Protocol voor het kweken van sympathische neuronen van Rat Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG)

Deze procedure begint met het isoleren van de superieure cervicale sympathische ganglia van pasgeboren ratten op dag nul (P0). Elk brein heeft twee superieure cervicale sympathische ganglia. Uit één nest rattenpups kunnen ongeveer 24 ganglia worden geoogst.

De dissociatie van de ganglia begint met behandeling gedurende 30 minuten. Verdere dissociatie wordt bereikt via herhaalde mechanische disruptie met een vuurgepolijste Pasteurpipet, wat resulteert in een suspensie van enkelvoudige cellen. Sympathische neuronen worden vervolgens geplaatst op met collageen gecoate schaaltjes.

Hallo, ik ben Nila Zurin van het laboratorium van Dr. Lloyd Green van de afdeling Pathologie en Celbiologie aan de Columbia University City. Vandaag zullen we demonstreren hoe u primaire sympathische neuronen kunt isoleren en kweken uit de superieure cervicale ganglia van pasgeboren rode pups. In ons laboratorium gebruiken we deze cellen doorgaans om apoptose te bestuderen als reactie op het onttrekken van nerve growth factor.

Laten we beginnen. We starten de procedure door een kweekschaal 24 uur vóór de dissectie te coaten met rattenstaartcollageen. Afhankelijk van de aard van het experiment wordt een kweekplaat van 24 of 48 wells gebruikt.

Vervolgens worden de oplossingen, media en apparatuur klaargemaakt. Deze materialen en reagentia kunnen worden teruggevonden in het tekstprotocol dat bij deze video hoort. Het is belangrijk om op te merken dat de uridine- en vijf FDU-oplossing vlak voor gebruik moet worden bereid.

Zet de voorbereiding voort met gebruik van vuur. Polijst de glazen Pasteur-pipetten voor de titratie-stappen. De punt van de glazen pipet wordt enkele seconden in de vlam gehouden terwijl deze wordt gedraaid om deze te vernauwen en glad te maken.

Het aanvankelijke vuurpolijsten dient te worden uitgevoerd in een steriele celcultuurkap. Verzamel voor het begin van de dissectie pasgeboren ratpups van P0 tot P1. Een pasgeboren ratpup wordt snel afgeveegd met 70% ethanol om contaminatie te verminderen.

Na de decapitatie wordt de kop met de ventrale zijde naar boven en het coddle-uiteinde naar u toe gericht op het dissectieblok geplaatst. De doorgesneden trachea moet duidelijk zichtbaar zijn. Steriele spuitnaalden worden gebruikt om de afgezetten kop op de volgende manier aan het dissectieblok te bevestigen.

Steek één speld door het gehemelte in het dissectieblok en steek de tweede speld door het doorgesneden ruggenmerg in het blok. Nadat het dissectieblok onder de microscoop is geplaatst en u door de oculairs kijkt, gebruikt u twee pincetten om de huid en het vet rond de trachea te verwijderen. Let erop niet te diep te gaan; aan weerszijden van de trachea zullen twee spieren zichtbaar worden die bijna parallel aan elkaar lopen.

Tijdens de dissectie dient u te irrigeren met koud steriel PBS of koud serumvrij RPMI 1640-medium, aangebracht met een steriele Pasteurpipet, om overtollig bloed weg te spoelen. Dit kan eenmaal of meerdere keren worden gedaan, afhankelijk van de snelheid van het werken. De pincet wordt vervolgens gebruikt om de spier aan één zijde eerst door te snijden en te verwijderen.

Zodra de spier is verwijderd, wordt de arteria carotis zichtbaar. Deze slagader loopt langs de trachea en splitst zich in wat lijkt op een Y-vormig lint. Deze bifurcatie is een belangrijk oriëntatiepunt en zodra deze is gelokaliseerd, is het relatief eenvoudig om de ganglia cervicalia superiores te vinden.

De slagader wordt aan het meest distale uiteinde doorgesneden en met de pincet iets opgetild. Het andere uiteinde van de slagader blijft vastzitten. Zodra dit is gedaan, wordt het ganglion cervicale superius zichtbaar.

Men dient te zien dat het een amandelvormige, glanzende kleine weefselmassa is die losjes aan de arterie is bevestigd bij het bifurcatiepunt, en dat deze draadachtige pre- en/of postganglionaire verbindingen heeft. Met een tweede pincet wordt het superieure cervicale ganglion voorzichtig losgemaakt en geplaatst in een kleine kweekschaal van 35 millimeter met koud, serumvrij RPMI 1640-medium. Vervolgens wordt het ganglion aan de andere zijde van de trachea geëxtraheerd volgens hetzelfde protocol.

Zodra alle ganglia zijn gedisseceerd, worden ze zo veel mogelijk vrijgemaakt van overbodig weefsel. Bij observatie via de microscoop is te zien dat de ganglia stukjes vet van de halsslagader of ander weefsel bevatten; met een pincet worden deze ongewenste materialen verwijderd. De pre- en/of postganglionaire connectieven worden eveneens weggesneden.

