Name: winogradsky column microbial layers and gradients
Uploaded: 2023-04-30T07:09:27.000Z
Duration: 8 min 8 s
Channel: JoVE

1. Ustawienie
<ol>
	<li>Aby skonfigurować kolumnę Winogradsky, będziesz potrzebować kilku podstawowych materiałów:
	<ul>
		<li>Łopata, wiadro i butelka do zbierania próbek w terenie</li>
		<li>Pionowe, przezroczyste naczynie, takie jak cylinder z podziałką lub plastikowa butelka na wodę o pojemności około 1 litra</li>
		<li>Folia i gumki</li>
		<li>duże miski do mieszania i duża łyżka do mieszania</li>
		<li>Źródło siarki (żółtko jaja lub siarczan wapnia)</li>
		<li>Źródło węgla organicznego (celuloza, w postaci rozdrobnionej gazety)</li>
		<li>Źródło światła (nasłonecznione okno lub lampa biurkowa)</li>
		<li>Gleba lub błoto zebrane z bagna, mokradeł, stawu lub strumienia</li>
		<li>Woda z tego samego siedliska</li>
		<li>OPCJONALNIE W przypadku niektórych opcjonalnych eksperymentów opisanych w niniejszym protokole konieczne będzie:
		<ul>
			<li>Sól kuchenna</li>
			<li>Celofan w różnych kolorach</li>
			<li>Źródło żelaza (takie jak gwóźdź lub wełna stalowa)</li>
			<li>Lodówka ze źródłem światła</li>
			<li>Grzejnik w pobliżu źródła światła</li>
		</ul>
		</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Jeśli używasz plastikowej butelki na wodę, odetnij obszar szyjki tak, aby kolumna miała kształt cylindryczny. Usuń wszelkie opakowania, aby światło mogło przenikać przez plastik. </li>
	<li>Surowe jaja mogą zawierać Salmonella i należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Należy przestrzegać odpowiednich technik mycia rąk. Alternatywnie można użyć jajka na twardo. Ponadto nie ma sposobu, aby dowiedzieć się na pewno, czy błoto lub osad jest zanieczyszczony ściekami lub inną szkodliwą substancją. Podczas mieszania błota i ustawiania kolumny należy używać rękawiczek. </li>
</ol>
2. Montaż kolumny Winogradsky
<ol>
	<li>Za pomocą łopaty wykop i zbierz błoto do wiadra. Osady powinny znajdować się blisko brzegu wody i być całkowicie nasycone wodą. Będziesz potrzebował wystarczająco dużo błota, aby wypełnić każdą kolumnę Winogradsky'ego. Zebrać trochę wody z tego samego źródła do butelki z próbką (potrzebne jest około 3000 ml na kolumnę). </li>
	<li>W laboratorium przenieś wystarczającą ilość błota do pierwszej miski do mieszania, aby wypełnić ~ 75% 1-litrowej kolumny objętościowej. Następnie przesiej, aby usunąć duże kamienie, gałązki lub liście, używając łyżki do rozbijania grudek. </li>
	<li>Dodaj trochę zebranej wody do miski miksującej, mieszając. Dodawaj, aż konsystencja mieszanki wodno-błotnej będzie jak koktajl mleczny. Kontynuuj, aby upewnić się, że nie ma grudek. </li>
	<li>Przełóż około 1/3 koktajlu mlecznego wodno-błotnego do drugiej miski. Dodaj żółtko i garść rozdrobnionej gazety i wymieszaj. </li>
	<li>Dodaj mieszaninę błota, żółtka jaja i gazety do kolumny, aż kolumna będzie wypełniona w około 1/4. </li>
	<li>Dodaj zwykłą mieszankę wody i błota do kolumny, aż kolumna będzie wypełniona w około 3/4. </li>
	<li>Dodaj dodatkową wodę do kolumny, pozostawiając tylko niewielką przestrzeń (~ 1/2 cala) powietrza na górze. </li>
	<li>Przykryj kolumnę folią i zabezpiecz gumką. </li>
	<li>Inkubować kolumnę w świetle w temperaturze pokojowej. </li>
