connectieven. Dit is de superieure cervicale ganglion. Gebruik een tweede paar pincetten in de andere hand om het voorzichtig los en plaats in een kleine cultuur schaal (35 mm) met koud, serum vrij RPMI 1640-medium. </li><li> Vervolgens pak het ganglion aan de andere kant van de luchtpijp volgens hetzelfde protocol. </li></ol> 3. Het reinigen van de Ganglia: <ol><li> Zodra alle ganglia zijn ontleed uit, moeten ze worden vrijgelaten zoveel mogelijk van vreemde weefsel. </li><li> Onder de dissectie microscoop, ziet u dat de ganglia hebben stukken van de halsslagader, vet of ander weefsel bevestigd. Werken met een pincet in elke hand te plagen weg deze ongewenste stoffen. Plaats schoongemaakt ganglia in een steriele 15ml conische, polypropyleen buis, met RPMI 1640-medium. </li><li> De pre-en / of postganglionnaire connectieven moet ook weg worden getrimd. Elke ganglion heeft ongeveer 10.000 neuronen. Zodra de neuronen zijn verguld, zullen ze teruggroeien hun neurieten. </li></ol> 4. Tot vaststelling van Sympathische Neuron cultuur: <ol><li> Centrifugeer de ganglia op 200xg gedurende 2 minuten en gooi het supernatant. </li><li> Resuspendeer de ganglia in 0,5 tot 1 ml van 0,25% trypsine oplossing. Leg ze in een 37 ˚ C waterbad of broedstoof gedurende 30 minuten. Dit zal helpen scheiden van de cellen in de ganglia. </li><li> Na 30 minuten, voeg 10 ml compleet medium om te verdunnen uit en neutraliseren van de trypsine en centrifugeer bij 200xg gedurende 2 minuten. </li><li> Gooi supernatant en resuspendeer in 2 ml van Final Medium. </li><li> Verder distantiëren van de cellen door fijnwrijven de ganglia op en neer met de brand-gepolijst glas weiland pipet. Vermaal het ganglia 20 keer en plaats de buis op ijs voor een paar minuten. </li><li> Ondertussen, brand-polish de pipet meer om de opening smaller (ongeveer 2 / 3 tot 1 / 2 mm in diameter). Wacht een paar minuten tot het afkoelt en vermaal het ganglia 20 keer meer. Zoals je doorgaat, wordt het medium worden steeds troebeler aangeeft dat de cellen worden gescheiden worden. Herhaal deze stap een of twee keer meer, afhankelijk van hoe goed de cellen scheiden. Na enige tijd zult u merken dat alle ganglia hebben gedissocieerd in de neuronen en geen intact ganglia zijn zichtbaar in de buis. Er kan wat weefsel materiaal dat niet distantiëren worden. Op dit punt, laat de buis in ijs zitten voor een paar minuten, zodat elke ongedissocieerde vuil kan naar de bodem. Nu zorgvuldig verzamelen bijna alle van het medium uit de top en in een andere buis. Om ervoor te zorgen dat u niet de ongedissocieerde vuil te verzamelen, laat ongeveer 50 ui op de bodem van de buis. Voeg meer van de Final medium om de buis met gescheiden cellen: dit volume afhankelijk van het type van de cultuur plaatje een is gebruikt om de cultuur van de neuronen. Bijvoorbeeld: als een 24-well gerecht dient te worden toegepast, dan plaat 0,5 ganglia per well (~ 10.000 neuronen per well) in 0,5 ml van Final medium per putje. Een typische rat nest bestaat uit 12 pups, waarvan 24 ganglia zou geven. Dit is genoeg om zaad een 24-wells plaat en het totale volume van Final medium is 12 ml. Opmerking: de ganglia bevatten ook een kleine populatie van de glia en andere celtypen die aanwezig zal zijn in de cultuur. Met behulp van Uridine/5-FDU in het uiteindelijke medium wordt voorkomen dat hun verspreiding en het bevorderen van hun dood. </li><li> Feed cellen elke 48 uur door het vervangen van 2 / 3 van het medium met verse RPMI +1% paard serum + NGF en uridine/5-FDU. Opmerking: In het begin, de cultuur bevat sympathische neuronen die er rond met geen neurieten. Korte neurieten zichtbaar worden 24 uur na de dissectie en geleidelijk dichter en meer vertakt in de tijd. </li></ol>

