Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. Konfiguracja
<ol>
	<li>Schemat blokowy z listą wszystkich materiałów, stopniowy protokół eksperymentalny i metodę wyrzucania materiałów eksploatacyjnych powinien być zapisany w zeszycie laboratoryjnym i przechowywany w pobliżu miejsca pracy doświadczalnej.</li>
	<li>Miejsca pracy powinny być wysterylizowane odpowiednim środkiem antyseptycznym (70% etanolu), a eksperymentator powinien ograniczyć ryzyko zanieczyszczenia, nosząc czystą odzież laboratoryjną, która również chroni je przed anomaliami ekspozycji. Odpowiednia odzież to między innymi fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe lub nitrylowe, gogle, respiratory i zamknięte buty. Bardzo ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać technikę aseptyczną.</li>
	<li>Przygotuj 90 ml 0,45% soli fizjologicznej. Za pomocą czystego cylindra z podziałką odmierz 90 ml sterylnej wody i przenieś ją do czystej kolby Erlenmeyera z 0,45% solą fizjologiczną. Odważyć 405 g chlorku sodu (Sigma-Aldrich NaCl S9888) i dodać go do kolby oznaczonej 0,45% solą fizjologiczną. Obracać kilkakrotnie, aż nie będzie widać substancji rozpuszczonej.</li>
	<li>Po zakończeniu eksperymentator powinien ponownie wysterylizować wszystkie powierzchnie i wyrzucić wszelkie niepożądane organizmy, rozcieńczalniki, szalki Petriego lub jednorazowe pętle inokulacyjne zgodnie z wytycznymi OSHA. Odzież laboratoryjną można zdjąć przed umyciem rąk.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mediów
<ol>
	<li>Wybierz pożywkę, która jest odpowiednia do uprawy pożądanego organizmu. W większości scenariuszy bulion umożliwiłby wystarczający wzrost bakterii. Ponieważ pożądane są tu organizmy z protokołu Winogradsky'ego, kolumnę składającą się z węglanu wapnia, siarki, celulozy i błota zmontowano i pozostawiono w spokoju na 7 dni. Wspomniana kolumna jest podzielona na sekcje tlenowe, mikroaerofilne i beztlenowe.</li>
	<li>Wybierz podłoże odpowiednie do posiewu interesującego Cię organizmu. Uzupełnienie płynnych pożywek agarem klasy mikrobiologicznej jest zwykle stosowane jako środek krzepiący. Pożywka LB/agar jest wystarczająca przy zbieraniu próbek z obszarów tlenowych, mikroaerofilowych i beztlenowych wyżej wymienionej kolumny. Uwaga: Próbki z obszaru mikroaerofilnego nie zostały pobrane do tej procedury. Jednak organizmy te powinny być hodowane w słoikach ze świecami. Wprowadzenie świecy do tej komory uprawowej przed uszczelnieniem tworzy środowisko o niskiej zawartości tlenu, które jest odpowiednie do proliferacji mikroaerofilowej.</li>
	<li>Ponieważ chcemy przygotować 250 ml, należy użyć kolb Erlenmeyera o pojemności 500 ml (lub większej), aby zapobiec wykipieniu podczas autoklawowania. Oznacz jeden "bulion", a drugi "Agar".</li>
	<li>Określ ilość pożywki wymaganą do wytworzenia każdego roztworu, postępując zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stężenia. LB Agar, stosowany tutaj, jest przygotowywany przez połączenie 25g/L z ultraczystą wodą. Nasza objętość 250 ml wymaga roztworu 6,25 funta agaru / 250 ml wody. Podobnie, bulion LB przygotowuje się przez połączenie tego samego stosunku bulionu LB i wody. Ponieważ nie jest uzupełniany środkiem zestalającym, nie twardnieje po schłodzeniu.</li>
	<li>Zważ podłoże i wymieszaj je z wodą w proporcjach zgodnych z zaleceniami producenta. Dodaj 6,25 g agaru LB do kolby oznaczonej "Agar" i 6,25 g bulionu LB do kolby oznaczonej "Rosół". Dodaj 250 ml ultraczystej wody do każdej kolby.</li>
