Name: Ukierunkowana samoorganizacja komórkowa w celu wytworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek do analizy biomechanicznej i inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Poznaj metodę samoorganizacji komórek do tworzenia pierścieni tkankowych z komórek mięśni gładkich w agarozowych studniach PDMS. Technika umożliwia szybką analizę biomechaniczną konstruktów 3D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy wyrażają wdzięczność Neilowi Whitehouse'owi (WPI, Higgins Machine Shop) za pomoc przy obróbce CNC. Dodatkowo chcielibyśmy podziękować Adrianie Herze (WPI Computing and Communications Center) za pomoc w programowaniu w MATLAB, a także Kate Beverage i Josephowi Cotnoirowi (WPI Academic Technology Center) za pomoc w obsłudze programu Camtasia. Sophie Burke i Jacleen Becker (WPI Academic Technology Center) dostarczyły dodatkowe materiały wideo. Praca ta była finansowana przez National Institutes of Health (R15 HL097332), UMass Medical School-WPI Pilot Research Initiative, American Heart Association (stypendium badawcze dla studentów dla J.Z.H.) oraz Worcester Polytechnic Institute (letnie stypendium badawcze dla studentów dla J.Z.H. oraz instytucjonalne fundusze startowe dla M.W.R.).

1. Wykonanie formy do wysiewu komórek
Zacznij od wyfrezowania kawałka poliwęglanu o grubości 1/2", aby utworzyć 15 okrągłych, pierścieniowatych otworów z centralnym słupkiem o średnicy 2 mm. Wyfrezowane kanały mają głębokość 6 mm i szerokość 3,75 mm. Oczyść i osusz formę z poliwęglanu, aby usunąć wszelkie resztki plastiku powstałe w procesie frezowania.
Wymieszaj polidimetylosiloksan (PDMS) w stosunku 10:1 (w/w) bazy do utwardzacza, odgazuj w celu usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza i wlej na formę z poliwęglanu. Odgazuj ponownie, aby usunąć pozostałe pęcherzyki, a następnie utwardzaj w piekarniku w temperaturze 60°C przez 4 godziny.
Po utwardzeniu ostrożnie usuń szablon z PDMS, powoli odrywając go od poliwęglanu, umyj wodą z mydłem i wysterylizuj w autoklawie. W autoklawie wysterylizuj również 2% (w/v) roztwór agarozy rozpuszczonej w pożywce DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium).
Umieść szablon z PDMS na płaskiej powierzchni i wypełnij go stopioną agarozą, pipetując ją najpierw do każdej z form centralnych słupków, a następnie w przestrzeń wokół nich. Pozostaw agarozę do zestalenia (około 15 minut), a następnie odwróć formę, aby oddzielić agarozę od PDMS. Odetnij nadmiar agarozy wokół każdego z dołków i umieść dołki agarowe w płytkach 12-dołkowych.
2. Hodowla komórek i wysiew do pierścieni
Dodaj pożywkę do hodowli komórkowych (DMEM z 10% FBS i 1% penicyliny-streptomycyny) wokół zewnętrznej części formy agarozowej, nie zakrywając górnej części form. Umieść płytki w inkubatorze i pozostaw je do równoważenia przez około 15 minut podczas przygotowywania komórek.
Przy 90% konfluencji poddać komórki mięśni gładkich aorty szczura (rSMCs) trypsynizacji i resuspender do stężenia 5x106 cells/ml. Do każdego z pierścieniowych dołków agarozowych nanieść pipetą 100 μL zawiesiny komórkowej, wykonując ruchy okrężne w celu równomiernego rozprowadzenia komórek w każdym dołku.
Należy upewnić się, że półki w inkubatorze są wypoziomowane, a następnie umieścić płytki w inkubatorze i pozostawić je w spokoju na 24 godziny. Następnie co dwa dni wymieniać pożywkę, odsysając ją z obszaru wokół dołka i ponownie napełniając każdy dołek, aż dołek z agarozą zostanie całkowicie zanurzony.
3. Pobieranie pierścieni tkankowych i pomiary grubości
Po zakończeniu hodowli należy zdjąć pierścień z formy agarowej, przesuwając go nad centralnym wspornikiem.
Umieść pierścień w małej szalce Petriego z solą fosforobufferowaną (PBS), wycentruj próbkę i wykonaj zdjęcie za pomocą cyfrowego systemu obrazowania.
Użyj programu do analizy obrazu w celu detekcji krawędzi i zmierz grubość pierścienia w 4 pozycjach (na górze, na dole, po lewej i po prawej stronie) wzdłuż jego obwodu. Oblicz średnią wartość grubości (t) dla każdego pojedynczego pierścienia i wykorzystaj tę wartość do obliczenia pola przekroju poprzecznego (2π(t/2)2).
4. Badania mechaniczne pierścieni
Ustaw maszynę do badań rozciągania (Instron EPS 1000) w pozycji poziomej. Zamontuj przetwornik siły 1N ±1mN oraz specjalne uchwyty do cienkich drutów (wykonane poprzez zginanie drutu ze stali nierdzewnej).
Zamocuj próbkę w kształcie pierścienia w dwóch cienkich uchwytach drutowych. Rozsuń uchwyty, aż do próbki zostanie przyłożone obciążenie wstępne 5 mN. Wprowadź pole powierzchni przekroju poprzecznego (obliczone na podstawie pomiarów grubości) i zapisz długość pomiarową.
Poddaj pierścienie 8 cyklom wstępnym pomiędzy obciążeniem zerowym a naprężeniem 50 kPa z prędkością 10 mm/min. Po ósmym cyklu wstępnym rozciągnij próbki do zerwania z prędkością 10 mm/min. Zerwanie uznaje się za spadek siły o 40% między jednym pomiarem a kolejnym. Dla każdej próbki pierścienia zmierz wytrzymałość na rozciąganie (UTS) oraz odkształcenie przy zerwaniu, a następnie oblicz maksymalny moduł styczny (MTM) na podstawie uzyskanych danych.
5. Montaż pierścieni tkankowych w celu wytworzenia rurek tkankowych