	<li>Przez następne 4 do 8 tygodni monitoruj zmiany w kolumnie Winogradsky'ego pod kątem rozwoju różnych kolorowych warstw i tworzenia pęcherzyków, jak opisano w Tabeli 1. Dodatkowo należy rejestrować czas potrzebny na rozwinięcie się różnych warstw. </li>
</ol>
3. Opcjonalne modyfikacje klasycznej kolumny Winogradsky'ego
<ol>
	<li>Dodaj 25-50 g soli na 1 litr kolumny Winogradsky'ego do zebranego błota przed dodaniem wody i wymieszaniem (krok 2.3). Dodatek soli selekcjonuje bakterie halofilne (kochające sól). </li>
	<li>Alternatywne podłoża, takie jak żelazo, w postaci gwoździa lub wełny stalowej, można dodać do kolumny wraz z żółtkiem jaja i rozdrobnioną gazetą (krok 2.4). Wzbogaci to bakterie utleniające żelazo, takie jak Gallionella, i pojawią się jako rdzawa warstwa. </li>
	<li>Zamiast temperatury pokojowej (krok 2.9), kolumnę można inkubować w pobliżu kaloryfera, aby wybrać bakterie ciepłolubne (ciepłolubne) lub w lodówce ze źródłem światła, aby wybrać bakterie psychrofilne (kochające zimno). </li>
	<li>Ilość światła, jaką otrzymuje kolumna podczas inkubacji (krok 2.9), można również zmieniać, umieszczając różne kolumny w silnym świetle, słabym świetle lub ciemności. </li>
	<li>Długość fali wpadającego światła można ograniczyć, pokrywając kolumnę różnie cieniowanymi celofanami podczas inkubacji (krok 2.9) w celu określenia, które kolory wybierają dla różnych grup bakterii. </li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Po 1-3 tygodniach powinno być widoczne zielone zabarwienie na wierzchu warstwy błota klasycznej kolumny Winogradsky'ego (ryc. 2A). Są to pierwsze oznaki rozrastania się warstwy sinicy. </li>
	<li>Z biegiem czasu kontynuuj monitorowanie wyglądu i ewolucji różnych warstw, z których każda wskazuje na różne typy bakterii. WSKAZÓWKA: Zapoznaj się z pojęciami i Tabelą 1, aby zrozumieć, które bakterie przyczyniają się do powstania różnych warstw. </li>
</ol>
<img alt="Figure 2A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig2a.jpg"> 
Rysunek 2A: Zdjęcie klasycznej kolumny Winogradsky'ego, która inkubowała w temperaturze pokojowej przez 21 dni. Zwróć uwagę na zielony osad, wskazujący na obecność sinic, w górnej części kolumny. 
<ol start="3">
	<li>Jeśli przygotowano również modyfikacje klasycznej kolumny Winogradsky'ego, porównaj wyniki każdej kolumny.
	<ol>
		<li>Obserwuj warstwy w każdej ze zmodyfikowanych kolumn Winogradsky'ego. Zwróć uwagę na następujące kwestie:
		<ul>
			<li>Czy kolumny mają taką samą liczbę warstw? </li>
			<li>Czy warstwy mają ten sam kolor i grubość? </li>
			<li>Czy warstwy występują na tych samych głębokościach? </li>
			<li>Jak długo trwało tworzenie każdej kolumny? </li>
			<li>Czy jedna kolumna rozwijała się wolniej niż inne? </li>
		</ul>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Kolumna Winogradsky'ego jest przykładem współzależnego ekosystemu mikrobiologicznego. Po zmieszaniu błota, wody i dodatkowych substratów węglowych i siarkowych w pionowej kolumnie, uwarstwiony ekosystem powinien ustabilizować się w oddzielnych, stabilnych strefach w ciągu kilku tygodni. Strefy te są zajmowane przez różne mikroorganizmy, które rozwijają się w określonym miejscu wzdłuż gradientu między bogatym w siarczki osadem na dnie a bogatym w tlen osadem na górze. Manipulując warunkami i substratami w kolumnie Winogra...