	<li>Owinąć każdą kolbę folią aluminiową i użyć autoklawu do sterylizacji pożywki przez co najmniej 15 minut w temperaturze 121°C, 15 psi.</li>
	<li>Używając żaroodpornej rękawicy lub podkładki, wyjmij kolby z autoklawu po zakończeniu cyklu i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 40-50°C.</li>
	<li>Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury wlać zawartość kolby oznaczonej jako "bulion" do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml lub kolby okrągłodennej. Oznaczyć kolbę o pojemności 250 ml jako "roztwór0".</li>
	<li>Zaopatrz się w 10 sterylnych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i oznacz je datą, nazwą, rodzajem użytej pożywki i strefą kolumny Winogradsky'ego, z której będą zbierane organizmy.</li>
	<li>Wyjmij kolbę z napisem "Agar" z łaźni wodnej i zacznij nalewać do każdej z 10 szalek Petriego. Do każdego naczynia nie należy dodawać więcej niż 15 ml. Można to również wykonać za pomocą pipety i pipety serologicznej o pojemności 25 ml w celu poprawy dokładności. Użyj sterylnej końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, a następnie przykryj pokrywkami płytki i pozostaw na noc do zestalenia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie rozcieńczalnika
<ol>
	<li>Przygotuj dziesięć probówek, które mogą pomieścić 20 ml lub więcej w stojaku i oznacz je T1-T10. Każdy numer probówki jest zgodny ze współczynnikiem rozcieńczenia, któremu odpowiada (tj. T4 = 1x10-4 lub 0,0001 lub 1/10 000 stężenia podstawowego).</li>
	<li>Odpipetuj 9 ml 0,45% soli fizjologicznej do każdej z 10 probówek</li>.
	<li>Półfabrykaty soli fizjologicznej są teraz gotowe do sterylizacji w autoklawie. Użyj folii aluminiowej, aby przykryć każdą z 10 probówek, a następnie przenieś je do stojaka na probówki kompatybilnego z autoklawem. Sterylizować przez minimum 15 minut w temperaturze 121°C, 15 psi.</li>
	<li>Usuń półfabrykaty za pomocą rękawic żaroodpornych i pozostaw do ostygnięcia. Przykryj i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu, gdy probówki osiągną temperaturę pokojową lub gdy ostygną w dotyku.</li>
</ol>
4. Uprawa organizmu docelowego
<ol>
	<li>Zaszczepić "roztwór0" pojedynczą kolonią z uprzednio prążkowanej płytki lub 50 μl zamrożonego bulionu. Dać organizmowi docelowemu czas na replikację, umieszczając zaszczepiony "roztwór0" w inkubatorze o temperaturze 37°C na noc z wytrząsaniem (jeśli to konieczne). (Uwaga: Kolba powinna być przykryta, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Jeśli organizm docelowy jest tlenowy, użyj sterylnych zatyczek z gazy i bawełny, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Jeśli oceniasz regiony kolumny Winogradsky'ego, po prostu usuń 1 gram z każdej żądanej strefy (tlenowej i beztlenowej dla celów tego badania) i ponownie zawieś w T1 przed przejściem do kroku 5.3.</li>
</ol>
5. Seryjne rozcieńczanie
<ol>
	<li>Zaopatrzyć się w kolbę z napisem "Bulion odżywczy" z inkubatora i energicznie wstrząsnąć.</li>
	<li>Odpipetować 1 ml "roztworu0" do probówki oznaczonej T1. Wir T1. Jeśli oceniasz eksplantaty Winogradsky'ego, zważ 1 gram żądanej strefy i dodaj go do T1 przed wirowaniem. (Uwaga: dla uproszczenia stosuje się tutaj 1 ml - można również użyć mniejszych lub większych objętości rozcieńczalnika).</li>
	<li>Usuń 1 ml z probówki T1 i dodaj go do probówki T2. Wir T2.</li>
	<li>Wyjmij 1 ml z probówki T2 i dodaj go do probówki T3. Wir T3.</li>
	<li>Usuń 1 ml z probówki T3 i dodaj go do probówki T4. Wir T4.</li>