Niestandardowe uchwyty na probówki są wycinane z okrągłych dysków z poliwęglanu o średnicy 5 cm z prostokątnymi wycięciami (2 cm x 3 cm). W dyskach tych należy nawiercić otwory z gwintem, aby umożliwić skręcenie dwóch uchwytów ze sobą. Uchwyty na probówki należy wysterylizować w autoklawie, a następnie przenieść do komory bezpieczeństwa biologicznego i umieścić w pustej płytce Petriego.
Za pomocą nożyczek chirurgicznych należy odciąć końce rurek silikonowych o średnicy 1.9 mm pod kątem, aby uzyskać ścięte krawędzie, a następnie poddać rurki silikonowe autoklawowaniu. Podczas autoklawowania rurek należy wypełnić szalkę Petriego pożywką.
Wyjmij pierścienie z dołków w agarozie i umieść je w płytce Petriego z pożywką. W tej samej płytce Petriego umieść autoklawowane rurki silikonowe, aby zwilżyć je przed użyciem.
Używając pęsety, umieść ścięty koniec rurki silikonowej w centrum pierścienia i ostrożnie nasuń pierścień na rurkę. Powtórz tę czynność dla pożądanej liczby pierścieni. Przesuń pierścienie tak, aby stykały się ze sobą, delikatnie popychając je sukcesywnie w obu kierunkach wzdłuż rurki. Metodę tę można zastosować w przypadku pierścieni pobranych już po jednym dniu hodowli.
Po zamontowaniu pierścieni należy wyrównać rurki silikonowe w uchwytach z poliwęglanu i skręcić obie części uchwytu. Umieść uchwyt w 100 mm czalce Petriego i dodaj 55 mL pożywki. Wymieniaj pożywkę co 3 dni przez cały czas trwania hodowli.
Aby wyjąć probówki z tkanką, należy zwolnić rurki silikonowe z uchwytu poliwęglanowego, a następnie za pomocą pęsety zsunąć probówki z tkanką z rurek silikonowych do szalki Petriego wypełnionej PBS.
6. Reprezentatywne wyniki:
Przy prawidłowym wykonaniu protokołu komórki agregują, tworząc pierścienie tkankowe o średnicy wewnętrznej odpowiadającej średnicy odpowiedniego trzpienia formy w ciągu 24 godzin. Krawędzie pierścieni są zazwyczaj gładkie i (jeśli są hodowane na płaskiej powierzchni) mają jednolitą grubość w całym obwodzie. Pierścienie tkankowe są łatwe w obsłudze i można je usunąć z dołków w celu przeprowadzenia późniejszych analiz mechanicznych i histologicznych (patrz Gwyther et al., 20118). Morfologia pierścienia tkankowego, skład macierzy oraz właściwości mechaniczne różnią się w zależności od liczby i rodzaju wysianych komórek.
Reprezentatywne wyniki dla pierścieni tkankowych wykonanych z różnych typów komórek, w różnych warunkach wysiewu i o różnym czasie hodowli przedstawiono w Tabeli 1. Pierścienie o średnicy wewnętrznej 2 mm stworzone z 5x105 rSMC wykazywały wyższe UTS niż pierścienie o średnicy 2 mm opisane w naszej poprzedniej publikacji (wykonane z 6,6x105 rSMC).8 Podobnie jak komórki szczura, ludzkie komórki mięśni gładkich (hSMC) łatwo agregowały, tworząc pierścienie tkankowe, które po zaledwie 14 dniach hodowli zawierały dużą ilość kolagenu (dane nie zostały przedstawione). Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) również agregowały i tworzyły spójne pierścienie, lecz nie posiadały one wytrzymałości mechanicznej i pękały podczas początkowych faz wstępnego cyklowania w testach jednowymiarowego rozciągania.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>n</td>
			<td>Liczba komórek</td>
			<td>Grubość (mm)</td>
			<td>Czas hodowli (dni)</td>
			<td>UTS (kPa)</td>
			<td>MTM (kPa)</td>
			<td>Odkształcenie przy zerwaniu (mm/mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pierścienie rSMC</td>
			<td>6</td>
			<td>660,000</td>
			<td>0.94±0.12</td>
			<td>14</td>
			<td>97±30</td>
			<td>497±91</td>
			<td>0.50±0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pierścienie rSMC</td>
			<td>4</td>
			<td>500,000</td>
			<td>0.53±0.02</td>
			<td>7</td>
			<td>113±8</td>
			<td>189±15</td>
			<td>0.88±0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pierścienie hSMC</td>
			<td>3</td>
			<td>750,000</td>
			<td>0.51±0.05</td>
			<td>14</td>
			<td>160±30</td>
			<td>270±20</td>
			<td>0.92±0.08</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pierścienie hMSC</td>
			<td>3</td>
			<td>750,000</td>
			<td>0.40±0.07</td>
			<td>14</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>Nie dotyczy</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Tabela przedstawiająca parametry hodowli i właściwości mechaniczne pierścieni o średnicy 2 mm wytworzonych z różnych typów komórek, przy różnych stężeniach wysiewu i czasie trwania hodowli.
<img alt="Proces hodowli komórkowej; tworzenie pierścienia tkankowego z form PDMS; schemat z układem eksperymentalnym." src="/files/ftp_upload/3366/3366fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. (A) Schemat procesu tworzenia pierścienia tkankowego. (B) Specjalna forma z poliwęglanu z frezowanymi wgłębieniami pierścieniowymi. Średnice centralnych słupków wynoszą 2 mm. (C) Matryca PDMS po oddzieleniu od formy z poliwęglanu. (D) Zagregowany pierścień tkankowy hodowany w formie agarozowej ze słupkiem o średnicy 2 mm. (E) Pierścień tkankowy o średnicy 2 mm w PBS. Paski skali = 6 mm (B, C) oraz 2 mm (D, E).
<img alt="Wykres naprężenia i odkształcenia; analiza mechaniczna; UTS; pomiar naprężenia; wykres właściwości materiałowych." src="/files/ftp_upload/3366/3366fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywny wykres krzywej naprężenie-odkształcenie uzyskany z jednowymiarowej próby rozciągania.