tworzenie kolumny winogradsky'ego: metoda wzbogacania gatunków drobnoustrojów w próbce osadu

Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

Źródło: Elizabeth Suter1, Christopher Corbo1, Jonathan Blaize1 
1 Wydział Nauk Biologicznych, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
Kolumna Winogradsky to miniaturowy, zamknięty ekosystem używany do wzbogacania osadowych społeczności mikroorganizmów, zwłaszcza tych zaangażowanych w obieg siarki. Kolumna została po raz pierwszy użyta przez Siergieja Winogradskiego w 1880 roku i od tego czasu jest stosowana w badaniu wielu różnych mikroorganizmów zaangażowanych w biogeochemię, takich jak fotosyntezatory, utleniacze siarki, reduktory siarczanów, metanogeny, utleniacze żelaza, cyklery azotu i inne (1,2).
Większość mikroorganizmów na Ziemi jest uważana za nienadającą się do hodowli, co oznacza, że nie można ich wyizolować w probówce lub na szalce Petriego (3). Wynika to z wielu czynników, w tym z tego, że mikroorganizmy są zależne od innych w zakresie niektórych produktów przemiany materii. Warunki panujące w felietonie Winogradsky'ego ściśle naśladują naturalne środowisko mikroorganizmów, w tym ich interakcje z innymi organizmami, i pozwalają na ich hodowlę w laboratorium. W związku z tym technika ta pozwala naukowcom badać te organizmy i zrozumieć, w jaki sposób są one ważne dla cykli biogeochemicznych Ziemi bez konieczności hodowania ich w izolacji.
Środowisko Ziemi jest pełne mikroorganizmów, które rozwijają się we wszystkich typach siedlisk, takich jak gleby, woda oceaniczna, chmury i osady głębinowe. We wszystkich siedliskach mikroorganizmy są od siebie zależne. W miarę wzrostu mikroorganizm zużywa określone substraty, w tym paliwa bogate w węgiel, takie jak cukry, a także składniki odżywcze, witaminy i gazy oddechowe, takie jak tlen. Kiedy te ważne zasoby się wyczerpią, różne mikroorganizmy o różnych potrzebach metabolicznych mogą zakwitnąć i rozwijać się. Na przykład w kolumnie Winogradsky'ego mikroorganizmy najpierw konsumują dodany materiał organiczny, jednocześnie wyczerpując tlen w dolnych warstwach kolumny. Po zużyciu tlenu organizmy beztlenowe mogą przejąć kontrolę i zużywać różne materiały organiczne. Ten ciągły rozwój różnych społeczności drobnoustrojów w czasie nazywa się sukcesją (4). Sukcesja mikrobiologiczna jest ważna w kolumnie Winogradsky'ego, gdzie aktywność mikrobiologiczna zmienia chemię osadu, co z kolei wpływa na aktywność innych drobnoustrojów i tak dalej. Wiele mikroorganizmów w glebach i osadach żyje również wzdłuż gradientów, które są strefami przejściowymi między dwoma różnymi typami siedlisk w oparciu o stężenia substratów (5). W odpowiednim miejscu gradientu mikroorganizm może otrzymać optymalne ilości różnych substratów. W miarę rozwoju kolumny Winogradsky'ego zaczyna ona naśladować te naturalne gradienty, szczególnie w zakresie tlenu i siarczków (ryc. 1).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Reprezentacja gradientów tlenu (O2) i siarczku (H2S), które rozwijają się w kolumnie Winogradsky'ego.
W kolumnie Winogradsky'ego, błoto i woda ze stawu lub mokradeł są mieszane w przezroczystej kolumnie i pozostawiane do inkubacji, zazwyczaj w świetle. Do kolumny dodaje się dodatkowe substraty, aby zapewnić społeczności źródła węgla, zwykle w postaci celulozy i siarki. Fotosyntezatory zazwyczaj zaczynają rosnąć w górnych warstwach osadu. Te fotosyntetyczne mikroorganizmy składają się w dużej mierze z cyjanobakterii, które wytwarzają tlen i pojawiają się jako zielona lub czerwono-brązowa warstwa (ryc. 2, tabela 1). Podczas gdy w procesie fotosyntezy powstaje tlen, tlen jest słabo rozpuszczalny w wodzie i zmniejsza się poniżej tej warstwy (rys. 1). Tworzy to gradient tlenu, od wysokich stężeń tlenu w górnych warstwach do zera tlenu w dolnych warstwach. Warstwa natleniona nazywana jest warstwą tlenową, a warstwa bez tlenu nazywana jest warstwą beztlenową.
