Name: Isolatie en Cultuur van Post-Natal Mouse Cerebellaire Korrel Neuron progenitor cellen en Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 4 s
Description: Leer de isolatie en cultuur van cerebellaire korrelneuronen en progenitorcellen uit postnatale muizen. Deze methode omvat dissociatie met papaine, filtratie en centrifugatie op een percoll-gradiënt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Barbara Carletti en Anna Marie Kenney voor waardevolle suggesties. HYL wordt ondersteund door de Training Grant &quot;Hormonen: Biochemie en Moleculaire Biologie &#39;, DK07328. Mede ondersteund door NIH subsidie ​​5R01 NS16951 (CAM).

Deel 1: Het opzetten van (1-2 dagen vóór versnijding) (niet getoond op de video) <ol><li> VOORBEREIDEN CULTUUR OPLOSSINGEN EN MEDIA: <ul><li> 4X CMF-PBS-EDTA (calcium en magnesium vrij-fosfaat gebufferde zoutoplossing-EDTA voor Percoll verdunningen): per liter, voeg 32 g NaCl, 1,2 g KCl, 8 g glucose, 2 g NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml 2% NaHCO 3 voorraad, 10 ml 1 M EDTA (pH 8,0) om gedestilleerd / gedemineraliseerd water. Zet het volume op 1 liter en de pH op 7,4. Filter steriliseren. </li><li> HBSS-GLUCOSE: Voeg glucose (6 gram / liter) voor calcium en magnesium vrij Hank&#39;s Balance Salt Solution (HBSS) en steriele filter. 500 ml kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een maand. </li><li> CULTUUR MEDIA: serum-vrij medium (SFM) en 10% FBS medium. Tot 48 ml van Neurobasal A-Medium toe te voegen 500 pi 100X Glutamax I, 500 ul 100X penicilline-streptomycine (finale 100 eenheden penicilline en streptomycine 100 ug), 6,25 ui 2 M KCl (laatste 250 uM). Gesplitst in twee porties van 9 ml en 40 ml. Ter voorbereiding 10% FBS medium, voeg 1 ml van hitte-geïnactiveerd FBS om de 9 ml aliquot deel. Ter voorbereiding SFM, voeg 800 ul van de serum-vrij aan te vullen B-27 naar de 40 ml aliquot deel. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C voor maximaal 2 weken. Voor het beste resultaat te maken vers medium voor elk experiment. </li></ul></li><li> VOORBEREIDEN Percoll verdunningen: <ul><li> Percoll wordt geleverd als een vloeistof en het moet aangezuurd voor gebruik. Ter voorbereiding op de voorraad, voeg 1 N HCl beetje bij beetje aan de Percoll oplossing over een 1-2 uur tijd tot een pH van 7,4 is bereikt. Het toevoegen van de HCl te snel zal leiden tot de Percoll te aggregeren. Ongeveer 6.5ml van 1 N HCl nodig zijn voor elke liter van Percoll. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. </li><li> Een 35% en 60% (vol: vol) Percoll verwatering zal worden gebruikt in de Percoll verloop stap. Bereiding van 100 ml Percoll verdunningen met 35 of 60 ml van Percoll voorraad, 25 ml 4X CMF-PBS-EDTA en gedestilleerd / gedeïoniseerd H2O aan de uiteindelijke volume. Voeg een paar druppels toluidine blauw aan de 60%-oplossing, het zal helpen visualiseren van de interface en de cellen. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C. </li><li> 4X CMF-PBS-EDTA mag niet ouder zijn dan drie maanden, als onvoldoende buffering zal worden met meer celdood veroorzaken tijdens de procedure. </li></ul></li><li> VOORBEREIDEN coverslips: Glazen dekglaasjes (beter als van Carolina Biologische Supply Company) zijn gewassen met 10% HCl &#39;s nachts bij kamertemperatuur met een lichte agitatie, gespoeld grondig met gedestilleerd / deonized water en opgeslagen in 70% ethanol. Voor het gebruik, enkele dekglaasjes worden vlam-gesteriliseerd door kort houdt ze met een pincet boven een open vlam (bunsenbrander) tot de ethanol verdampt. 12-mm glas dekglaasjes kan geplaatst worden in 4-putjes en 25-mm dekglaasjes in 6-putjes. </li><li> COATING kweekvaten met substraat: Voor immunofluorescentiekleuring of behandeling met medicijnen dekglaasjes meer geschikt zijn omdat zij gemakkelijk kunnen worden gemonteerd op glazen objectglaasjes voor visualisatie onder een microscoop. Wanneer grote aantallen cellen zijn nodig voor het verzamelen van eiwit-of RNA-monsters, cellen kunnen worden gekweekt op plastic cultuur dishes.The avond vóór versnijding, moet dekglaasjes of plastic schotels voor cultuur worden bekleed met poly-D-lysine (500 ug / ml; 800 ul / putje voor 6-well platen of 350 ul / putje voor 4-wells platen). 5 mg / ml stockoplossing van poly-D-lysine is opgeslagen bij -20 ° C, vervolgens verdund in steriel gedistilleerd / deonized water en steriel gefilterd vlak voor gebruik. Kweekvaten worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende de nacht (of in ieder geval voor 2 uur voor plating) en tweemaal gewassen met steriel gedistilleerd / deonized water vlak voor plating. </li><li> VOORBEREIDEN PREPLATING GERECHTEN: Deze gerechten zullen worden gebruikt voor pre-plating de geïsoleerde cerebellaire cellen voordat cultuur gliale verontreinigende stoffen, die gemakkelijker zich te houden aan een lagere concentratie van substraat te verwijderen. Jas twee 60-mm kunststof cultuur gerechten met 4 ml per gerecht van poly-D-lysine (100 ug / ml; Merk op dat dit is 1 / 5 van de gebruikte concentratie voor het kweken van). Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht (of in ieder geval voor 2 uur voor dissectie). Vlak voor de dissectie, verwijder de poly-D-lysine oplossing, twee keer de afwas met steriel water en laten drogen in de motorkap. </li><li> Steriliseer dissectie-instrumenten in de autoclaaf of op de dag van de dissectie, dompel de tools in 70% ethanol gedurende 20 minuten. Benodigd gereedschap: Permaset schaar, microdissecting schaar, vier Dumont # 5 ontleden tang. </li></ol> Deel 2: Voorbereiding op Dissectie (dag van de dissectie) - (aangetoond in video) Alle van de volgende procedures worden uitgevoerd in een weefselkweek kap, tenzij vermeld. <ol><li> Veeg de ontleden gebied met 70% ethanol. Warm de media tot 37 ° C in een waterbad of in een 5% CO 2 37 ° C incubator. </li><li> Bij het starten van een nieuw Papaïne Dissociatie System Kit (Worthington), de voorbereiding van de oplossing van albumine-ovomucoid remmer. Voeg 32 mlvan EBSS (Balanced Salt Solution Earle&#39;s, die in de kit) om de albumine-ovomucoid remmer mengsel en laat de inhoud op te lossen, terwijl de voorbereiding van de andere componenten. Reconstitueer voor het eerste gebruik, bewaar de resterende oplossing bij 2-8 ° C en gebruiken totdat de vijf isolaties toegestaan ​​door elke kit zijn voltooid. </li><li> Voeg 5 ml EBSS om een ​​papaïne injectieflacon uit de Dissociation Kit (iedere flacon is voldoende voor dissociatie van 4 tot 15 cerebella van postnatale dag 5 muizen). Plaats de papaïne flacon in een 5% CO 2 37 ° C incubator of 37 ° C waterbad gedurende 5 tot 10 minuten tot de papaïne helemaal is opgelost en de oplossing blijkt duidelijk. Handhaaf de oplossing bij kamertemperatuur gedurende dissectie. </li><li> Voeg 500 ul van EBSS om een ​​DNase injectieflacon uit de Dissociatie Kit. Meng voorzichtig door te tikken op de flacon, omdat DNase is gevoelig voor afschuiving denaturatie. Voeg 250 ul van deze oplossing aan de flacon met de papaïne (uiteindelijke concentratie is 20 eenheden / ml papaïne en 0,005% DNase). Sla de resterende DNase flacon voor gebruik in stap 5.1 of 6.1. </li></ol> Deel 3: Dissection en de hersenvliezen verwijderen <ol><li> De optimale leeftijd voor korrel celkweek van C57BL/6J muizen is postnatale dag 4-6, toen het aantal korrel cel voorlopercellen in de EGL peaks1, 10. Ontleden pups een voor een en als je meer bekend raakt met de cerebellaire dissectie proberen dissectie tijd te verlagen tot niet meer dan 6 minuten per pup. Snelheid is van essentieel belang. Als de Percoll gradiënt stap is overgeslagen, kan acht postnatale-dagen-5 muis pups opbrengst genoeg cellen voor een 6-well plaat cultuur (of zes 25-mm dekglaasjes) of voor zes 4-putjes (of vierentwintig 12 - mm coverslips). Geschatte opbrengst is van 4 tot 5x106 cellen per pup en beplating dichtheden kan variëren tussen de 1 en 5X105 cells/cm2. Omdat 15-20% cellen verloren zijn gegaan tijdens de Percoll step4, zijn meer dieren nodig om hetzelfde gewenste cel dichtheid te verkrijgen. </li><li> Pipetteer 15 ml van HBSS-glucose in een 60-mm kunststof weefselkweek schotel en 10 ml in een steriele Falcon 15 ml conische plastic buis. Leg op het ijs. </li><li> Buiten de kap, veeg de kop van de pup met 70% ethanol. Gebruik Permaset schaar om de pup onthoofden. (Decapitation zal niet worden getoond in de video.) </li><li> In de kap, houdt het hoofd met Dumont tang zodat u duidelijk de achterkant van de schedel. Toegang tot de hersenen door het invoegen van microdissecting schaar in het foramen magnum en dwars in de richting van de ogen. Met behulp van een tang, afpellen van de huid en til de schedel naar de hersenen bloot te leggen. Met behulp van Dumont tang, knijp uit het cerebellum en de omliggende middenhersenen en overbrengen naar het gerecht met HBSS-glucose. (Het is gemakkelijker om de kleine hersenen te manipuleren en de hersenvliezen te verwijderen als de kleine hersenen is nog aan het omliggende weefsel). </li><li> Onder de microscoop ontleden, voorzichtig pellen van de hersenvliezen uit het cerebellum en ook tussen de lobben met een fijne Dumont # 5 tang, terwijl met de andere tang te verankeren beneden de kleine hersenen op de plaat. Je zal merken bloedvaten op het oppervlak van het cerebellum. Deze bloedvaten zijn een goede manier om de hersenvliezen te identificeren. Verwijder de hersenvliezen totdat het cerebellum krijgt een matte witte verschijning. Scheid de kleine hersenen van de rest van de middenhersenen. Draai het om zijn buikzijde en verwijder de choroidea plexus, die eruitziet als een rode lint tussen de ventrale cerebellum en de aangrenzende middenhersenen. Plaats elke cerebellum in koud HBSS-glucose in een 15 ml conische buis op ijs zo snel ontleed. Wijzig de ontleden oplossing om verse HBSS-glucose na ontleden 3 hersenen. </li></ol> Deel 4: celsuspensie <ol><li> Zodra alle dissecties klaar zijn, verwijdert u de HBSS-glucose uit de tube en vervang deze door de papaïne oplossing gemaakt in stap 2.4. Hoewel de kit beveelt het snijden van het weefsel in kleine stukjes, vinden we dat het niet nodig is te snijden of het cerebella gehakt op deze leeftijd. Leg het weefsel + papaïne-oplossing (in een 15 ml conische buis) in een 37 ° C waterbad of 5% CO 2 37 ° C incubator gedurende 15 tot 20 minuten. Voor 4 tot 8 cerebella, 15 minuten bij 37 ° C is voldoende, voor een groter aantal cerebella 20 tot 30 minuten is beter. Schud voorzichtig de buis om de 3 tot 4 minuten. </li><li> Vermaal het mengsel met een steriele P1000 aërosol pipetpunt dat is bedekt met FBS. Doe dit voorzichtig stap om luchtbellen te voorkomen. Brand gepolijst glas pipetten kunnen gebruikt worden, maar wij vinden dat de serum gecoat steriel P1000 spuitbus tips werken net zo goed. Om de vacht van de pipetpunt met FBS, pipet FBS op en neer twee keer vlak voor gebruik. Ongeveer 10 op en neer bewegingen met de pipet zijn voldoende om het weefsel dissociëren. De oplossing zal troebel wordt. Geven om de schorsing te zitten voor 30-60 seconden dat elke grote stukken van ongedissocieerde weefsel zal naar de bodem van de buis. </li><li> Verwijder