<ol><li>Roger, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2011+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Kelm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+concept+for+scaffold-free+vessel+tissue+engineering%3A+self-assembly+of+microtissue+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks.</a> J. Biotechnol. 148, 46-55 (2010).</li>
<li>Gauvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-step+self-assembly+approach+for+the+fabrication+of+tissue-engineered+vascular+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">A novel single-step self-assembly approach for the fabrication of tissue-engineered vascular constructs.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 1737-1747 (2010).</li>
<li>L'Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+blood+vessel+for+adult+arterial+revascularization%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.</a> N. Engl. J. Med. 357, 1451-1453 (2007).</li>
<li>Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-free+vascular+tissue+engineering+using+bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting.</a> Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).</li>
<li>Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rods%2C+tori%2C+and+honeycombs%3A+the+directed+self-assembly+of+microtissues+with+prescribed+microscale+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries.</a> FASEB. J. 21, 4005-4012 (2007).</li>
<li>Livoti, C. M., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+and+tissue+fusion+of+toroid-shaped+minimal+building+units%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng.+Part.+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly and tissue fusion of toroid-shaped minimal building units.</a> Tissue. Eng. Part. A. 16, 2051-2061 (2010).</li>
<li>Gwyther, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+vascular+tissue+fabricated+from+aggregated+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Tissues.+Organs%22%5BJournal%5D)">Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells.</a> Cell. Tissues. Organs. 194, 13-24 (2011).</li>
<li>Seliktar, D., Black, R. A., Vito, R. P., Nerem, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+mechanical+conditioning+of+collagen-gel+blood+vessel+constructs+induces+remodeling+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Dynamic mechanical conditioning of collagen-gel blood vessel constructs induces remodeling in vitro.</a> Ann. Biomed. Eng. 28, 351-362 (2000).</li>
<li>Rowe, S. L., Stegemann, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpenetrating+collagen-fibrin+composite+matrices+with+varying+protein+contents+and+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Interpenetrating collagen-fibrin composite matrices with varying protein contents and ratios.</a> Biomacromolecules. 7, 2942-2948 (2006).</li>
<li>Pins, G. D., Collins-Pavao, M. E., De Water, L. V. an, Yarmush, M. L., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+triggers+rapid+contraction+and+degradation+of+fibroblast-populated+collagen+lattices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Plasmin triggers rapid contraction and degradation of fibroblast-populated collagen lattices.</a> J. Invest. Dermatol. 114, 647-653 (2000).</li>
<li>Konig, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+completely+autologous+human+tissue+engineered+blood+vessels+compared+to+human+saphenous+vein+and+mammary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.</a> Biomaterials. 30, 1542-1550 (2009).</li>
<li>Mironov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W ostatnim czasie wzrosło zainteresowanie metodami inżynierii tkankowej opartymi na komórkach lub „bezruszturowymi” (ang. scaffold-less), aby rozwiązać niektóre ograniczenia podejść opartych na zastosowaniu rusztowań. Biorąc pod uwagę, że tkanki pochodzenia komórkowego tworzone są z komórek i produkowanej przez nie macierzy, charakteryzują się one naturalnie znacznie wyższą gęstością komórkową, nie zawierają materiałów egzogennych i mogą składać się w całości z ludzkich komórek i białek. Przeszczepy naczyniowe wykonane z ludzkich komórek mogą osiągnąć znaczną wytrzymałość mechaniczną w