	<li>Wyjmij 1 ml z probówki T4 i dodaj ją do probówki T5. Wir T5.</li>
	<li>Wyjmij 1 ml z probówki T5 i dodaj go do probówki T6. Wir T6.</li>
	<li>Wyjmij 1 ml z probówki T6 i dodaj go do probówki T7. Wir T7.</li>
	<li>Wyjmij 1 ml z probówki T7 i dodaj go do probówki T8. Wir T8.</li>
	<li>Wyjmij 1 ml z probówki T8 i dodaj go do probówki T9. Wir T9.</li>
	<li>Usuń 1 ml z probówki T9 i dodaj go do probówki T10.</li>
</ol>
6. Poszycie rozłożone
<ol>
	<li>Odmierzyć pipetą 100 μl rozcieńczonej próbki z T1 bezpośrednio na szalkę Petriego. Ten krok można powtórzyć, ale nie trzeba, dla każdej probówki.</li>
	<li>Zaopatrz się w sterylny, jednorazowy pręt do rozsiewania lub wysterylizuj płomieniem szklany pręt do rozsiewania. Ruchem zgodnie z ruchem wskazówek zegara/przeciwnie do ruchu wskazówek zegara przesuwaj poziomą część pręta rozprowadzającego, aby równomiernie rozprowadzić próbkę na szalce Petriego.</li>
	<li>Powtórz te czynności dla każdej strefy kolumny Winogradsky'ego, która ma być oceniana.</li>
	<li>Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 24 godziny. W przypadku organizmów beztlenowych należy użyć komory beztlenowej.</li>
</ol>
7. Smugi
<ol>
	<li>Należy wybrać odpowiednie rozcieńczenie organizmu docelowego. Na przykład roztwór4 da 1/10 000 rozcieńczenie początkowego stężenia. Zazwyczaj rozcieńczenia 1/1 000th (T3 / roztwór), 1/1 000000 th (T6 / Roztwór6) i 1/1 000 000000 th (T9 / roztwór9) są oceniane w celu wyliczenia drobnoustrojów.</li>
	<li>Używając plastikowej, sterylnej, jednorazowej pętli do zaszczepiania lub metalowej pętli do zaszczepiania wielokrotnego użytku, która była pod ostrzałem przez co najmniej 10 sekund, zanurz w żądanym roztworze z kroku 5. Skalibrowane pętle inokulacyjne powinny przenosić 0,01 ml. (Uwaga: Nie pozwól, aby płonąca pętla miała kontakt z bakteriami natychmiast po zdjęciu z ognia)</li>
	<li>Lekko podnieść pokrywę szalki Petriego z jednej strony, tak aby tylko pętla zaszczepiająca miała dostęp do agaru. Przesuwaj pętlę zaszczepiającą po górnej części podłoża w sposób zygzakowaty, uważając, aby nie naruszyć agaru. Opuść pokrywę szalki Petriego.</li>
	<li>Użyj nowej jednorazowej pętli do zaszczepiania lub ponownie wysterylizuj pętlę wielokrotnego użytku.</li>
	<li>Obróć płytkę o około 1/3rd (~118°) i zmniejsz częstotliwość ruchu zygzakowatego.</li>
	<li>Ponownie użyj nowej jednorazowej pętli lub ponownie wysterylizuj metalową pętlę przed ostatnim obróceniem i ponownie zmniejsz częstotliwość zygzakowatego. Opuść pokrywę szalki Petriego.</li>
	<li>Powtarzaj kroki 7.2 - 7.6, aż co najmniej trzy szalki Petriego zostaną pokryte smugami w trzech różnych rozcieńczeniach, używając nowej jednorazowej pętli lub ponownie zapalając pętlę wielokrotnego użytku (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Umieść na noc szalki Petriego w inkubatorze w temperaturze 37°C. W przypadku organizmów beztlenowych użyj komory beztlenowej.</li>
</ol>
8. Analiza danych i wyniki
<ol>
	<li>Kultury zebrano ze stref tlenowych i beztlenowych 7-dniowej kolumny Winogradsky'ego. Strefy te są odpowiednie odpowiednio dla beztlenowców heterotroficznych i utleniających żelazo.</li>
	<li>Eksplantaty kolumnowe były seryjnie rozcieńczane przed smugami lub rozprowadzeniem na płytkach agarowych LB.</li>
	<li>Smugi ujawniły mieszaną populację z każdej z ocenianych stref Winogradsky. Płyty rozprowadzające dawały podobne wyniki.</li>