<ol><li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBanker%2C+G+%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. , MIT Press. (1998).</li>
<li>Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+Bim+Induction+in+Response+to+Nerve+Growth+Factor+Deprivation+Requires+Simultaneous+Activation+of+Three+Different+Death+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).</li>
<li>Bocchini, V., Angeletti, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nerve+Growth+Factor%3A+purification+as+a+30%2C000-molecular-weight+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).</li>
<li>Dechant, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chat+in+the+Trophic+Web%3A+NGF+Activates+Ret+by+Inter-RTK+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling.</a> Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).</li>
<li>Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bax+is+required+for+neuronal+death+after+trophic+factor+deprivation+and+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development.</a> Neuron. (17), 401-411 (1996).</li>
<li>Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+Vitro+Studies+on+the+Nerve+Growth+Factor+%28NGF%29+Requirement+of+Neurons+-+I.+Sympathetic+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons.</a> Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).</li>
<li>Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclin-dependent+kinases+participate+in+death+of+neurons+evoked+by+DNA-damaging+agents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents.</a> The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).</li>
<li>Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Promotes+the+Survival+of+Sympathetic+Neurons+through+the+Cooperative+Function+of+the+Protein+Kinase+C+and+Phosphatidylinositol+3-Kinase+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways.</a> The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te melden.

We maken gebruik van Sprague Dawley ratten voor onze culturen. Neem de tijd en zorg bij het schoonmaken van de ganglia. Verwijder alle vuil, bloedvaten en vet. Deze stap is belangrijk te zorgen voor een cultuur die is min of meer homogeen en vrij van vreemde celtypen. De toevoeging van uridine/5-FDU zal grotendeels te elimineren alle resterende niet-neuronale (mitotische) cellen besmetten van de cultuur of in ieder geval onderdrukken hun proliferatie. Daarnaast, tijdens de dissociatie stap, wees geduldig en neem de tijd om d...

<table><tbody><tr><td>Forceps, roestvrij staal #5</td><td>Instrument</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4976</td><td></td></tr><tr><td>Scharen, DEAVER recht scherp-stomp- 43mm bladen - 5.5</td><td>Instrument</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6760</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 met L-glutamine</td><td>Reagens</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Reagens</td><td>SAFC Global</td><td>12103c</td><td></td></tr><tr><td>Donor paardenserum</td><td>Reagens</td><td>JRH Biosciences</td><td>12449</td><td>Hitte-inactiveren door 30 minuten te incuberen in een waterbad van 56&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>Penicilline/streptomycine</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine zonder EDTA</td><td>Reagens</td><td>Difco Laboratories</td><td>MT 25-050-CI</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-5&amp;rsquo; deoxyuridine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-8791</td><td></td></tr><tr><td>NGF</td><td>Reagens</td><td>Harlan Laboratories</td><td>BT-5025</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop en lichtbron</td><td>Microscoop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml polypropyleen buisjes</td><td>Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Celkweekschalen</td><td>Instrument</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protocol voor het kweken van sympathische neuronen van rat superior baarmoederhalskanker ganglia (scg)

Protocol for Culturing Sympathetic Neurons from Rat Superior Cervical Ganglia (SCG)