przypadku braku egzogennych rusztowań (np. ciśnienie rozrywania 3400 mmHg w porównaniu do 1600 mmHg dla ludzkich żył sapanowych)12. Chociaż naczyniowe tkanki oparte na komórkach wykazują lepszą gęstość komórkową i wytrzymałość mechaniczną, większość obecnych metod wytwarzania (takich jak „inżynieria oparta na arkuszach"3,4,12 lub „biodruk"5,13) wymaga długich okresów hodowli (&gt; 3 miesiące) lub specjalistycznego sprzętu do konstrukcji tkanek 3D. Opisana tutaj metoda pierścienia tkanki pochodzenia komórkowego umożliwia szybką samoorganizację komórkową w celu utworzenia wytrzymałych konstrukcji tkankowych 3D w krótkim czasie i bez użycia specjalistycznego sprzętu.
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje procedurę opracowaną przez nas w celu wytworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek mięśni gładkich szczura o średnicy wewnętrznej 2 mm. W niniejszym przykładzie pierścienie tkankowe hodowano przez 7 dni (a następnie przez kolejne 7 dni w celu fuzji pierścieni i tworzenia cewek). Jednak pierścienie z komórek mięśni gładkich szczura (i człowieka) o średnicy 2 mm można usunąć z dołków; są one wystarczająco spójne do manipulacji (np. przeniesienia na rurki silikonowe) już jeden dzień po wysianiu komórek. Ponadto za pomocą tej metody można tworzyć wytrzymałe pierścienie tkankowe o różnych średnicach wewnętrznych (2, 4 i 6 mm), zmieniając po prostu średnicę trzpienia oryginalnej formy poliwęglanowej.8 Niedawno zmodyfikowaliśmy również projekt formy poliwęglanowej, aby umożliwić odlew pięciu dołków do wysiewu o średnicy 2 mm w jednej wielodołkowej komorze agarozowej, co pozwala na zużycie mniejszej ilości PDMS i agarozy oraz mieści się w jednym dołku płytki 6-dołkowej (dane nie przedstawiono). Zmiany średnicy trzpienia, szerokości dołka do wysiewu, promienia krzywizny zaokrąglonego dna, liczby dołków do wysiewu lub głębokości dołków do wysiewu można wprowadzać po prostu poprzez zmianę specyfikacji w pliku CAD do obróbki CNC formy poliwęglanowej. Wreszcie, pojedyncza forma poliwęglanowa może służyć do wykonania nieograniczonej liczby szablonów z PDMS, a każdy szablon z PDMS można czyścić, autoklawować i ponownie wykorzystywać kilkadziesiąt razy.
Oprócz zmiany rozmiaru pierścieni tkankowych, wykonaliśmy pierścienie z wielu różnych typów komórek, w tym: pierwotnych komórek mięśni gładkich (SMC) szczura (Cell Applications, R354-05), pierwotnych komórek mięśni gładkich ludzkiej tętnicy wieńcowej (Lonza, CC-2583), pierwotnych ludzkich fibroblastów skórnych11 (dar od dr. George'a Pinsa, WPI Dept. of Biomedical Engineering), fibroblastów płuc szczura (RFL-6, ATCC CCL-192) oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (Lonza, PT-2501). Każdy z tych typów komórek agreguje i kurczy się wokół centralnych słupków, tworząc pierścienie tkankowe; przy czym organizacja komórkowa, skład macierzy pozakomórkowej (ECM) oraz właściwości mechaniczne konstruktów różnią się dla każdego typu komórek. Parametry siewania dla każdego typu komórek muszą zostać określone empirycznie na podstawie rozmiaru komórek oraz ich zdolności do agregacji. Zatem, choć ten system tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego jest niezwykle wszechstronny, protokół może wymagać niewielkich modyfikacji w celu optymalnego formowania tkanki w przypadku różnych typów komórek.
Geometria pierścienia tkankowego ułatwia załadunek i ocenę właściwości materiałowych tkanki za pomocą opisanego badania rozciągania jednowymiarowego. Istnieje również znaczący precedens wykorzystywania pierścieniowych segmentów naczyń krwionośnych do pomiaru skurczu naczyniowego i funkcji fizjologicznych. Badania wstępne wskazują, że pierścienie tkankowe pochodzenia komórkowego mogą być montowane na urządzeniu do miografii drucianej w celu pomiaru odpowiedzi farmakologicznej i generowania siły skurczu (dane nie przedstawiono). Podsumowując, możliwość szybkiego wytwarzania samorzutnie organizujących się pierścieni komórkowych do analiz histologicznych, mechanicznych, fizjologicznych i biochemicznych sugeruje istnienie potężnego nowego narzędzia, które może być przydatne w modelowaniu struktury i funkcji tkanki naczyniowej w stanie zdrowia i choroby.