Elk ganglion bevat ongeveer 10.000 neuronen. Zodra de neuronen zijn uitgeplaat, zullen ze hun neuritische uitlopers opnieuw laten groeien. De ganglia worden vervolgens geplaatst in een steriele conische polypropyleen buis van 15 milliliter met RPMI 1640-medium.

Vervolgens wordt de cultuur van sympathische neuronen opgezet. De ganglia worden twee minuten gecentrifugeerd bij 200 G en het supernatant wordt weggegooid. De ganglia worden opnieuw gesuspendeerd in 0,5 tot 1 mL 0,25% trypsine-oplossing en vervolgens 30 minuten geplaatst in een waterbad of incubator op 37 °C om de dissociatie van de cellen in de ganglia te bevorderen.

Na 30 minuten worden 10 milliliters compleet medium toegevoegd om het trypsine te verdunnen en te neutraliseren. De oplossingen worden vervolgens gecentrifugeerd bij 200 G gedurende twee minuten. Het supernatant wordt daarna weggegooid en de ganglia worden geresuspendeerd in twee milliliters finaal medium.

Met behulp van een van de vooraf voorbereide, vlamgepolijste pipetpunten met een brede opening worden de cellen verder gedissocieerd door de ganglia 20 keer op en neer te pipetteren. De buis wordt vervolgens enkele minuten op ijs geplaatst. Daarna wordt de pipet opnieuw vlamgepolijst om de opening nog nauwer te maken.

Nadat de pipet is afgekoeld, worden de ganglia nogmaals 20 keer getritureerd. Het medium zal geleidelijk troebeler worden, wat aangeeft dat de cellen worden gedissocieerd. Deze stap wordt één of twee keer herhaald, afhankelijk van hoe goed de cellen dissociëren.

Na enige tijd zullen de ganglia zijn gedissocieerd in neuronen en zullen er geen intacte ganglia meer zichtbaar zijn in de buis. Er kan op dit punt wat weefselmateriaal aanwezig zijn dat niet dissocieert. De buis wordt enkele minuten op ijs gelaten zodat eventueel niet-gedissocieerd debris naar de bodem kan zakken.

Alles behalve ongeveer 50 µL van het supernatant wordt voorzichtig verzameld en in een andere buis overgebracht. Er wordt 50 µL op de bodem van de buis achtergelaten om overdracht van niet-geassocieerd debris te voorkomen. Er wordt meer van het uiteindelijke medium toegevoegd aan de buis met de gedissocieerde cellen.

Het volume aan toegevoegd definitief medium hangt af van het type cultuurplaat dat wordt gebruikt om de neuronen te kweken. Wanneer er bijvoorbeeld een 24-wellplaat wordt gebruikt, dient men één ganglion per well te plaatsen in 0,5 milliliter definitief medium per well.

Een typisch nest ratten bestaat uit 12 pupjes, wat 24 ganglia oplevert. Dit is voldoende om één 24-wells plaat te vullen, waarbij het totale volume van het uiteindelijke medium 12 milliliter bedraagt. Het gebruik van uridine five FDU in het uiteindelijke medium voorkomt de proliferatie en bevordert de dood van een kleine populatie glia en andere celtypen.

De cellen in de kweek worden elke 48 uur gevoed door twee derde van het medium te vervangen door vers RPMI aangevuld met 1% paardenserum, NGF, uridine en vijf FDU. Aanvankelijk bevat de kweek sympathische neuronen die er rond uitzien zonder neurieten.

Korte neuronen worden 24 uur na dissectie zichtbaar en worden na verloop van tijd progressief dichter en meer vertakt. We hebben zojuist laten zien hoe u primaire sympathische neuronen uit de superieure cervicale ganglia van pasgeboren ratten kunt isoleren en kweken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om, ten eerste, de tijd en zorg te nemen bij het reinigen van de ganglia en alle resten, bloedvaten en vet te verwijderen.

Deze stap is essentieel om te waarborgen dat een kweek min of meer homogeen is en vrij van vreemde celtypen. Ten tweede: wees tijdens de dissociatiestap geduldig en neem de tijd om de neuronen te scheiden, zodat ze niet in grote klonten voorkomen. Zodra ze op de platen zijn geplaatst, zullen grote klonten het proces bemoeilijken.

Bij downstream-toepassingen, zoals het doorsnijden of infecteren van de neuronen, kan ook de immunokleuring worden belemmerd, en elke experimentele opzet waarbij de neuronen geteld moeten worden zal eveneens moeilijk uit te voeren zijn. Ten slotte is het niet nodig om het medium aan te vullen met penicilline-streptomycine. Elke keer dat de culturen worden gevoed is extra penicilline-streptomycine niet vereist; de allereerste keer dat de cellen worden geplaatst is voldoende.

Voeg bij elke mediumverversing verse uridine en 5-FDU toe aan het medium. Ons laboratorium heeft sympathische neuronale culturen gebruikt om apoptose als reactie op het onttrekken van nerve growth factor te bestuderen. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.