W warstwie beztlenowej może rozmnażać się wiele różnych społeczności mikroorganizmów, w zależności od rodzaju i ilości substratów, które są dostępne, źródła początkowych mikrobów i porowatości osadu. Na dole kolumny mogą rozwijać się organizmy, które rozkładają materię organiczną beztlenowo. W wyniku fermentacji mikrobiologicznej powstają kwasy organiczne z rozkładu celulozy. Te kwasy organiczne mogą być następnie wykorzystywane przez reduktory siarczanów, które utleniają te substancje organiczne za pomocą siarczanów i wytwarzają siarczek jako produkt uboczny. Aktywność reduktorów siarczanowych jest wskazana, jeśli osad staje się czarny, ponieważ żelazo i siarczek reagują, tworząc czarne minerały siarczku żelaza (ryc. 2, tabela 1). Siarczek dyfunduje również w górę, tworząc kolejny gradient, w którym stężenia siarczków są wysokie na dole kolumny i niskie w górnej części kolumny (rys. 1).
W pobliżu środka kolumny, utleniacze siarki wykorzystują dopływ tlenu z góry i siarczku z dołu. Przy odpowiedniej ilości światła w tych warstwach mogą rozwijać się fotosyntetyczne utleniacze siarki. Organizmy te są znane jako zielone i fioletowe bakterie siarkowe i często pojawiają się jako zielone, fioletowe lub fioletowo-czerwone włókna i plamy (ryc. 2, tabela 1). Zielone bakterie siarkowe mają wyższą tolerancję na siarczki i zwykle rozwijają się w warstwie bezpośrednio pod fioletowymi bakteriami siarkowymi. Powyżej fioletowych bakterii siarkowych mogą również rozwijać się fioletowe bakterie bezsiarkowe. Organizmy te fotosyntetyzują przy użyciu kwasów organicznych jako donorów elektronów zamiast siarczków i często pojawiają się jako czerwona, fioletowa, pomarańczowa lub brązowa warstwa. Niefotosyntetyczne utleniacze siarki mogą rozwijać się powyżej fioletowych bakterii bezsiarkowych, które zwykle pojawiają się jako białe włókna (rys. 2, tabela 1). Dodatkowo w kolumnie Winogradsky'ego mogą również tworzyć się bąbelki. Pęcherzyki w warstwach tlenowych wskazują na produkcję tlenu przez cyjanobakterie. Pęcherzyki w warstwach beztlenowych są prawdopodobnie spowodowane aktywnością metanogenów, organizmów, które beztlenowo rozkładają materię organiczną i tworzą metan jako produkt uboczny.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pozycja w kolumnie</td>
			<td>Grupa funkcyjna</td>
			<td>Przykłady organizmów</td>
			<td>Wskaźnik wizualny</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Do góry</td>
			<td>Fotosyntezatory</td>
			<td>Sinice</td>
			<td>Warstwa zielona lub czerwonawo-brązowa. Czasami pęcherzyki tlenu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5"></td>
			<td>Niefotosyntetyczne utleniacze siarki</td>
			<td>Beggiatoa (Thiobacillus)</td>
			<td>Biała warstwa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fioletowe bakterie bezsiarkowe</td>
			<td>Rodomikrob, Rhodospirilum, Rhodopseuodmonas</td>
			<td>Czerwona, fioletowa, pomarańczowa lub brązowa warstwa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fioletowe bakterie siarkowe</td>
			<td>Chromatium (Chromian)</td>
			<td>Fioletowa lub fioletowo-czerwona warstwa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zielone bakterie siarkowe</td>
			<td>Chlorob</td>
			<td>Zielona warstwa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bakterie redukujące siarczany</td>
			<td>Desulfovibrio, Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfuromonas</td>
			<td>Czarna warstwa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dno</td>
			<td>Metanogeny</td>
			<td>Methanococcus (Methanosarcina)</td>
			<td>Czasami pęcherzyki metanu.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Główne grupy bakterii, które mogą pojawić się w klasycznej kolumnie Winogradsky'ego, od góry do dołu. Podano przykłady organizmów z każdej grupy oraz wymieniono wskaźniki wizualne każdej warstwy organizmów. Na podstawie Perry et al. (2002) i Rogan et al. (2005).