De superieure cervicale ganglia (SCG) bij ratten zijn kleine, glanzende, amandel-vormige structuren die sympathische neuronen bevatten. Deze neuronen zorgen sympathiek innervaties voor het hoofd en de nek regio en vormen zij een goed gekarakteriseerd en relatief homogene populatie (4). Sympathische neuronen zijn afhankelijk van zenuw groeifactor (NGF) om te overleven, differentiatie en axonale groei en de wijdverbreide beschikbaarheid van de NGF vergemakkelijkt hun cultuur en experimentele manipulatie (2, 3, 6). Om deze redenen hebben gekweekte sympathische neuronen is gebruikt in een breed scala van studies met inbegrip van neuronale ontwikkeling en differentiatie, mechanismen van geprogrammeerde celdood en pathologische, en signaaltransductie (1, 2, 5 en 6). Ontleden van de SCG van pasgeboren ratten en het kweken van sympathische neuronen is niet erg ingewikkeld en kan vrij snel onder de knie. In dit artikel zullen we in detail beschrijven hoe te ontleden het SCG van pasgeboren ratten pups en om ze te gebruiken om culturen van sympathische neuronen vast te stellen. Het artikel zal beschrijven ook de voorbereidende stappen en de verschillende reagentia en apparatuur die nodig zijn om dit te bereiken.

Dit is een protocol beschrijft hoe te isoleren en cultuur primaire sympathische neuronen van een superieure cervicale ganglia (SCG) van pasgeboren ratten pups.

Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG)

De superieure cervicale ganglia (SCG) bij ratten zijn kleine, glanzende, amandelvormige structuren die sympathische neuronen bevatten. Deze neuronen zorgen voor ...