<table><tbody><tr><td>Polydimetylosiloksan (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Lonza Inc.</td><td>50000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A05-201</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania cyfrowego</td><td>DVT Corporation</td><td>Model 630</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna do badań jednowymiarowych</td><td>Instron</td><td>ElectroPuls E1000</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do detekcji krawędzi</td><td>DVT Corporation</td><td>Framework 2.4.6</td><td></td></tr></tbody></table>

kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Directed Cellular Self-Assembly to Fabricate Cell-Derived Tissue Rings for Biomechanical Analysis and Tissue Engineering

Co roku w Stanach Zjednoczonych setki tysięcy pacjentów przechodzi operację pomostowania tętnic wieńcowych.1 Około jednej trzeciej tych pacjentów nie posiada odpowiednich autologicznych naczyń dawcy ze względu na postęp choroby lub wcześniejsze pobrania. Celem inżynierii tkankowej naczyń jest opracowanie odpowiedniego alternatywnego źródła dla tych pomostów naczyniowych. Ponadto inżynieryjnie wytworzona tkanka naczyniowa może okazać się cenna jako żywe modele naczyniowe do badania chorób układu sercowo-naczyniowego. Zbadano kilka obiecujących podejść do inżynierii naczyń krwionośnych, przy czym wiele niedawnych badań koncentruje się na opracowaniu i analizie metod opartych na komórkach.2-5 W niniejszej pracy przedstawiamy metodę szybkiego samoorganizowania komórek w trójwymiarowe pierścienie tkankowe, które mogą być wykorzystywane in vitro do modelowania tkanek naczyniowych.
Aby to osiągnąć, zawiesiny komórek mięśni gładkich wysiewa się do okrągłych, pierścieniowych dołków agarozowych. Nieprzylepne właściwości agarozy pozwalają komórkom osiaść, zagregować się i skurczyć wokół słupka znajdującego się w centrum dołka, tworząc spójny pierścień tkankowy.6,7 Pierścienie te mogą być hodowane przez kilka dni przed pobraniem do analizy mechanicznej, fizjologicznej, biochemicznej lub histologicznej. Wykazaliśmy, że te pochodzące z komórek pierścienie tkankowe osiągają wytrzymałość na rozciąganie rzędu 100-500 kPa8, co przekracza wartość raportowaną dla innych konstruktów naczyniowych inżynierii tkankowej hodowanych przez podobny czas (&lt;30 kPa).9,10 Nasze wyniki pokazują, że w krótkim czasie można uzyskać trwałe pierścienie tkanki naczyniowej pochodzenia komórkowego, co stwarza możliwość bezpośredniej i ilościowej oceny wkładu komórek oraz macierzy pochodzenia komórkowego (CDM) w strukturę i funkcję tkanki naczyniowej.