W tym eksperymencie woda i osad zostały zebrane z siedliska słodkowodnego. Skonstruowano dwie kolumny Winogradsky'ego i pozwolono im się rozwinąć: klasyczną kolumnę Winogradsky'ego inkubowaną w świetle w temperaturze pokojowej (ryc. 2A) i kolumnę Winogradsky'ego inkubowaną w ciemności w temperaturze pokojowej (ryc. 2B). 
<img alt="Figure 2B" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig2b.jpg"> 
Rysunek 2B: Zdjęcie klasycznej kolumny Winogradsky'ego (po lewej), inku...

Tworzenie kolumny Winogradsky'ego: metoda wzbogacania gatunków drobnoustrojów w próbce osadu

Source: Elizabeth Suter1, Christopher Corbo1, Jonathan Blaize1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 
...

Większość mikroorganizmów na Ziemi nie może być hodowana w laboratorium, często dlatego, że polegają one na innych mikroorganizmach w swoich rodzimych społecznościach. Kolumna Winogradsky'ego, nazwana na cześć jej wynalazcy Siergieja Winogradskiego, to miniaturowy, zamknięty ekosystem, który wzbogaca społeczności mikrobiologiczne w próbce osadu, umożliwiając naukowcom badanie wielu drobnoustrojów, które odgrywają istotną rolę w procesach biogeochemicznych Ziemi, bez konieczności ich izolowania i hodowli indywidualnie. Zazwyczaj miesza się błoto i wodę z ekosystemu, takiego jak staw lub bagno. Jako opcjonalny eksperyment do tej mieszaniny można dodać sól, aby wzbogacić różne gatunki halofilów. Następnie niewielką część mieszanki uzupełnia się węglem, zwykle w postaci celulozy z gazety i siarki, zwykle z żółtka jaja. W innym opcjonalnym eksperymencie do tej mieszanki można dodać gwóźdź, aby wzbogacić niektóre gatunki Gallionella. Ta nowa mieszanina jest następnie dodawana do przezroczystej kolumny, tak aby kolumna była wypełniona w jednej czwartej. Na koniec do kolumny dodaje się resztę mieszanki błota i więcej wody, aż będzie ona w pełni pełna. Sukcesję, która odnosi się do konsekwentnego rozwoju różnych społeczności drobnoustrojów w czasie, można obserwować w czasie rzeczywistym za pomocą kolumny Winogradsky'ego. Gdy mikroorganizmy rosną w kolumnie, zużywają określone substraty i zmieniają chemię swojego środowiska. Kiedy ich substraty są wyczerpane, pierwotne drobnoustroje wymierają, a drobnoustroje o różnych potrzebach metabolicznych mogą rozwijać się w zmienionym środowisku. Z biegiem czasu zaczynają tworzyć się wyraźnie odrębne warstwy, z których każda zawiera części społeczności bakteryjnej o różnych potrzebach mikrośrodowiskowych. Na przykład mikroorganizmy fotosyntetyczne, składające się głównie z sinic, tworzą zielone lub czerwono-brązowe warstwy w pobliżu szczytu kolumny. Ponieważ fotosynteza wytwarza tlen, często widziany jako pęcherzyki w górnej części kolumny, tworzy się gradient, w którym najwyższe stężenia tlenu znajdują się u góry, a najniższe w kierunku dołu. W zależności od dostępnych substratów, w beztlenowej warstwie dolnej mogą rozwijać się różne zbiorowiska drobnoustrojów. Pęcherzyki w tej warstwie mogą wskazywać na obecność metanogenów, które wytwarzają metan w procesie fermentacji. W tym przypadku w wyniku fermentacji mikrobiologicznej celulozy powstają kwasy organiczne. Reduktory siarczanowe utleniają te kwasy do produkcji siarczku, a na ich aktywność wskazuje czarny osad. Siarczek dyfunduje w górę kolumny, tworząc kolejny gradient, w którym stężenia siarczków są najwyższe w dolnej części kolumny, a najniższe w pobliżu góry. W kierunku środka kolumny utleniacze siarki wykorzystują tlen z góry i siarczek od dołu. Przy odpowiednim oświetleniu rozwijają się fotosyntetyczne utleniacze siarki, takie jak zielone i fioletowe bakterie siarkowe. Zielone bakterie siarkowe tolerują wyższe stężenia siarczków. W