	<li>Aby obliczyć jtk/ml lub jtk/g, uśrednij liczbę zliczonych kolonii z trzech płytek. Pomnóż średnią liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia i podziel przez ilość podniesioną. Na przykład, jeśli na płytkach zaszczepionych 0,1 ml roztworu6 (T6) policzono średnio 65 kolonii, opisany wcześniej wzór wynosiłby 650 000 000 CFU/ml.</li>
	<li>Z każdej płytki można teraz wybrać izolowane kolonie do wykorzystania w testach wzbogacania w celu określenia tożsamości gatunku.</li>
</ol>

Liczenie bakterii i izolacja szczepów za pomocą posiewu wymaga możliwych do opanowania stężeń organizmów docelowych. Udane posiewy są zatem uzależnione od seryjnego rozcieńczania. W związku z tym wyżej wymienione techniki pozostają kamieniem węgielnym badań i eksperymentów mikrobiologicznych. Chociaż z założenia jest to proste, współczynniki rozcieńczenia i technika powlekania mogą być modyfikowane przez eksperymentatora w celu zwiększenia wyników bez naruszania integralności każdej metody. Wykreślenie czterech faz wzrostu bakterii może być pomocne przy charakteryzowaniu pożądanych drobnoustrojów. Te fazy, opóźnienie, logarytm, stacjonarność i śmierć, są naznaczone zmianami w replikacji bakterii. Faza opóźnienia charakteryzuje się powolnym wzrostem spowodowanym adaptacją fizjologiczną, faza logarytmiczna to okres maksymalnej proliferacji charakteryzujący się wykładniczym wzrostem liczby żywotnych komórek, faza stacjonarna jest następnie osiągana z powodu ograniczeń środowiskowych i nagromadzenia toksyn, przed fazą śmierci, w której liczba komórek zaczyna spadać. Można to osiągnąć poprzez seryjne rozcieńczanie (lub rozcieńczanie 1-etapowe w celu uniknięcia pomyłek) roztwór0 co godzinę przez łącznie 8 godzin, począwszy od czasu0 (roztwór0 należy przywrócić do inkubatora wstrząsającego po każdym rozcieńczeniu). Obliczyć logarytm10 jtk/ml dla pojedynczego rozcieńczalnika o czasie0 i wykreślić na osi Y. Powtórzyć to obliczenie dla próbki Czas1 (upewnij się, że obliczono jtk/ml przy użyciu tego samego współczynnika rozcieńczenia, co czas0). Powtarzaj, aż za każdym razem (czas1-raz 8) zostaną wykreślone na osi X.

seryjne rozcieńczenia i posiew: oznaczanie liczby drobnoustrojów

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

Źródło: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1 i Christopher P. Corbo1 
1 Wydział Nauk Biologicznych, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 10301
Ilościowa ocena prokariontów może być uciążliwa ze względu na ich obfitość, skłonność do wykładniczego rozmnożenia, różnorodność gatunkową w populacji i specyficzne potrzeby fizjologiczne. Wyzwanie to potęguje czterofazowy charakter, w którym bakterie się replikują (opóźnienie, logarytm, stacjonarność i śmierć). Zdolność do dokładnego oszacowania stężenia mikroorganizmów jest niezbędna do pomyślnej identyfikacji, izolacji, hodowli i charakterystyki (6). W związku z tym mikrobiolodzy od ponad wieku stosują seryjne rozcieńczanie i różne techniki powlekania, aby wiarygodnie określić ilościowo miano bakteryjne i wirusowe w klinicznych, przemysłowych, farmaceutycznych i akademickich środowiskach laboratoryjnych (2,4,6). Opisy tej metodologii pojawiły się po raz pierwszy w 1883 roku, kiedy to niemiecki naukowiec i lekarz Robert Koch opublikował swoją pracę na temat czynników chorobotwórczych (2). Często określany jako ojciec współczesnej bakteriologii, wyżej wymienione techniki Kocha stały się złotym standardem w liczeniu mikroorganizmów, hodowlanych lub innych, na całym świecie.