de geschorste cellen (Pas op dat u de ongedissocieerde weefsel stukken te verwijderen op de bottom) in een frisse 15 ml conische buis met een serum gecoate pipetpunt. Centrifugeer op ongeveer 200xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid de resuspensie medium. Om dit te doen, mix 2,7 ml EBSS met 300 ul van gereconstitueerd albumine-ovomucoid inhibitor-oplossing in een steriele buis. Voeg 150 ul van DNase-oplossing uit stap 2.4. </li><li> Na centrifugeren, gooi de supernatant en onmiddellijk de cel pellet opnieuw in suspensie in de verdunde DNase / albumine-remmer bereide oplossing in stap 4.3 met een serum gecoate P1000 spuitbus pipetpunt. </li><li> Bereid een discontinue dichtheidsgradiënt als volgt. Voeg 5 ml albumine-ovomucoid remmer oplossing om een ​​15 ml conische buis. Voorzichtig laag de celsuspensie op de top. Centrifugeer op ongeveer 70xg gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur. Gescheiden cellen pellet op de bodem van de buis, membraan fragmenten blijven op de interface. </li><li> Wilt u culturen die verrijkt zijn met granule cellen te verkrijgen, de bypass Percoll verloop scheiding stap (die opbrengst zuiverder culturen van cerebellaire granule cellen), en ga verder met deel 6. Als u verder de granule cellen van de glia en grote interneuronen isoleren door Percoll gradiënt scheiding, ga dan naar deel 5. Gebruik van de Percoll verloop stap zal de opbrengst van cellen. In onze handen, de vermindering van de opbrengst is ongeveer 20-35%. Echter, er is een toename van de verrijking van granule neuronen en stamcellen uit ongeveer 90% naar 95-99%. </li></ol> Deel 5: Percoll Gradient Scheiding <ol><li> Verwijder het supernatant en onmiddellijk de pellet opnieuw in suspensie in 2 ml HBSS-glucose met 50 ul van DNase uit stap 2.4. Filter de celsuspensie hoewel een nylon mesh (poriegrootte 70 micrometer), door de zwaartekracht. Deze stap verwijdert grote niet-neuronale cellen en zorgt voor een betere enkele celsuspensie. </li><li> Bereid twee brand-gepolijst glas pasteurpipetten. Om dit te doen, voorzichtig vlam het uiteinde van een glazen pipet tot aan de rand is gladder en de pipet boring is 40-50% van de oorspronkelijke grootte. Zorg ervoor dat om de opening te klein. </li><li> Bereid Percoll verloop. Breng 10 ml van 35% Percoll oplossing in een 50 ml steriel conische buis. 60% Percoll (10 ml) wordt geladen in een 10 ml steriele spuit met een steriele naald bevestigd spinale. Voorzichtig laag van de 60% Percoll oplossing onder de 35%-oplossing, door het toevoegen van de 60%-oplossing op de bodem van de buis met de spinale naald. Zorg ervoor dat een scherpe interface tussen de twee lagen te houden. Voeg de cellen naar de top van de gradiënt met behulp van een brand-gepolijste pipet voorzichtig toe te voegen aan de zijkant van de buis zonder de interface. </li><li> Plaats voorzichtig de buis in de centrifuge en centrifugeer bij 1800xg. Opvoeren van de snelheid een stap om de 20 seconden (in stappen van de snelheid zijn als volgt: ongeveer 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg), zodat het duurt ongeveer 2 minuten te bereiken van de gewenste snelheid. Start de timer tot 10 min wanneer 1800xg is bereikt. Wanneer u klaar bent, verlagen de snelheid geleidelijk een stap om de 20 seconden. </li><li> Verwijder de bovenste interface van de gradiënt (met grote glia, Purkinje cellen en interneuronen) en gooi. </li><li> Verwijder voorzichtig de cellen op het grensvlak tussen de 35% en 60% Percoll met een brand-gepolijste pipet en over te dragen aan een 50 ml conische buis. Resuspendeer in drie volumes van HBSS-glucose en meng door een paar keer. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1100xg. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en voeg 4 ml 10% FBS medium met 50 ul van DNase. Resuspendeer de pellet zachtjes met een brand-gepolijst pipet aan op een enkele cel suspensie te vormen. Ga verder met 6,2 stap. </li></ol> Deel 6: Pre-plating en Plating <ol><li> Verwijder het supernatant en onmiddellijk de pellet opnieuw in suspensie in 4 ml van 10% FBS medium met 50 ul van DNase uit stap 2.4. Filter de celsuspensie hoewel een nylon mesh (poriegrootte 70 micrometer), door de zwaartekracht. Deze stap verwijdert grote niet-neuronale cellen en zorgt voor een betere enkele celsuspensie. </li><li> Het bord van de verzamelde cellen op een poly-D-lysine gecoate pre-plating schotel gedurende 20 minuten in een 5% CO 2 37 ° C incubator. Herhalen met een verse schotel. De astroglia en zwaarder cellen zullen tot rust komen en zich te houden aan de gerechten en laat de kleine korrel neuronen en neuron progenitorcellen drijven. Na de incubatie, zijn losjes aangehouden granule neuronen en neuron progenitor cellen zitten snel los en los met zachte tikken van de plaat. </li><li> Verzamel de korrel neuronen en neuron progenitor cellen in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 200xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer de pellet in 1 ml serum-vrij medium en tellen een hoeveelheid van 10 ul met behulp van een hemocytometer. </li><li> Voeg serum-vrij medium om de gewenste cel dichtheid te bereiken. Rough richtlijnen om aantallen cellen te plaat voor medium density: voor 6-well platen, 3,5 tot 4 miljoen cellen; voor 4-putjes, 650.000 cellen. Voor 6-putjes, ik plaat 1,5 ml / putje en voor 4 goed plates, ik plaat 0,5 ml / putje. De cellen worden bijgehouden in een 5% CO 2 37 ° C incubator. Geheel veranderen van de medium 24 uur later met de latere wijzigingen om de twee tot drie dagen. </li></ol>