ten sposób rosną bezpośrednio pod fioletowymi bakteriami siarki. Bezpośrednio nad tą warstwą fioletowe bakterie bezsiarkowe tworzą czerwono-pomarańczową warstwę. Na niefotosyntetyczne utleniacze siarki wskazuje obecność białych włókien. Warunki, takie jak światło i temperatura, mogą być również zmieniane, aby wzbogacić inne społeczności. W tym filmie dowiesz się, jak skonstruować kolumnę Winogradsky'ego i zmieniać warunki uprawy i podłoża, aby wzbogacić określone społeczności mikrobiologiczne. Najpierw zlokalizuj odpowiedni ekosystem wodny, taki jak staw lub bagno. Próbki osadów powinny pochodzić z obszaru w pobliżu brzegu wody i być całkowicie nasycone wodą. Następnie za pomocą łopaty i wiadra zbierz od jednego do dwóch litrów nasyconego błota. Następnie uzyskaj około trzech litrów świeżej wody z tego samego źródła i wróć do laboratorium z próbkami terenowymi. W laboratorium należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice. Teraz przenieś około 750 mililitrów błota do miski. Następnie przesiej błoto, aby usunąć duże kamienie, gałązki lub liście i użyj łyżki, aby rozbić wszelkie grudki. Następnie dodaj trochę świeżej wody do miski miksującej i wymieszaj dużą łyżką. Dodaj wodę, aż konsystencja mieszanki wodno-błotnej będzie podobna do koktajlu mlecznego. Kontynuuj, aby upewnić się, że nie ma grudek. Jako opcjonalny eksperyment wybierz bakterie halofilne, dodając od 25 do 50 miligramów soli do mieszanki błota. Następnie przenieś około 1/3 mieszanki wody i błota do drugiej miski. Do miski dodaj jedno żółtko i garść rozdrobnionej gazety. Następnie dodaj tę mieszaninę do kolumny, aż będzie wypełniona w około 1/4. Następnie dodaj mieszankę wodno-błotną bez jajka i gazety do kolumny, aż będzie wypełniona w około 3/4. Następnie dodaj więcej wody do kolumny, pozostawiając 1/2 cala wolnej przestrzeni na górze. Przykryj kolumnę folią i zabezpiecz ją gumką. Inkubuj kolumnę w świetle w pobliżu okna w temperaturze pokojowej przez następne cztery do ośmiu tygodni. Przez cały okres inkubacji monitoruj zmiany w kolumnie Winogradsky'ego co najmniej raz w tygodniu pod kątem rozwoju różnych kolorowych warstw i tworzenia się pęcherzyków. Dodatkowo rejestruj czas potrzebny na rozwój różnych warstw. Inną modyfikacją, którą można wykonać, jest inkubacja kolumny w pobliżu grzejnika, aby wybrać bakterie termofilne, lub w lodówce, aby wybrać bakterie psychrofilne. Zmieniaj warunki oświetleniowe, umieszczając różne kolumny w silnym świetle, słabym świetle lub ciemności w celu inkubacji. Alternatywnie, ogranicz długość fali wpadającego światła, pokrywając kolumnę różnymi odcieniami celofanu, aby określić, które kolory wybierają dla różnych grup bakterii. W innym opcjonalnym eksperymencie, aby wzbogacić bakterie utleniające żelazo, dodaj gwóźdź do mieszanki błota i wody przed dodaniem gazety i żółtka jaja. Po jednym do dwóch tygodni wzrost warstwy sinicy jest wskazywany przez zielony lub czerwono-brązowy film na wierzchu warstwy błota klasycznej kolumny Winogradsky'ego. Z biegiem czasu monitorowany jest wygląd i ewolucja różnych warstw, z których każda wskazuje na różne rodzaje obecnych bakterii. Porównując kolumnę uprawianą w ciemności z tradycyjną kolumną Winogradsky'ego, widzimy, że ciemna obróbka daje czarną warstwę na dole kolumny, co wskazuje na bakterie redukujące siarczany. Ciemna kolumna może również dawać inne warstwy, w zależności od innych warunków inkubacji. Ponadto ciemna kolumna nie daje zielonej warstwy sinic, ani czerwonych, fioletowych lub zielonych warstw wskazujących odpowiednio na fioletowe bakterie bezsiarkowe, fioletowe siarkowe i zielone bakterie siarkowe. Wzrost tych grup jest zależny od światła.

