Name: measuring bacterial resistance with e-tests
Uploaded: 2023-04-30T07:10:10.000Z
Duration: 13 min 39 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Louisiana Student Standards for Science

High School

Life Sciences

from-molecules-to-organisms-structures-and-processes

From Molecules To Organisms: Structures And Processes

HS-LS1-8

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Antibiotic Susceptibility Testing: Epsilometer Tests to Determine MIC Values of Two Antibiotics and Evaluate Antibiotic Synergy

1. Badania epsilometryczne (E-testy)
<ol>
	<li>Ustawiać
	<ol>
		<li>Załóż rękawice i fartuch laboratoryjny</li>
		<li>Przygotuj miejsce pracy, sterylizując je przy użyciu 70% etanolu</li>
		<li>Zbieranie płytek agarowych Muellera-Hintona (płytki MHA)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie wzorca mętności McFarlanda nr 0,5
	<ol>
		<li>Przygotować 1% roztwór chlorku baru (BaCl2): 
		Dodać 1 gram bezwodnego chlorku baru (BaCl2) do 100 ml wody destylowanej. Dobrze wirować. </li>
		<li>Przygotuj 1% roztwór kwasu siarkowego (H2SO4): 
		Dodaj 1 ml stężonego H2SO4 w 99 ml wody destylowanej. Dobrze wirować. </li>
		<li>Przygotuj wzorzec mętności McFarlanda nr 0,5: 
		50 μL BaCl2 roztworu w 5 ml 1% roztworu H2SO4. Dobrze wymieszaj roztwór, aby uzyskać mętną zawiesinę. </li>
		<li>Utrzymuj wzorzec zmętnienia McFarland nr 0,5 w probówce pokrytej folią. Przechowywać w temperaturze 25°C maksymalnie 6 miesięcy. Przed użyciem dobrze przemieszać do jednorodnego roztworu. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek MHA
	<ol>
		<li>Zeskrob Streptococcus bakterie grupy G z płytki z krwią za pomocą sterylnej pętli. Wymieszaj z 1 ml soli fizjologicznej i wiruj do zawiesiny bakterii. </li>
		<li>Porównaj zawiesinę ze wzorcem McFarlanda nr 0,5, aby osiągnąć tę samą mętność, aby uzyskać ten sam rozmiar inokulum podczas eksperymentów. Dostosuj stężenie za pomocą dodatkowej soli fizjologicznej lub bakterii. </li>
		<li>Zaszczepij płytki MHA za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką. Delikatnie przetrzyj płytkę, aby pokryć powierzchnię. Postępuj zgodnie z jedną z trzech metod opisanych poniżej (1.4-1.6). </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pojedynczy test oporności na antybiotyki. Streptococcus grupa G, oporność na penicylinę G lub gentamycynę
	<ol>
		<li>Umieść pasek testowy E (penicylinę G lub gentamycynę) na środku płytki MHA (Rysunek 1 A,B). </li>
		<li>Inkubować przez 18-20 godzin, 37°C.</li>
		<li>Zapoznaj się z wynikami. MIC jest mierzony jako strefa inhibicji, która przecina stopniowany pasek testowy antybiotyku (Rysunek 1 C,D). </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig1.jpg"> 
Rysunek 1: Pojedynczy test elektroniczny. Umieszczenie paska testowego E A) penicyliny G i B) gentamycyny na płytce agarowej Muellera Hintona pokrytej koloniami bakteryjnymi paciorkowców grupy G przed (A i B) oraz po (C i D) inkubacji przez noc w temperaturze 37°C 5% CO2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>
<ol start="5">
	<li>Testowanie synergii w podejściu krzyżowym. Streptococcus grupa G, oporność na penicylinę G i gentamycynę.
	<ol>
		<li>Umieść dwa paski testowe E z różnymi antybiotykami (np. penicyliną G i gentamycyną) na zaszczepionej płytce MHA w układzie krzyżowym.
		<ol>
			<li>Aby uzyskać najdokładniejsze wyniki, należy dążyć do umieszczenia krzyżyka pod kątem około 90° na przecięciu skal przy ich wartościach MIC, wcześniej określonych w pojedynczym teście oporności na antybiotyki (Rysunek 2 A). </li>