Deze procedure begint met het isoleren van de superieure cervicale sympathische ganglia van pasgeboren ratten op dag nul (P0). Elk brein heeft twee superieure cervicale sympathische ganglia. Uit één nest rattenpups kunnen ongeveer 24 ganglia worden geoogst.De dissociatie van de ganglia begint met behandeling gedurende 30 minuten. Verdere dissociatie wordt bereikt via herhaalde mechanische disruptie met een vuurgepolijste Pasteurpipet, wat resulteert in een suspensie van enkelvoudige cellen. Sympathische neuronen worden vervolgens geplaatst op met collageen gecoate schaaltjes.Hallo, ik ben Nila Zurin van het laboratorium van Dr. Lloyd Green van de afdeling Pathologie en Celbiologie aan de Columbia University City. Vandaag zullen we demonstreren hoe u primaire sympathische neuronen kunt isoleren en kweken uit de superieure cervicale ganglia van pasgeboren rode pups. In ons laboratorium gebruiken we deze cellen doorgaans om apoptose te bestuderen als reactie op het onttrekken van nerve growth factor.Laten we beginnen. We starten de procedure door een kweekschaal 24 uur vóór de dissectie te coaten met rattenstaartcollageen. Afhankelijk van de aard van het experiment wordt een kweekplaat van 24 of 48 wells gebruikt.Vervolgens worden de oplossingen, media en apparatuur klaargemaakt. Deze materialen en reagentia kunnen worden teruggevonden in het tekstprotocol dat bij deze video hoort. Het is belangrijk om op te merken dat de uridine- en vijf FDU-oplossing vlak voor gebruik moet worden bereid.Zet de voorbereiding voort met gebruik van vuur. Polijst de glazen Pasteur-pipetten voor de titratie-stappen. De punt van de glazen pipet wordt enkele seconden in de vlam gehouden terwijl deze wordt gedraaid om deze te vernauwen en glad te maken.Het aanvankelijke vuurpolijsten dient te worden uitgevoerd in een steriele celcultuurkap. Verzamel voor het begin van de dissectie pasgeboren ratpups van P0 tot P1. Een pasgeboren ratpup wordt snel afgeveegd met 70% ethanol om contaminatie te verminderen.Na de decapitatie wordt de kop met de ventrale zijde naar boven en het coddle-uiteinde naar u toe gericht op het dissectieblok geplaatst. De doorgesneden trachea moet duidelijk zichtbaar zijn. Steriele spuitnaalden worden gebruikt om de afgezetten kop op de volgende manier aan het dissectieblok te bevestigen.Steek één speld door het gehemelte in het dissectieblok en steek de tweede speld door het doorgesneden ruggenmerg in het blok. Nadat het dissectieblok onder de microscoop is geplaatst en u door de oculairs kijkt, gebruikt u twee pincetten om de huid en het vet rond de trachea te verwijderen. Let erop niet te diep te gaan; aan weerszijden van de trachea zullen twee spieren zichtbaar worden die bijna parallel aan elkaar lopen.Tijdens de dissectie dient u te irrigeren met koud steriel PBS of koud serumvrij RPMI 1640-medium, aangebracht met een steriele Pasteurpipet, om overtollig bloed weg te spoelen. Dit kan eenmaal of meerdere keren worden gedaan, afhankelijk van de snelheid van het werken. De pincet wordt vervolgens gebruikt om de spier aan één zijde eerst door te snijden en te verwijderen.Zodra de spier is verwijderd, wordt de arteria carotis zichtbaar. Deze slagader loopt langs de trachea en splitst zich in wat lijkt op een Y-vormig lint. Deze bifurcatie is een belangrijk oriëntatiepunt en zodra deze is gelokaliseerd, is het relatief eenvoudig om de ganglia cervicalia superiores te vinden.De slagader wordt aan het meest distale uiteinde doorgesneden en met de pincet iets opgetild. Het andere uiteinde van de slagader blijft vastzitten. Zodra dit is gedaan, wordt het ganglion cervicale superius zichtbaar.Men dient te zien dat het een amandelvormige, glanzende kleine weefselmassa is die losjes aan de arterie is bevestigd bij het bifurcatiepunt, en dat deze draadachtige pre- en/of postganglionaire verbindingen heeft. Met een tweede pincet wordt het superieure cervicale ganglion voorzichtig losgemaakt en geplaatst in een kleine kweekschaal van 35 millimeter met koud, serumvrij RPMI 1640-medium. Vervolgens wordt het ganglion aan de andere zijde van de trachea geëxtraheerd volgens hetzelfde protocol.Zodra alle ganglia zijn gedisseceerd, worden ze zo veel mogelijk vrijgemaakt van overbodig weefsel. Bij observatie via de microscoop is te zien dat de ganglia stukjes vet van de halsslagader of ander weefsel bevatten; met een pincet worden deze ongewenste materialen verwijderd. De pre- en/of postganglionaire connectieven worden eveneens weggesneden.Elk ganglion bevat ongeveer 10.000 