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biologia zaawansowana

Microbiology

Mikrobiologia

winogradsky column microbial layers and gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles.

The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon, usually cellulose, and sulfur are added, and the column is incubated in light. As microbes use these resources, they go through succession, which means one community replaces another as conditions change. This activity also creates gradients, or zones with changing chemical levels, especially for oxygen and sulfide.

At the top of the column, photosynthesizers grow first. These are mostly cyanobacteria, which make oxygen and often appear as a green or reddish-brown layer. Because oxygen is not very soluble in water, its concentration drops quickly below this zone. That creates an aerobic layer with oxygen at the top and an anaerobic layer with no oxygen below.

Deeper in the column, microbes that do not need oxygen can become active. At the bottom, organisms break down organic matter without oxygen, and fermentation of cellulose produces organic acids. Sulfate reducers then use these organics with sulfate and release sulfide. When iron reacts with sulfide, the sediment turns black and forms iron-sulfide minerals.

Sulfide also moves upward, so the middle of the column becomes a place where oxygen from above and sulfide from below meet. With enough light, sulfur-using photosynthesizers grow here. Green sulfur bacteria and purple sulfur bacteria often form green, purple, or purple-red layers. Green sulfur bacteria usually sit below purple sulfur bacteria because they tolerate more sulfide.

Above the purple sulfur bacteria, purple nonsulfur bacteria may form red, purple, orange, or brown layers. These microbes use organic acids as electron donors instead of sulfide. Higher up, nonphotosynthetic sulfur oxidizers can appear as white filaments. Bubbles may also form in the column. Oxygen bubbles in the aerobic layers come from cyanobacteria, while methane bubbles in the anaerobic layers are likely made by methanogens.

A mature Winogradsky column can show several microbial groups from top to bottom. Cyanobacteria are at the top, followed by nonphotosynthetic sulfur oxidizers, purple nonsulfur bacteria, purple sulfur bacteria, green sulfur bacteria, sulfate-reducing bacteria, and methanogens near the bottom. The visible colors, filaments, black sediment, and bubbles make the column a useful model for studying how microbes depend on one another in layered environments.

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

winogradsky-column-microbial-layers-and-gradients

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Explore how a Winogradsky column forms microbial layers, oxygen and sulfide gradients, and visible signs of cyanobacteria, sulfur bacteria, and methanogens.

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

Description

Transcript

Tags