			<li>Należy pamiętać, że po umieszczeniu pasków na płytce agarowej nie należy ich przesuwać, ponieważ niektóre antybiotyki mogły już zostać wchłonięte przez płytkę. Dlatego bardziej odpowiednie jest utrzymywanie pasków pod nieco niewłaściwym kątem (np. 85°) i do 1-2 mm od rzeczywistej wartości MIC. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu w trzech egzemplarzach, aby zmniejszyć ten problem. </li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkubować przez 18-20 godzin, 37°C.</li>
		<li>Zapoznaj się z wynikami. MIC jest mierzony jako strefa inhibicji, która przecina stopniowany pasek testowy antybiotyku na każdym odpowiednim pasku testowym E (Rysunek 2 B). </li>
		<li>Użyj wzoru na ułamkowe stężenie hamujące (FIC) (Równanie 1) w celu określenia synergii. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig2.jpg"> 
Rysunek 2: Wykrywanie synergizmu - test krzyżowy. Wyniki badań synergii przeciwdrobnoustrojowej MIC penicyliny G i gentamycyny na Streptococcus grupie G przed (A) i po (B) inkubacji przez noc w temperaturze 37°C 5% CO2. Pomiędzy dwiema indywidualnymi wartościami MIC tworzy się kąt 90° (penicylina G: 0,094 μg/ml, gentamycyna: 8 μg/ml). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>
<ol start="6">
	<li>Testowanie synergii bez podejścia krzyżowego. Streptococcus grupa G, oporność na penicylinę G i gentamycynę.
	<ol>
		<li>Umieść pasek testowy E na środku płytki MHA (Rysunek 3 A,D). </li>
		<li>Zaznacz miejsce, w którym na każdym pasku znajdowała się wcześniej określona wartość MIC. </li>
		<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. </li>
		<li>Wyrzuć pasek testowy E dla każdej płytki MHA (Rysunek 3 B,E). </li>
		<li>Umieść drugi pasek testu elektronicznego (zawierający inny antybiotyk) odpowiednio na obszarze wcześniej usuniętego paska, tak aby ich wartości MIC odpowiadały znakowi i były wyrównane. </li>
		<li>Inkubować przez 18-20 godzin, 37°C.</li>
		<li>Zapoznaj się z wynikami. MIC jest mierzony jako strefa inhibicji, która przecina stopniowany pasek testowy antybiotyku na każdym odpowiednim pasku testowym E (Rysunek 3 C,F). </li>
		<li>W celu wyznaczenia synergii stosuje się wzór na frakcjonowane stężenie hamujące (FIC) (Równanie 1). </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig3.jpg"> 
Rysunek 3: Wykrywanie synergizmu - test niekrzyżowy. Wyniki badań synergii przeciwdrobnoustrojowej MIC penicyliny G i gentamycyny na Streptococcus grupie G. A) Pasek gentamycyny (8 μg/ml wyśrodkowany) na wierzchu Streptococcus grupy G, B) Usunięcie paska gentamycyny, C) Połączony pasek G gentamycyny / penicyliny (0,094 μg/ml wyśrodkowany) na Streptococcus bakterie grupy G, D) Pasek penicyliny G (0,094 μg/ml wyśrodkowany), E) Usunięcie paska penicyliny G, F) Połączony pasek penicyliny G / gentamycyny (8 μg/ml wyśrodkowany) na wierzchu Streptococcus bakterii grupy G. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>
2. Testowanie bulionu
<ol>
	<li>Ustawiać
	<ol>
		<li>Nosić rękawiczki i fartuch laboratoryjny</li>
		<li>Przygotuj miejsce pracy, sterylizując je przy użyciu 70% etanolu</li>
		<li>Zbierz 15 ml bulionu MH z 50% lizowaną krwią końską i 20 mg/ml β-NAD (MH-F)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>(Opcjonalnie) Wykonaj test elektroniczny [Protokół 1], aby określić wartość MIC na podłożu stałym
	<ol>