Niniejszy artykuł przedstawia wszechstronną metodę tworzenia pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego poprzez samoorganizację komórkową. Komórki mięśni gładkich zasiane w pierścieniowatych studzienkach agarozowych agregują i kurczą się, tworząc wytrzymałe tkanki trójwymiarowe (3D) w ciągu 7 dni. Pierścienie tkankowe o skali milimetrowej nadają się do testów mechanicznych i służą jako podstawowe elementy do montażu tkanek.

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Co roku w Stanach Zjednoczonych setki tysięcy pacjentów przechodzi operację pomostowania tętnic wieńcowych.1 Około jedna trzecia tych pacjentów ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie trójwymiarowych konstrukcji tkankowych z zagregowanych komórek i macierzy pochodzenia komórkowego, które mogą być wykorzystane do analiz funkcjonalnych. Jest to osiągane poprzez najpierw wyfrezowanie formy z poliwęglanu w celu utworzenia pierścieniowych studni o zaokrąglonym dnie. Następnie na formie z poliwęglanu odlewa się polidimetylosiloksan (PDMS), aby stworzyć szablon.Następnie matryca PDMS służy do formowania studniek aros. Ostatnim krokiem jest wysianie komórek do studniek aros, aby umożliwić im agregację i utworzenie spójnych pierścieni tkankowych. Ostatecznie metoda ta może być wykorzystana do osiągnięcia samoorganizacji komórkowej oraz inżynierii tkankowej z wykorzystaniem różnych typów komórek, a także umożliwia analizę wkładu komórek i pochodzonej od nich macierzy pozakomórkowej w strukturę i funkcję tkanki.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi podejściami w inżynierii tkankowej jest możliwość generowania konstruktów tkankowych w całości z komórek i produkowanej przez nie macierzy zewnątrzkomórkowej w czasie krótszym niż zgłaszano wcześniej, oraz w formacie sprzyjającym analizie mechanicznej. Rozpocznij od wyfrezowania kawałka poliwęglanu o grubości pół cala w celu utworzenia 15 okrągłych studni pierścieniowych z centralnym trzpieniem o średnicy 2 mm. Oczyść formę poliwęglanową, aby usunąć wszelkie odpryski tworzywa powstałe podczas procesu frezowania, i pozostaw ją do wyschnięcia. Następnie wymieszaj PDMS w stosunku bazy do utwardzacza 10:1. Odpowietrz roztwór, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie wlej go do formy poliwęglanowej.Następnie ponownie odgazuj mieszaninę na formie, aby usunąć pozostałe pęcherzyki powietrza, i utwardzaj PDMS w piekarniku w temperaturze 60 °C przez cztery godziny; w czasie utwardzania PDMS rozpuść 2% AROS w DMEM. Po utwardzeniu ostrożnie usuń szablon PDMS, powoli odrywając go od poliwęglanu, następnie umyj PDMS wodą z mydłem i wysterylizuj w autoklawie wraz z roztworem DMEM AROS. Teraz umieść wysterylizowany szablon PDMS na płaskiej powierzchni i wypełnij go stopionym AROS, wprowadzając go najpierw pipetą do każdej z form na środkowe słupki, a następnie pipetą do przestrzeni wokół nich.Pozostaw arosy do utwardzenia przez około 15 minut. Następnie odwróć formę, aby oddzielić arosy od PDMS. Odetnij nadmiar arosów z okolic każdej z studni, a następnie umieść jedną studnię aros w każdej studni płytki 12-dołkowej.Dodaj pożywkę do hodowli komórkowej wokół zewnętrznej części studni aros, nie zakrywając jej górnej części. Następnie umieść płytki w inkubatorze, aby mogły się ustabilizować w czasie przygotowywania komórek. Przy 90% konfluencji poddaj szczury mięśni gładkich aorty trypsynizacji i resuspenduj.Zawiesić komórki w stężeniu 5 × 10⁶ komórek na ml. Następnie pipetą przenieść 100 µl resuspendTime zawiesiny komórkowej do każdej z równoważących się studzienek aros. Komórki nanosić do studninek wykonując ruchy okrężne.Umieść płytki w inkubatorze na 24 godziny, nie zakłócając ich stanu. Wymieniaj pożywkę co dwa dni, odsysając ją z okolic studni, a następnie ponownie napełniając każdą studnię, aż forma aros zostanie całkowicie zanurzona. Po zakończeniu hodowli napełnij małą szalkę Petriego roztworem PBS.Wyjmij każdy pierścień z formy aros, przesuwając go przez górną część centralnego wspornika. Umieść pierścienie w szalkach Petriego z PBS Center, a jeden z pierścieni pod cyfrowym systemem