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+the+cerebellar+system%3A+in+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+functions%22">Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).</li>
<li>Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHatten%2C+ME+%22in+Culturing+Nerve+Cells%22">in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge, Mass. 419-419 (1998).</li>
<li>Hatten, M. E. The Journal of Cell Biology. 100 (2), 384-384 (1985).</li>
<li>Carletti, B., Rossi, F. Neuroscientist. 14 (1), 91-91 (2008).</li>
<li>Knoepfler, P. S., Kenney, A. M. Cell Cycle. 5 (1), 47-47 (2006).</li>
<li>Manzini, M. C., Joseph, D. J., MacDermott, A. B. Molecular and Cellular Neuroscience. 35 (2), 328-328 (2007).</li>
<li>Manzini, M. C., Ward, M. S., Zhang, Q. Journal of Neuroscience. 26 (22), 6040-6040 (2006).</li>
<li>Baptista, C. A., Hatten, M. E., Blazeski, R. Neuron. 12 (2), 243-243 (1994).</li>
<li>Palay, S. L., Chan-Palay, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalay%2C+SL+%22Cerebellar+Cortex%3A+Cytology+and+Organization%22">Cerebellar Cortex: Cytology and Organization</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1974).</li>
<li>Messer, A. Brain Research. 130 (1), 1-1 (1977).</li>
<li>Ruiz I Altaba, A. Development. 126, 3205-3205 (1999).</li>
<li>Wallace, V. A. Current Biology. 9 (8), 445-445 (1999).</li>
<li>Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Neuron. 22 (1), 103-103 (1999).</li>
<li>Solecki, D. J., Liu, X. L., Tomoda, T. Neuron. 31 (4), 557-557 (2001).</li>
<li>Powell, S. K., Williams, C. C., Nomizu, M. Journal of Neuroscience Research. 54 (2), 233-233 (1998).</li>
<li>Lander, A. D., Fujii, D. K., Reichardt, L. F. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (7), 2183-2183 (1985).</li>
<li>Kenney, A. M., Rowitch, D. H. Molecular and Cellular Biology. 20 (23), 9055-9055 (2000).</li>
<li>Kenney, A. M., Cole, M. D., Rowitch, D. H. Development. 130 (1), 15-15 (2003).</li>
<li>Pons, S., Trejo, J. L., Martinez-Morales, J. R. Development. 128, 1481-1481 (2001).</li>
</ol>