neuronen. Zodra de neuronen zijn uitgeplaat, zullen ze hun neuritische uitlopers opnieuw laten groeien. De ganglia worden vervolgens geplaatst in een steriele conische polypropyleen buis van 15 milliliter met RPMI 1640-medium.Vervolgens wordt de cultuur van sympathische neuronen opgezet. De ganglia worden twee minuten gecentrifugeerd bij 200 G en het supernatant wordt weggegooid. De ganglia worden opnieuw gesuspendeerd in 0,5 tot 1 mL 0,25% trypsine-oplossing en vervolgens 30 minuten geplaatst in een waterbad of incubator op 37 °C om de dissociatie van de cellen in de ganglia te bevorderen.Na 30 minuten worden 10 milliliters compleet medium toegevoegd om het trypsine te verdunnen en te neutraliseren. De oplossingen worden vervolgens gecentrifugeerd bij 200 G gedurende twee minuten. Het supernatant wordt daarna weggegooid en de ganglia worden geresuspendeerd in twee milliliters finaal medium.Met behulp van een van de vooraf voorbereide, vlamgepolijste pipetpunten met een brede opening worden de cellen verder gedissocieerd door de ganglia 20 keer op en neer te pipetteren. De buis wordt vervolgens enkele minuten op ijs geplaatst. Daarna wordt de pipet opnieuw vlamgepolijst om de opening nog nauwer te maken.Nadat de pipet is afgekoeld, worden de ganglia nogmaals 20 keer getritureerd. Het medium zal geleidelijk troebeler worden, wat aangeeft dat de cellen worden gedissocieerd. Deze stap wordt één of twee keer herhaald, afhankelijk van hoe goed de cellen dissociëren.Na enige tijd zullen de ganglia zijn gedissocieerd in neuronen en zullen er geen intacte ganglia meer zichtbaar zijn in de buis. Er kan op dit punt wat weefselmateriaal aanwezig zijn dat niet dissocieert. De buis wordt enkele minuten op ijs gelaten zodat eventueel niet-gedissocieerd debris naar de bodem kan zakken.Alles behalve ongeveer 50 µL van het supernatant wordt voorzichtig verzameld en in een andere buis overgebracht. Er wordt 50 µL op de bodem van de buis achtergelaten om overdracht van niet-geassocieerd debris te voorkomen. Er wordt meer van het uiteindelijke medium toegevoegd aan de buis met de gedissocieerde cellen.Het volume aan toegevoegd definitief medium hangt af van het type cultuurplaat dat wordt gebruikt om de neuronen te kweken. Wanneer er bijvoorbeeld een 24-wellplaat wordt gebruikt, dient men één ganglion per well te plaatsen in 0,5 milliliter definitief medium per well.Een typisch nest ratten bestaat uit 12 pupjes, wat 24 ganglia oplevert. Dit is voldoende om één 24-wells plaat te vullen, waarbij het totale volume van het uiteindelijke medium 12 milliliter bedraagt. Het gebruik van uridine five FDU in het uiteindelijke medium voorkomt de proliferatie en bevordert de dood van een kleine populatie glia en andere celtypen.De cellen in de kweek worden elke 48 uur gevoed door twee derde van het medium te vervangen door vers RPMI aangevuld met 1% paardenserum, NGF, uridine en vijf FDU. Aanvankelijk bevat de kweek sympathische neuronen die er rond uitzien zonder neurieten.Korte neuronen worden 24 uur na dissectie zichtbaar en worden na verloop van tijd progressief dichter en meer vertakt. We hebben zojuist laten zien hoe u primaire sympathische neuronen uit de superieure cervicale ganglia van pasgeboren ratten kunt isoleren en kweken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om, ten eerste, de tijd en zorg te nemen bij het reinigen van de ganglia en alle resten, bloedvaten en vet te verwijderen.Deze stap is essentieel om te waarborgen dat een kweek min of meer homogeen is en vrij van vreemde celtypen. Ten tweede: wees tijdens de dissociatiestap geduldig en neem de tijd om de neuronen te scheiden, zodat ze niet in grote klonten voorkomen. Zodra ze op de platen zijn geplaatst, zullen grote klonten het proces bemoeilijken.Bij downstream-toepassingen, zoals het doorsnijden of infecteren van de neuronen, kan ook de immunokleuring worden belemmerd, en elke experimentele opzet waarbij de neuronen geteld moeten worden zal eveneens moeilijk uit te voeren zijn. Ten slotte is het niet nodig om het medium aan te vullen met penicilline-streptomycine. Elke keer dat de culturen worden gevoed is extra penicilline-streptomycine niet vereist; de allereerste keer dat de cellen worden geplaatst is voldoende.Voeg bij elke mediumverversing verse uridine en 5-FDU toe aan het medium. Ons laboratorium heeft sympathische neuronale culturen gebruikt om apoptose als reactie op het onttrekken van nerve growth factor te bestuderen. Dat is alles.Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