Seryjne rozcieńczanie to systematyczna redukcja znanego lub nieznanego podmiotu (substancji rozpuszczonej, organizmu, itp.) poprzez kolejne ponowne zawieszanie początkowego roztworu (roztworu0) do stałych objętości płynnego rozcieńczalnika (ślepe próby). Ślepe próby te zwykle składają się z 0,45% soli fizjologicznej, chociaż skład może być różny (7). Podczas gdy eksperymentator może wybrać dowolną objętość dla każdego rozcieńczalnika, najczęściej jest to wielokrotność 10, co ułatwia logarytmiczną redukcję próbki. Na przykład roztwór0 zawiera łącznie 100 komórek E. coli zawieszonych w 10 ml bulionu odżywczego. Jeśli 1 ml roztworu0 zostanie usunięty i dodany do 9 ml soli fizjologicznej (rozcieńczalnik1), nowy roztwór (roztwór1) będzie zawierał 1/10początkowego stężenia E. coli. W tym przykładzie nowy roztwór (roztwór1) zawierałby 10 komórek E. coli. Powtórzenie tego procesu poprzez usunięcie 1 ml roztworu1 i dodanie go do kolejnych 9 ml soli fizjologicznej (rozcieńczalnik2) dałoby roztwór2, zawierający tylko jedną komórkę E. coli. Ponieważ każdy nowy roztwór (9 ml rozcieńczalnika + 1 ml roztworu) zawiera łącznie 10 ml, możemy wywnioskować, że współczynnik rozcieńczenia dla tej redukcji wynosi 10 lub że było to 10-krotne rozcieńczenie seryjne (rysunek 1). Ponieważ w tym przykładzie zaczęliśmy tylko od 100 komórek i rozcieńczamy 10-krotnie, do osiągnięcia absolutnego minimum stężenia 1 komórki potrzebne są tylko dwa kroki.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Seryjne rozcieńczanie roztworu podstawowego. 1 ml podwielokrotności roztworu podstawowego (roztwór0) dodaje się do probówki 1, która zawiera 9 ml 0,45% soli fizjologicznej (rozcieńczor1); Produktem tej mieszaniny jest roztwór1. Powtórzyć czynność, dodając 1 ml nowo utworzonego roztworu1 i dodając go do probówki 2. Porcjowanie i ponowne zawieszenie odbywa się w ten sposób, aż do osiągnięcia ostatniej probówki, rozcieńczając stężenie podstawowe 10-krotnie na każdym etapie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Seryjne rozcieńczanie jest najprostszą techniką uzyskiwania możliwych do opanowania stężeń pożądanego organizmu i jest uzupełniane przez smugi i rozprzestrzenianie na szalkach Petriego, to tylko dwie z wielu technik powlekania stosowanych przez mikrobiologów. Zaletą tego podejścia jest to, że eksperymentator może zebrać czyste szczepy jednego gatunku lub oddzielić szczepy z populacji mieszanej (7). Paski uzyskuje się poprzez wprowadzenie organizmu do stałego podłoża (zwykle składającego się z agarozy), na którym będzie rósł, jeśli dostępne są odpowiednie składniki odżywcze. Delikatne przeciągnięcie sterylnej pętli zaszczepiającej w pożywkę (tak, aby pozostała subtelna smuga) w sztywny sinusoidalny wzór, rozprowadzi organizm proporcjonalnie do częstotliwości przebiegu eksperymentatora. Podzielenie szalki Petriego na tercje lub ćwiartki (smuga ćwiartkowa) i zmniejszanie częstotliwości każdej smugi w miarę wprowadzania nowego obszaru szalki stopniowo zmniejszy liczbę mikroorganizmów, które mogą zajmować ten obszar, wytwarzając pojedyncze kolonie zamiast niewymiernego trawnika bakteryjnego. Powlekanie rozsiewające nie powoduje dodatkowego rozcieńczania próbek; sterylny rozsiewacz szkła służy do rozprowadzania porcji zawiesiny na całej szalce Petriego (rysunek 2). Kolonie, które rosną na płytce do rozprowadzania, powstają z pojedynczej komórki, a każda kolonia na szalce może być policzona w celu oszacowania liczby jednostek tworzących kolonie na mililitr (CFU) w danej zawiesinie, reprezentowanej jako CFU/ml (6) (Rysunek 3) Miękki agar i posiewanie replik są odmianami wyżej wymienionych technik i pozwalają na izolację bakteriofagów i badań przesiewowych mutantów, odpowiednio (1,7).