Dit protocol is gebaseerd op de wijzigingen van de procedures die zijn beschreven in het verleden 3,7,11. Er zijn een aantal belangrijke punten om op te merken, zoals hieronder besproken. De korrel neuronen en progenitor cellen zich binnen 2 uur in de platen. Gezonde cellen hebben een ronde morfologie onder de fase-contrast microscoop 4. Binnen 24 uur na plating, zullen gezonde cellen verspreid over heel de dekglaasjes of het plastic goed en vormt processen. Op het moment van het eerste medium te veranderen, na...

<table><tbody><tr><td>Celzeef met 70&amp;mu;m maaswijdte</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Spinale naald</td><td>BD Biosciences</td><td>405182</td><td>20G x 3-1/2 inches</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine molgew. &amp;gt;300,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1024</td><td>Elke nieuwe batch Poly-D-Lysine moet worden getest.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1644</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-103</td><td>Moet calcium- en magnesiumvrij zijn.</td></tr><tr><td>Neurobasal A-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I supplement</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serumvrij supplement (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>12-mm ronde dekglasjes</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3029</td><td>Deze worden in Duitsland gemaakt door Deckgluder.</td></tr><tr><td>25-mm ronde dekglasjes</td><td>Carolina Biological</td><td>63-3037</td><td>Deze worden in Duitsland gemaakt door Deckgluder.</td></tr><tr><td>Papain dissociatiesysteem</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK 003150</td><td>Kit is geschikt voor vijf isolaties.</td></tr><tr><td>Permaset scharen</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS6782</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 (Dumostar)</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS4978</td><td></td></tr><tr><td>4-wells kweekplaat</td><td>Nalge Nunc international</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>6-wells kweekplaat</td><td>Nalge Nunc international</td><td>140685</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van post-natal mouse cerebellaire korrel neuron progenitor cellen en neuronen

Isolation and Culture of Post-Natal Mouse Cerebellar Granule Neuron Progenitor Cells and Neurons 

De cerebellaire cortex is een goed beschreven structuur die unieke kansen voor het bestuderen van neuronale eigenschappen en ontwikkeling 1,2 biedt. Van de cerebellaire neuronale types (granule cellen, Purkinje cellen en remmende interneuronen), granulaat neuronen zijn veruit de meest talrijke en zijn de meest voorkomende vorm van neuronen in de hersenen van zoogdieren. Bij knaagdieren, zijn de kleine hersenen korrel neuronen die tijdens de eerste twee postnatale week van progenitor cellen in de buitenste laag van de cerebellaire cortex, de externe korrel laag (EGL). Het protocol beschrijft hier gepresenteerde technieken te verrijken en cultuur korrel neuronen en hun stamcellen uit post-natale muis cerebellum. We beschrijven de procedures aan culturen van toenemende zuiverheid 3,4, die kan worden gebruikt om de differentiatie van prolifererende progenitorcellen in de granule neuronen 5,6 studie te verkrijgen. Zodra de progenitor cellen differentiëren, de culturen ook een homogene populatie van korrel neuronen zorgen voor experimentele manipulatie en karakterisering van fenomenen zoals synaptogenese, glutamaat receptor functie 7, interactie met andere gezuiverde cerebellaire cellen 8,9 of celdood 7.

Hier presenteren wij een methode om te isoleren en cultuur cerebellaire granule neuron progenitor cellen en cerebellaire korrel neuronen van postnatale muis.

Isolatie en Cultuur van Post-Natal Mouse Cerebellaire Korrel Neuron progenitor cellen en Neuronen

De cerebellaire cortex is een goed beschreven structuur die unieke mogelijkheden biedt voor het bestuderen van neuronale eigenschappen en ontwikkeling1,2. Van de ...