protocol-for-culturing-sympathetic-neurons-from-rat-superior-cervical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We beschrijven een protocol voor het gebruik van botmorfogenetische eiwit-7 (BMP-7) of Matrigel om selectief te induceren dendritische groei van de primaire sympathische neuronen los worden gezien van de superieure cervicale ganglia (SCG) van perinatale ratten.

Het induceren van dendritische groei in gekweekte sympathische neuronen

Het protocol beschrijft een efficiënt en reproduceerbaar modelsysteem om te studeren herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latentie en reactivatie. De test maakt gebruik van homogene sympathiek neuron culturen en maakt het mogelijk om moleculaire dissectie van virus-neuron interacties met behulp van een scala aan hulpmiddelen met inbegrip van RNA-interferentie en expressie van recombinante eiwitten.

Een primaire Neuron Cultuurstelsel voor de Studie van Herpes Simplex Virus latentie en reactivatie

This video demonstrates a procedure for isolating dorsal root ganglion (DRG) neurons from rat embryos and co-culturing them with Schwann cell precursors to generate mature Schwann cells. The isolated DRGs are processed to isolate neurons and glial cells. The isolated cells are cultured to purify the neurons, which are then co-cultured with Schwann cell-like cells (SCLCs) in a co-culture medium. Interaction with the DRG neurons leads to the maturation of SCLCs into Schwann cells.

Isolation of DRG Neurons and Coculture with Schwann Cell Precursors to Generate Schwann Cells

This video outlines the isolation and culturing of Schwann cells from mouse spinal roots. Isolated cells are then cultured in specific media. Schwann cells are isolated via differential digestion and adherence. They are subsequently transferred to extracellular matrix-coated coverslips for attachment and proliferation.

Isolation of Schwann Cells from Mouse Spinal Roots

This video demonstrates a technique for isolating and culturing dorsal root ganglia (DRG) cells from the rat spinal column. DRGs excised from the spinal column are treated with enzymes and mechanically dissociated to obtain a single-cell suspension. The cells are cultured in a medium containing inhibitors and growth factors that limit glial cell proliferation and promote neuronal growth, respectively.

Establishing a Primary Dorsal Root Ganglia Cell Culture from a Rat Spinal Column

Hier beschrijven we een Schwann-cellen (SC) migratie assay waarin SC kunnen ontwikkelen langs axonen verlenging.

Het analyseren van Murine Schwann Cell Development Samen Groeien Axonen

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Dorsal root ganglia (DRG) primaire culturen worden vaak gebruikt om te studeren fysiologische functies of pathologie-gerelateerde gebeurtenissen in de sensorische neuronen. Wij tonen hier, het gebruik van lumbale DRG culturen te detecteren het vrijkomen van neurotransmitters nadat neuropeptide FF receptor 2 stimulatie met een selectieve agonist.

Dorsal Root Ganglia isolatie en primaire cultuur te bestuderen van de Neurotransmitter Release

Dit artikel beschrijft de isolatie en het kweken van embryonale rat sympathische neuronen van de superieure cervicale ganglia. Het biedt ook gedetailleerde protocollen voor immunocytochemische kleuring en voor de voorbereiding van neuronale extracten voor massaspectrometrische analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen van Embryonale Superior Cervicale Ganglia voor morfologische en proteomische analyse

Chick ciliary ganglia (CG) maken deel uit van het parasympathische zenuwstelsel. Neuronale culturen van kuiken CG neuronen bleken effectieve celmodellen in de studie van zenuwspier interacties. We beschrijven een gedetailleerd protocol voor de dissectie, dissociatie en in vitro cultuur van CG neuronen uit kuikenembryo's.

Isolatie en cultuur van Chick Ciliary Ganglion Neurons

Het huidige protocol beschrijft een muismodel van de ablatie van adrenerge innervatie door het superieure cervicale ganglion te identificeren en te reseceren.

Chirurgische techniek voor superieure cervicale ganglionectomie in een muizenmodel

Leer de isolatie en kweek van sympathische neuronen uit de ganglia cervicalia superior van pasgeboren ratten. Dit protocol biedt een betrouwbare methode voor neurobiologisch onderzoek in vitro.

Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG)

Meer video's verkennen