<img alt="Rysunek 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Smugi na płytkach do oznaczania liczby bakterii i izolacji szczepów. Oznacz dno szalki Petriego informacjami identyfikacyjnymi (nazwa bakterii, data, pożywka) i podziel na trzy części. Po wybraniu odpowiedniego rozcieńczenia próbki podstawowej, weź sterylną (jednorazową lub płomieniowaną) pętlę zaszczepiającą i zanurz ją w probówce (tutaj, T3). Lekko podnieść pokrywę szalki Petriego z jednej strony, tak aby tylko pętla zaszczepiająca miała dostęp do agaru. Przesuwaj pętlę zaszczepiającą po górnej części podłoża w sposób zygzakowaty, uważając, aby nie naruszyć agaru. Obróć płytkę o około 1/3rd (~118°) i zmniejsz częstotliwość ruchu zygzakowatego. Obróć po raz ostatni i ponownie zmniejsz częstotliwość zygzakowatego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Poszycie rozsiewane. 1 g strefy tlenowej zawieszono w T1, a następnie seryjnie rozcieńczono. Sterylny szklany lub plastikowy jednorazowy pręt do rozsiewania służy do rozprowadzania inokulum w każdym naczyniu. Powtórzono to z 1 g strefy beztlenowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Podobnie jak w przypadku rozcieńczeń seryjnych, do wyrażenia koncentracji organizmu stosuje się skalę logarytmiczną. Liczba kolonii wyhodowanych na standardowych szalkach Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm może być policzona ręcznie (lub zautomatyzowana za pomocą przetwarzania obliczeniowego) poprzez identyfikację izolowanych skupisk wzrostu. Liczby, które sumują się mniej niż 30 lub większe niż 300, powinny być zdefiniowane odpowiednio jako zbyt małe do policzenia (TFTC) lub zbyt liczne do policzenia (TNTC). W przypadku tych ostatnich należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie w celu zmniejszenia stężenia przed ponownym paskowaniem nowej szalki Petriego. Uśrednienie liczby samodzielnych kolonii zidentyfikowanych na podstawie trzech oddzielnych szalek Petriego i pomnożenie średniej przez współczynnik rozcieńczenia otrzyma CFU/ml; wykreślenie logarytmu10 jtk/ml w funkcji czasu ujawni średni czas wytwarzania organizmu (7).

Seryjne rozcieńczenia i posiew: oznaczanie liczby drobnoustrojów

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

Czasami, aby zidentyfikować i zbadać bakterie, musimy najpierw wyizolować je i wzbogacić z próbki. Na przykład próbki uzyskane z kolumny Winogradsky'ego są mieszane, co oznacza, że zawierają wiele gatunków lub szczepów bakterii, więc badanie pojedynczej bakterii lub wyliczenie różnych jej rodzajów może być trudne. W tym celu zwykle stosuje się techniki seryjnego rozcieńczania i posiewu, aby wiarygodnie określić ilościowo obciążenie bakteryjne i wyizolować poszczególne kolonie. Rozcieńczanie seryjne to proces, w którym stężenie organizmu, w tym przypadku bakterii, jest systematycznie zmniejszane poprzez kolejne ponowne zawieszenie w stałych objętościach płynnego rozcieńczalnika. Zazwyczaj objętość rozcieńczalnika jest wielokrotnością 10, aby ułatwić logarytmiczną redukcję próbki organizmu. Na przykład jeden gram osadu jest najpierw usuwany ze strefy zainteresowania Winogradsky'ego i dodawany do 10 mililitrów odpowiedniego płynnego podłoża. Następnie jeden mililitr tego pierwszego rozcieńczenia dodaje się do innej probówki zawierającej dziewięć mililitrów pożywki. Proces można powtarzać, aż do przygotowania kilku różnych stężeń bakterii. Seryjne rozcieńczanie jest kluczem do wyliczenia bakterii w tym przykładzie, ponieważ mieszane próbki z kolumny Winogradsky'ego zawierają nieznaną, często dużą liczbę bakterii. Następnie powlekanie smugowe i powlekanie rozsiewające umożliwiają odpowiednio izolację i zliczanie bakterii w próbce. Smugowanie uzyskuje się