Deze procedure begint met het verwijderen van het cerebellum van P4 tot P5. De hersenvliezen en de plexus choroideus van pasgeboren muizen worden verwijderd uit individuele cerebella, die vervolgens worden verzameld in een conische buis van 15 milliliter. De cerebella worden gedissocieerd met papaine en door middel van zachte trituratie omgezet in een suspensie van enkelvoudige cellen.Deze suspensie wordt door zwaartekracht gefilterd via een nylon gaas met een poriegrootte van 70 micron. Het filtraat wordt voorzichtig bovenop een discontinue perca-gradiënt gelaagd en gecentrifugeerd om de korrelcellen te scheiden van de glia in neuronen en Perkin-gen neuronen. Cellen in de interface van de gradiënt worden verzameld en geplaatst op met poly-D-lysine gecoate platen.Om de gliacellen verder te verwijderen, worden de korrelcellen verzameld, geteld en geplaatst bij de gewenste dichtheden op met poly-D-lysine gecoate glazen dekglasjes of plastic kweekplaten. Hallo, ik ben Heyoung Lee van het laboratorium van Dr. Lloyd Green van de afdeling Pathologie aan de Columbia University. Vandaag laten we u een procedure zien voor het isoleren en kweken van cerebellaire korrelneuronen van postnatale muizen.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de proliferatie en differentiatie van granule neuro-progenitoren te bestuderen. Laten we beginnen. Deze procedure start met het gebruik van 70% ethanol in het dissectiegebied om cerebellaire granulecellen te dissociëren; hiervoor maken we gebruik van het Papin-dissociatiesysteem.Bereid bij het starten van een nieuwe kit de albumin OVO equate MOID-remmingsoplossing. Neem hiervoor 32 milliliters van de Earl's balanced salt solution of EBSS, die in de kit is meegeleverd, en voeg deze toe aan het albumin OVO moid-mengsel. Zet dit apart terwijl de andere componenten worden voorbereid, zodat de inhoud kan oplossen.Voeg vervolgens vijf milliliter EBSS toe aan één papaine-vial uit de dissociatiekit. Elke vial is voldoende om vier tot 15 cerebella van P5-muizen te dissociëren. Plaats de papaine-vial vervolgens gedurende vijf tot 10 minuten in een 5%CO₂ 37 °C incubator totdat de papaine volledig is opgelost en de oplossing helder is.Houd de oplossing tijdens de dissectie op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 500 µL EBSS toe aan het 1D NAS-vial uit de kit. Meng voorzichtig door tegen het vial te tikken.Aangezien DNAS gevoelig is voor denaturatie door afschuiving, voegt u 250 µL van deze oplossing toe aan het flesje pepane om een eindconcentratie van 20 units/ml en 0,005%DNA te verkrijgen; bewaar het resterende DNA-bestand voor gebruik in latere stappen. Zodra de instrumenten en reagentia gereed zijn, gaat u over tot het dissekeren van de cerebella en het verwijderen van de meninges voor deze procedure. C 57 black six muizen worden gebruikt tussen postnatale dag vier en zes.Deze leeftijdscategorie is optimaal voor de kweek van korrelcellen omdat het aantal voorlopercellen van de korrelcellen in de externe korrellaag of EGL maximaal is. Begin met het pipetteren van 15 milliliters HBSS glucose in een plastic weefselkweekschaal van 60 millimeter en 10 milliliters in een steriele conische buis van 15 milliliter. Plaats de buis op ijs en veeg de kop van de pup af met 70% ethanol. Gebruik precisieschaaren om de kop te verwijderen.Plaats de kop in de zuurkast en houd deze met een pincet vast zodat de achterkant van de schedel duidelijk zichtbaar is. Voer de microschaar in via het foramen magnum om toegang te krijgen tot de hersenen en knip vervolgens in een rechte lijn richting de ogen. Gebruik hiervoor een fijne Dumont-pincet.Nummer vijf, een pincet om de huid weg te pellen en de schedel op te tillen om de hersenen bloot te leggen. Knijp vervolgens het cerebellum en het omliggende middenhersenengedeelte af. Breng dit over naar de schaal met HBSS glucose.Let op dat het makkelijker is om het cerebellum te manipuleren en de meninges te verwijderen als het cerebellum nog vastzit aan het omliggende weefsel. Plaats het weefsel vervolgens onder een dissectiemicroscoop. Gebruik daarna één set pincetten om het cerebellum op de plaat te verankeren.Gebruik een fijne Dumont-pincet (nummer vijf) om de hersenvliezen voorzichtig van het cerebellum en tussen de kwabben af te pellen. U zult bloedvaten op het oppervlak van het cerebellum waarnemen.Deze bloedvaten zijn een goede manier om de hersenvliezen te identificeren. Ga door met het verwijderen van de hersenvliezen totdat het cerebellum een viltachtig wit uiterlijk krijgt. Scheid vervolgens het cerebellum van de rest van de midbrain.Draai het om op de ventrale zijde en verwijder de plexus choroideus, die eruitziet als een roodachtig lint tussen het ventrale cerebellum en het aangrenzende middenbrein. Plaats het cerebellum direct na dissectie in koude HBSS glucose in de 15 milliliter conische buis op ijs. Vervang na het dissecteren van drie hersenen de dissectie-oplossing door verse HBSS glucose.Naarmate u meer ervaring krijgt met de dissectie van het cerebellum, dient u te proberen de dissectietijd te beperken tot maximaal zes minuten per pup. Wanneer de dissecties zijn voltooid, gaat u verder met de celsuspensie. Stap om een celsuspensie te genereren uit de cerebellaire dissecties.Verwijder eerst de HBSS-glucose uit de buis en vervang deze door papaine-oplossing. Hoewel de kit adviseert om het weefsel in kleine stukjes te snijden, merken wij dat dit op deze leeftijd niet nodig is. Plaats het weefsel en de papaine-oplossing gedurende 15 tot 20 minuten in een 5%CO 2 37 degree incubator.Incubeer gedurende 15 minuten voor vier tot acht cerebella. Incubeer bij een groter aantal tot een half uur. Schud de buis elke drie tot vier minuten voorzichtig.Zodra de incubatie is voltooid, begint de stap voor de titratie: bekleed een steriele P 1000 aerosolpipetpunt met FBS door twee keer op en neer te pipetteren. Titreer nu het mengsel. Zorg ervoor dat u voorzichtig pipetteert om de vorming van luchtbellen te voorkomen.Ongeveer 10 op-en-neergaande bewegingen met de pipet zijn voldoende om het weefsel te dissociëren. De oplossing moet troebel worden. Laat de suspensie 30 tot 60 seconden staan, zodat eventuele grote stukken niet-gedissocieerd weefsel naar de bodem van de buis zakken.Hoewel vuurgepolijste glazen pipetten kunnen worden gebruikt voor titratie, merken wij dat serumgecoate steriele P 1000 tips net zo goed werken. Verplaats vervolgens de gesuspendeerde cellen naar een nieuwe conische buis van 15 ml met behulp van een serumgecoate pipetpunt; let erop dat de niet-geassocieerde weefselstukjes op de bodem niet worden verwijderd. Centrifugeer daarna de celsuspensie gedurende vijf minuten bij ongeveer 200 G.Bereid bij kamertemperatuur tijdens het centrifugeren het resus-suspensiemedium. Voeg hiervoor 2,7 milliliters EBSS toe in een steriele buis. Voeg vervolgens 300 microliters van de gereconstitueerde albumine OVO MOID-remmeroplossing toe.Voeg tenslotte 150 µL van de DNA-oplossing toe. Zodra de centrifugatie is voltooid, wordt het supernatant weggegooid en wordt de celpellet onmiddellijk geresuspendeerd in de verdunde DNA-albumine-inhibitoroplossing. Gebruik opnieuw een serumgecoate pipetpunt om de pellet te resuspenderen.Bereid nu een discontinue dichtheidsgradiënt voor. Voeg hiervoor vijf milliliter van de albumin oval MOID-remmeroplossing toe aan een conische buis van 15 milliliter. Breng de celсусpensie voorzichtig aan bovenop de oplossing door de cellen langs de wand van de buis toe te voegen en centrifugeer vervolgens gedurende zes minuten bij ongeveer 70 G.Bij kamertemperatuur zullen de gedissocieerde cellen bezinken op de bodem van de buis, terwijl de membraanfragmenten op de interface blijven. Als u culturen wilt verkrijgen die verrijkt zijn met korrelcellen, is verdere zuivering niet nodig. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet onmiddellijk in vier milliliter 10%FBS-medium met 50 microliters DNAs.Filtreer deze suspensie door zwaartekracht door een nylon gaas met een maaswijdte van 70 microns. Deze stap verwijdert grote niet-neurale cellen en zorgt voor een betere enkelcel-suspensie. Sla vervolgens de volgende Percoll-gradiëntscheidingstap over en ga door naar de stap voor het uitplaten van de cellen.Of als u de granulecellen verder wilt zuiveren van glia en grote interneuronen, ga dan over naar de Percoll-gradiëntstap. Verwijder het supernatant en resuspendeer het pellet onmiddellijk in twee milliliter HBSS-glucose met 50 microliters DNase.Filter de suspensie opnieuw door een nylon gaas. Maak twee vuurgepolijste Pasteur-pipetten voordat u begint met de Percoll-gradiëntscheiding. Verhit de punt van een pipet voorzichtig in een vlam totdat de rand glad is en de opening van de pipet ongeveer de helft van de oorspronkelijke grootte heeft. Let erop dat de opening niet te klein wordt.Maak nu de per call-gradiënt. Breng 10 ml van een 35% per call-oplossing over in een steriele conische buis van 50 ml. Vul vervolgens een steriele spuit van 10 ml, voorzien van een steriele spinale naald, met 10 ml van de 60% per call-oplossing.Breng de 60%per call-oplossing voorzichtig aan als laag onder de 35%-oplossing door de tip van de spuit de bodem van de buis te laten raken. Zorg ervoor dat er een scherpe grensvlak tussen de twee lagen behouden blijft. Voeg vervolgens de cellen toe aan de bovenkant van de gradiënt.Voeg de cellen voorzichtig langs de wand van de buis toe met een vuurgepolijste pipet, zonder de interface te verstoren. Plaats de buis na het laagjes vormen zorgvuldig in de centrifuge. Start het centrifugeren bij ongeveer 18 G. Verhoog de snelheid elke 20 seconden met één stap, zodat het ongeveer twee minuten duurt om 1800 G te bereiken. Verlaag na 10 minuten bij 1800 G de snelheid geleidelijk met één stap elke 20 seconden.Wanneer het centrifugeren is voltooid, verwijdert u de bovenste interface van de gradiënt en gooit u deze weg. Deze interface bevat grote ggl bikini cellen en interneuronen. Gebruik vervolgens een vuurgepolijste pipet om de cellen bij de interface voorzichtig te verwijderen.Breng de cellen over naar een buis van 50 ml. Als het volume groter is dan 15 ml, verdeel ze dan over twee buizen van 50 ml, resuspendeer ze in drie volumes HB S'S glucose en meng door meerdere keren te inverteren. Centrifugeer vervolgens vijf minuten bij 1100 G. Verwijder nu het supernatant en voeg vier ml medium toe dat 10% FBS en 50 microliters D ns reus bevat.Resuspendeer het pellet voorzichtig met een vuurgepolijste pipet om een enkelcel-suspensie te vormen. Zodra de cellen zijn geresuspendeerd, kan worden overgegaan tot het platen. De cellen worden geplate op een met poly-D-lysine gecoate schaal gedurende 20 minuten.In een incubator bij 37 °C en 5% CO2. Tijdens de incubatie zullen de astroglia en zwaardere cellen bezinken en aan de schaaltjes hechten, terwijl de kleine granulaire neuronen en neuronale progenitorcellen zullen blijven drijven of slechts losjes gehecht blijven. Tik na 20 minuten voorzichtig tegen het schaaltje om losjes gehechte granulaire cellen los te maken.Breng de celsuspensie vervolgens over naar een nieuwe met poly-D-lysine gecoate plaat en herhaal de incubatie. Verzamel daarna de granulaire neuronen en neuronale progenitorcellen in een conische buis van 15 ml en centrifugeer deze 5 minuten lang bij 200 G. Resuspendeer het pellet vervolgens in 1 ml C-vrij medium en tel de cellen met een hemocytometer.Voeg ten slotte serumvrij medium toe om de gewenste celdichtheid te bereiken voor uitplating bij een medium dichtheid. Voor six wall plates. Gebruik ongeveer 3,5 tot 4 miljoen cellen voor four wall plates.Gebruik 650, 000 cellen. Bewaar de cellen in een incubator van 37 °C met 5%CO2. Vervang het medium volledig 24 uur na het initiële uitplaten, en daarna elke twee tot drie dagen.Hier zijn enkele afbeeldingen van gezonde culturen van granulaire neuronen en progenitorcellen. 24 uur na het uitplaten en zes dagen na het uitplaten. Deze cellen kunnen tot twee weken in cultuur worden gehouden.Let op dat gezonde cellen binnen 24 uur na het uitplaten gelijkmatig rond de dekglasjes of de plastic putjes zullen verspreiden en uitlopers zullen vormen. Celklontering en de aanwezigheid van varicositeiten op de celuitlopers duiden erop dat de cellen ongezond zijn of dat het poly-L-lysinesubstraat toxisch is. Zoals in het diagram te zien is, beginnen granulaire neuronprogenitoren zich na het uitplaten te differentiëren en markers tot expressie te brengen.Representatief voor hun differentiatie. De proliferatie van granule neuron progenitors kan aanzienlijk worden verlengd door sonic hedgehog aan het medium toe te voegen. Laminine kan, naast polylysine, ook als substraat worden toegevoegd om de uitgroei van neurieten te bevorderen.Deze kenmerken van de granulecelcultuur bieden een systeem voor het bestuderen van zowel de biologie van granuleneuronen als de regulatie van de differentiatie van progenitorcellen tot neuronen. We hebben zojuist aangetoond hoe u MAO cerebellaire granule-neuroprogenitoren en neuronen kunt isoleren en kweken. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de geschatte opbrengst 4 2 5 times 10th is.Van de zes cellen per pup en plating-dichtheden kunnen variëren tussen en vijf keer het centrum van de vijf cellen per vierkante centimeter. Dus als de Percoll-gradiëntstap wordt overgeslagen, kunnen acht muispups van postnatale dag vijf voldoende cellen opleveren voor zes 4-wells cultuurplaten. In mijn ervaring zal het gebruik van de Percoll-gradiëntstap de celopbrengst met ongeveer 22-30,5% verminderen. Echter, het percentage granule neuronen in culturen stijgt van 90 naar 95 naar 99%. Verrijkte granule cellen die zijn verkregen zonder de Percoll-gradiëntscheidingsstap zijn gebruikt om de regulatie van de proliferatie en differentiatie van granule neuron progenitorcellen te bestuderen. Indien de culturen echter gedurende meerdere dagen in vitro worden gebruikt, wordt de inclusie van de Percoll-gradiëntstap aanbevolen om de contaminatie van de granule neuronen door prolifererende niet-neuronale cellen te verminderen.Zorg er daarnaast voor dat de oplossingen die worden gebruikt voor het maken van de per cot-gradiënt vers zijn, aangezien onjuiste buffering leidt tot een grotere celdood. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