obrazowania. Użyj oprogramowania do detekcji krawędzi, aby zmierzyć grubość pierścienia w czterech pozycjach: górnej, dolnej, lewej i prawej części jego obwodu.W celu przeprowadzenia jednoosiowej próby rozciągania zamocuj próbkę w kształcie pierścienia w dwóch uchwytach z cienkiego drutu. Rozsuwaj uchwyty, aż do momentu przyłożenia do pierścienia obciążenia rozdzierającego równego 5 mN.Następnie wprowadź pole przekroju poprzecznego obliczone na podstawie pomiarów grubości i zapisz długość rozciągania. Poddaj pierścień ośmiokrotnemu cyklowaniu pomiędzy obciążeniem rozdzierającym a 50 kPa. Przyłóż naprężenie z prędkością 10 mm/min; po ósmym cyklu wstępnym rozciągnij próbkę do zerwania z prędkością 10 mm/min.Dla każdego pierścienia zmierz maksymalne naprężenie rozciągające oraz odkształcenie krytyczne, a następnie na podstawie uzyskanych danych oblicz maksymalny moduł styczności. Oprócz funkcjonalnych badań in vitro, te pierścienie z żywych komórek mogą również łączyć się, tworząc tkankowe rurki. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby ściąć końce rurek silikonowych pod kątem w celu utworzenia skosowanych krawędzi, a następnie poddaj rurki silikonowe autoklawowaniu.Napełnij szalkę Petriego pożywką, przenieś wysterylizowane uchwyty z niestandardowych rurek silikonowych do komory z laminarnym przepływem powietrza i umieść je w pustej szalce Petriego. Następnie wyjmij pierścienie z dołków aros i umieść je w szalce Petriego wypełnionej pożywką. Umieść rurki silikonowe w tej samej szalce Petriego, aby je nawilżyć przed użyciem.Za pomocą pęsety umieść końcówkę rurki silikonowej w centrum pierścienia i delikatnie nasuń pierścień na rurkę silikonową. Przesuń pierścienie tak, aby stykały się ze sobą, delikatnie popychając je sukcesywnie w obu kierunkach wzdłuż rurki. Po zamontowaniu pierścieni ustaw rurki silikonowe w uchwytach z poliwęglanu i skręć obie części uchwytu.Do szalki Petriego dodaj 55 mililitrów pożywki. Wymieniaj pożywkę co trzy dni przez cały okres hodowli w celu usunięcia probówek z tkankami. Najpierw napełnij szalkę Petriego roztworem PBS.Następnie zwolnij rurki silikonowe z uchwytu poliwęglanowego i za pomocą pęsety zsuń rurki tkankowe z rurek silikonowych do naczynia. Przy prawidłowym wykonaniu komórki osiadają na dnie studni aros i kurczą się w ciągu 24 godzin od osadzenia, tworząc pierścień tkanki wokół centralnego słupka w studni Agarro; przedstawiony wykres jest reprezentatywną krzywą naprężenie-odkształcenie otrzymaną z jednowymiarowej próby rozciągania dwumilimetrowego pierścienia tkankowego wytworzonego z komórek mięśni gładkich szczura. Wartości wytrzymałości doraźnej na rozciąganie, maksymalnego modułu sprężystości oraz odkształcenia krytycznego są następnie wykorzystywane do porównania właściwości mechanicznych próbek pierścieni tkankowych hodowanych przy różnych parametrach kultury.Właściwości mechaniczne pierścieni tkankowych można kontrolować poprzez zmianę parametrów hodowli, w tym liczby wysianych komórek, czasu trwania hodowli, pożywki hodowlanej oraz zastosowanego typu komórek. Oprócz szczurzych komórek mięśni gładkich, ludzkie pierwotne komórki mięśni gładkich tworzą pierścienie tkankowe o podobnej wytrzymałości na rozciąganie.Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste również agregują, tworząc pierścienie, jednak nie były one wystarczająco wytrzymałe do przeprowadzenia testów mechanicznych. Nasz system umożliwia wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkankowych w całości z komórek poprzez proste wysiewanie ich do naszych dedykowanych studzienek aros. Po obrobieniu początkowej formy z poliwęglanu możemy wykonać nieograniczoną liczbę szablonów z PDMS, które następnie służą do tworzenia form, dzięki czemu nie jest wymagany żaden dodatkowy sprzęt.System ten jest wszechstronny, ponieważ wykorzystaliśmy w nim szereg różnych typów komórek do tworzenia pierścieni tkankowych; w związku z tym może on potencjalnie służyć zarówno w zastosowaniach z zakresu inżynierii tkankowej, jak i w badaniach in vitro nad wkładem komórek oraz macierzy zewnątrzkomórkowej w strukturę i funkcję tkanek.