poprzez wprowadzenie rozcieńczonej próbki do jednej sekcji stałego podłoża uzupełnionego składnikiem odżywczym, który dzieli się na trzy części. Inokulum to jest następnie rozprowadzane na każdej trzeciej płytce w zygzakowaty wzór. Ponieważ różne sekcje płytki są prążkowane, krzyżując się z poprzednią próbką tylko raz, próbka jest rozprowadzana cieńsz. Oznacza to, że może być konieczne tylko smugowanie z jednego rozcieńczenia, aby uzyskać poszczególne kolonie w późniejszych sekcjach. Po inkubacji prążkowane płytki pozwalają na obserwację morfologii kolonii, informacje, które mogą pomóc w rozróżnieniu różnych gatunków bakterii. Alternatywnie, jeżeli głównym celem jest zliczenie bakterii w próbce, można zastosować posiew. W przypadku powlekania przez rozsiewanie, podwielokrotność pojedynczej próbki jest równomiernie rozprowadzana na całej powierzchni podłoża stałego. Zazwyczaj, ponieważ nie znamy liczby bakterii w zmieszanej próbce, dla każdego z rozcieńczeń lub ich reprezentatywnej próbki wykonuje się płytkę do rozprowadzania. Po inkubacji należy przeprowadzić liczenie za pomocą tych płytek rozsiewających. Wszelkie płytki z liczbą kolonii mniejszą niż 30 należy wyrzucić, ponieważ małe liczby są obarczone większym błędem. Podobnie, wszelkie liczby powyżej 300 powinny zostać odrzucone, ponieważ stłoczenie i nakładanie się kolonii może prowadzić do niedoszacowania liczby kolonii. Jeśli liczba kolonii w każdej z tych pozostałych szalek zostanie zarejestrowana i pomnożona przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie podzielona przez objętość platerowaną, otrzyma to jednostki tworzące kolonię lub CFU na mililitr zawiesiny. W tym filmie dowiesz się, jak jakościowo i ilościowo ocenić próbkę zawierającą znaną bakterię oraz społeczności drobnoustrojów zawartych w różnych regionach kolumny Winogradsky'ego za pomocą seryjnego rozcieńczania, powlekania i powlekania smugowego. Najpierw załóż odpowiedni sprzęt ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary. Następnie wysterylizuj miejsce pracy 70% etanolem i wytrzyj powierzchnię. Następnie zbierz dwie 500-mililitrowe kolby Erlenmeyera i oznacz jeden bulion, a drugi agar. Aby przygotować roztwór agaru LB, wymieszaj około 6,25 grama agaru LB, trzy gramy agaru technicznego i 250 mililitrów wody destylowanej w kolbie oznaczonej jako agar. Następnie przygotuj bulion LB, łącząc 2. 5 gramów pożywki LB i 100 mililitrów wody destylowanej w kolbie oznaczonej bulionem. Po autoklawowaniu kolb należy użyć rękawicy żaroodpornej, aby wyjąć kolby z autoklawu i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze od 40 do 50 stopni Celsjusza. Gdy kolby osiągną temperaturę 50 stopni Celsjusza, ostrożnie przygotuj trzy 100-mililitrowe porcje roztworu bulionu i oznacz każdą podwielokrotność roztworu jako zero. Następnie zbierz 10 sterylnych szalek Petriego i oznacz je datą, nazwą, rodzajem użytych pożywek oraz strefą Kolumny Winogradzkiego, z której zostaną zebrane organizmy. Odpipetować 15 mililitrów agaru z kolby agarowej do każdej szalki Petriego. Następnie użyj końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, załóż pokrywki płytek i pozwól im zastygnąć na blacie przez noc. Następnego dnia przetrzyj blat stołu 70% etanolem. Następnie oznacz 10 20-mililitrowych probówek od T1 do T10 i umieść je w stojaku. Odpipetuj dziewięć mililitrów 45% soli fizjologicznej do każdej probówki. Teraz przykryj luźno każdą z 10 probówek ich nakrętkami i przenieś je do stojaka na probówki kompatybilnego z autoklawem. Po zakończeniu cyklu usuń półfabrykaty soli fizjologicznej za pomocą rękawic żaroodpornych i pozwól im ostygnąć. Przechowuj probówki w temperaturze pokojowej, aż osiągną około 22 stopni Celsjusza. Aby