isolation-culture-post-natal-mouse-cerebellar-granule-neuron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video demonstrates the technique for isolating and culturing primary mouse cerebellar granule neurons. Cells are treated with an antimetabolite to eliminate proliferating glial cells and produce a pure culture of cerebellar granule neurons.

Isolation and Culture of Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

This video demonstrates the isolation and cultivation of cerebellar neural progenitor cells from a mouse pup's cerebellum. Cerebellar granule neuron progenitors are isolated and purified through differential adhesion, effectively removing astrocytes. These cultured progenitors subsequently differentiate into cerebellar granule neurons.

Isolating and Culturing Murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors

This video demonstrates a method for isolating stem cells from the postnatal mouse cerebellum and differentiating them into neural cells. Stem cells from the isolated cell suspension are purified using antibody-coated magnetic beads and are cultured to form neurospheres. The neurospheres are then maintained in a differentiation medium to generate neural cells.

Isolation of Stem Cells from Postnatal Mouse Cerebellum and Differentiation into Neural Cells

This video demonstrates the generation of a neuronal injury model in mouse primary cerebellar granule neurons. It outlines the steps involved in inducing neuronal injury using NMDA, an excitatory neurotransmitter receptor agonist, and glycine, a co-agonist. NMDA and glycine bind to specific neuronal receptors, causing their overstimulation and resulting in a massive intracellular calcium influx, which leads to neuronal cell damage and death.

Modeling Neuronal Injury in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

-Nestin uiten voorouders zijn een nieuw geïdentificeerde populatie van neurale voorlopercellen in de zich ontwikkelende cerebellum. De microdissectie techniek hier gepresenteerd in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering, kan deze celpopulatie worden gezuiverd zonder contaminatie met andere cerebellaire regio's en kunnen worden gekweekt voor verdere studies.

Isolatie van Verschillende celpopulaties uit het ontwikkelen van kleine hersenen door Microdissection

Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.

Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om te isoleren en primaire muisknop cerebrale submodule neuronen (CGNs) van 6-7 dag oud pups, efficiënte transductie van CGNs voor verlies en winst van functie studies, kweken en modellering NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity, lage-kalium-veroorzaakte celdood, DNA-schade en oxidatieve stress met behulp van de zelfde cultuur-model.

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Presenteren we een effectieve en reproduceerbare methode om te isoleren en cultuur van neurale voorlopercellen van embryonale en postnatale hersenweefsel voor chromatine immunoprecipitation (ChIP) van Histon 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - een Histon mark gelegen binnen de bolvormige domein van Histon 3.

Isolatie en teelt van neurale progenitoren gevolgd door chromatine-Immunoprecipitation van Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Het uitvoeren van in vitro experimenten om zo goed mogelijk te reflecteren in vivo omstandigheden is geen gemakkelijke taak. Het gebruik van primaire celculturen is een belangrijke stap naar begrip van celbiologie in een heel organisme. Het meegeleverde protocol schetst hoe succesvol groeien en cultuur embryonale muis cerebellaire neuronen.

Primaire cultuur van neuronen geïsoleerd van embryonale muis cerebellum

Hier gedemonstreerd is een efficiënte en kosteneffectieve methode om witte stof stamcellen te zuiveren, te kweken en te onderscheiden van postnatale muiscerebellum.

Zuivering van Prominin-1+ Stamcellen van postnatale muis Cerebellum

Leer de isolatie en cultuur van cerebellaire korrelneuronen en progenitorcellen uit postnatale muizen. Deze methode omvat dissociatie met papaine, filtratie en centrifugatie op een percoll-gradiënt.

Isolatie en Cultuur van Post-Natal Mouse Cerebellaire Korrel Neuron progenitor cellen en Neuronen

Meer video's verkennen