directed-cellular-self-assembly-to-fabricate-cell-derived-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Kierowana samozbierająca się komórka w celu wytworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek dla analizy biomechanicznej i inżynierii tkankowej

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Ten protokół opisuje metodologię biodruku przy użyciu zautomatyzowanego zrobotyzowanego systemu deponowania, który łączy wytrawione wskazówki topograficzne z precyzyjnym osadzaniem biotuszu z hydrożelu na komórce. Wydrukowane komórki są dostarczane bezpośrednio do wytrawionych elementów i są w stanie je wyczuć i zorientować się w sytuacji.

Zautomatyzowana zrobotyzowana technika dozowania do prowadzenia powierzchni i biodruku komórek

Skalowalne naczynia krwionośne poprawiłyby możliwości zastosowania klinicznego. Korzystając z łatwo zwymiarowanych prowadnic drukowanych w 3D, stworzono pierścienie mięśni gładkich naczyń krwionośnych i ułożono je w formę rurkową, tworząc przeszczep naczyniowy. Przeszczepy można dobrać tak, aby spełniały zakres wymiarów ludzkich tętnic wieńcowych, po prostu zmieniając rozmiar prowadnicy wydrukowanej w 3D.

Skalowanie zaprojektowanych przeszczepów naczyniowych przy użyciu prowadnic drukowanych w 3D i metody układania pierścieni

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Tutaj prezentujemy szybką, łatwą i tanią metodę wytwarzania niestandardowych form polidimetylosiloksanowych, które mogą być używane do produkcji hydrożelowych tkanek inżynieryjnych o skomplikowanej geometrii. Dodatkowo opisujemy wyniki ocen mechanicznych i histologicznych przeprowadzonych na zmodyfikowanych tkankach serca wytworzonych tą techniką.

Specjalnie zaprojektowane formy do kultur tkankowych od mistrzów trawionych laserowo

Pokazujemy nowatorską metodę konstruowania jednokomórkowego trójwymiarowego (3D) montażu bez sztucznego rusztowania.

Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Tutaj demonstrujemy trzyetapowy model organoidów (dwuwymiarowa ekspansja [2D], stymulacja 2D, trójwymiarowe dojrzewanie [3D]), oferujący obiecujące narzędzie do podstawowych badań nad ścięgnami i potencjalną metodę inżynierii tkanek ścięgien bez rusztowań.

Demonstracja samoorganizującej się hodowli arkuszy komórkowych i ręcznego generowania organoidu 3D przypominającego ścięgno/więzadło przy użyciu ludzkich fibroblastów skórnych

Poznaj metodę samoorganizacji komórek do tworzenia pierścieni tkankowych z komórek mięśni gładkich w agarozowych studniach PDMS. Technika umożliwia szybką analizę biomechaniczną konstruktów 3D.

Ukierunkowana samoorganizacja komórkowa w celu wytworzenia pierścieni tkankowych pochodzących z komórek do analizy biomechanicznej i inżynierii tkankowej (Wideo) | JoVE Journal

Kierowana samoorganizacja komórkowa w celu wytwarzania pierścieni tkankowych pochodzenia komórkowego do analiz biomechanicznych i inżynierii tkankowej

Przeglądaj więcej filmów