wyhodować znany organizm docelowy, w tym przykładzie E. coli, zaszczepij 100 mililitrów roztworu zero pojedynczą kolonią z wcześniej prążkowanej płytki. Następnie przykryj probówkę i inkubuj ją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby ocenić obszary kolumny Winogradsky'ego, dodaj około jednego grama materiału ze strefy tlenowej do T1 i ponownie zawiesić przez wirowanie. Następnie powtórz ten proces z jednym gramem materiału ze strefy beztlenowej. Wyjąć z inkubatora probówkę zawierającą roztwór zerowy zaszczepiony bakterią E. coli i wstrząsnąć nią. Następnie odpipetować jeden mililitr roztworu do probówki T1 i odwirować do wymieszania. Usuń jeden mililitr roztworu z T1 i przenieś go do T2, wirując, aby wymieszać. Powtórz ten proces przez rurkę T10. Aby ocenić strefy tlenowe i beztlenowe kolumny Winogradsky'ego, usuń jeden mililitr roztworu z każdej z wcześniej przygotowanych probówek T1 i przenieś go do odpowiednich probówek T2. Następnie kontynuuj seryjne rozcieńczenia przez probówki T10, jak pokazano wcześniej. Aby rozprowadzić płytkę, należy odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki z każdej probówki T3 na odpowiednią szalkę Petriego. Następnie za pomocą sterylnego pręta rozprowadzającego delikatnie rozprowadź próbkę na szalce Petriego i załóż pokrywkę płytki. Powtórzyć ten proces dla rozcieńczeń T6 i T9, jak wykazano wcześniej. Inkubować płytki zawierające organizmy tlenowe w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Inkubować płytki zawierające organizmy beztlenowe w komorze beztlenowej ustawionej na 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia wyjąć płytki rozcieńczające T3, T6 i T9 z inkubatora i komory beztlenowej i przenieść je na stół laboratoryjny. Pracując z jedną płytką na raz, przesuwaj sterylną pętlę zaszczepiającą po górnej części podłoża w zygzakowaty wzór. Następnie załóż pokrywę szalki Petriego. Następnie obróć płytkę o 1/3 i wysterylizuj pętlę, aby zmniejszyć częstotliwość wcześniej wykonanego zygzakowatego wzoru. Ponownie, po wysterylizowaniu pętli, obróć płytkę o 1/3, po raz ostatni zmniejsz częstotliwość zygzakowatego wzoru i załóż pokrywkę. Powtórz tę metodę smugowania dla pozostałych płytek, jak pokazano wcześniej. Następnie umieść na noc płytki z prążkami zawierające organizmy tlenowe w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a płytki z prążkami zawierające organizmy beztlenowe w komorze beztlenowej ustawionej na 37 stopni Celsjusza na noc. Kultury zostały zebrane ze stref tlenowych i beztlenowych siedmiodniowej Kolumny Winogradzkiej. Następnie kultury były seryjnie rozcieńczane przed smugami i rozprowadzeniem na płytkach agarowych LB. Smugi ujawniły mieszaną populację z każdej z ocenianych stref Winogradsky, a płytki rozsiewające dały podobne wyniki. Płytka z prążkami pochodzącymi z mieszanej populacji spowoduje powstanie kolonii bakterii o różnych kształtach, rozmiarach, fakturach i kolorach. W przeciwieństwie do tego, prążkowane i rozłożyste płytki zawierające znany organizm, E. coli, wykazały populację homologiczną. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest obliczyć CFU na mililitr przy użyciu średniej liczby kolonii trzech płytek rozprowadzonych z tą samą próbką i współczynnikiem rozcieńczenia. Pomnóż średnią liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia i podziel przez ilość podniesioną. Wreszcie, izolowane kolonie wybrane z każdej płytki mogą być wykorzystane w dalszych testach wzbogacających w celu określenia tożsamości gatunku.

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biologia zaawansowana

Microbiology

Mikrobiologia

counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

Description

Transcript

Tags