		<li>Wiedza ta, choć opcjonalna, pozwoli na lepsze zaprojektowanie eksperymentu (np. stężenia dodanych antybiotyków mogą być zaprojektowane tak, aby otaczały wartość MIC wyznaczoną na podstawie płytki), zwiększając szanse na udany eksperyment. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie inokulum bakteryjnego. Jak wspomniano powyżej, stężenie bakterii można oszacować za pomocą pomiarów OD nm lub wzorców zmętnienia McFarlanda
	<ol>
		<li>Metoda OD600 nm
		<ol>
			<li>Otrzymać zawiesinę bakteryjną o ustalonym stężeniu bakteryjnym</li>
			<li>Rozcieńczyć kulturę w bulionie MH-F, aby uzyskać OD600 0,003</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Metoda zmętnienia McFarlanda
		<ol>
			<li>Umieść 15 ml bulionu MH-F w sterylnej probówce. </li>
			<li>Zaszczep bulion MH-F bakteriami (z talerza) do poziomu McFarlanda. Energicznie rozmieszaj roztwór. Wlej roztwór na sterylną szalkę Petriego. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie antybiotyków
	<ol>
		<li>Określ pożądane stężenie antybiotyków
		<ol>
			<li>Zidentyfikuj wartość MIC z testu E (np. 0,125 μg/ml dla penicyliny G i 8 μg/ml dla gentamycyny)</li>
			<li>Pomnóż wartość MIC płytki agarowej przez 24-27, co odpowiada czteremu-siedmiu 2-krotnym rozcieńczeniom szeregowym. Będzie to stężenie wyjściowe antybiotyków. (np. dla penicyliny G, siedem 2x seryjnych rozcieńczeń: 0,125 μg/ml x 27 = 16 μg/ml; dla gentamycyny cztery 2x seryjne rozcieńczenia 8 μg/ml x 24 = 128 μg/mL</li>
			<li>Pomnóż żądaną wartość początkową 100x, aby określić stężenie podstawowe antybiotyków (np. zapasy 1,6 mg/ml penicyliny G i 12,8 mg/ml gentamycyny)</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj odpowiednio 100-krotne stężenie antybiotyku
		<ol>
			<li>Rozpuść antybiotyki w 10 ml autoklalawowanej wody i wiruj, aby wytworzyć roztwór podstawowy (np. 16 mg penicyliny G i 128 mg gentamycyny, aby utworzyć powyższe zapasy)</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj bakterie do studzienek mikropłytki
	<ol>
		<li>Podaniec 200 μl bulionu MH-F zawierającego inokulum bakteryjne do studzienek w pierwszych 3 rzędach 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania do eksperymentu w trzech egzemplarzach. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj antybiotyki do studzienek mikropłytki
	<ol>
		<li>Dodaj 200 μl dodatkowego bulionu MH-F z bakteriami do pierwszej kolumny studzienek (A1, B1, C1), aby uzyskać całkowitą objętość do 400 μL.</li>
		<li>Dodaj 4 μl podstawowego stężenia antybiotyków do pierwszej kolumny studzienek. Ponieważ próbka zawiera 400 μl, spowoduje to 100-krotne rozcieńczenie antybiotyków. </li>
		<li>Wygeneruj 2x seryjne rozcieńczenie, przenosząc 200 μl bakterii/antybiotyków z A1 do A2, aż do A11. Energicznie pipetować między rozcieńczeniami. Powtórz ten krok dla dodatkowych wierszy. </li>
		<li>Usunąć 200 μl z kolumny 11, tak aby końcowa objętość we wszystkich studzienkach wynosiła 200 μl.</li>
		<li>Pozostawić ostatnią kolumnę (A12, B12, C12) bez antybiotyków, jako kontrolę. </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ wartości mikrofonu
	<ol>
		<li>Inkubować 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37°C bez wstrząsania. </li>
		<li>Wartość MIC jest definiowana jako ostatni studzienka w serii rozcieńczeń, która nie wykazuje widocznego wzrostu bakterii (Rysunek 4). Tej wartości można jednak zaufać tylko wtedy, gdy oryginalny rozmiar inokulum był prawidłowy. </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig4.jpg"> 
Rysunek 4: Oznaczanie MIC przez rozcieńczenie bulionu. MIC jest tutaj zdefiniowany jako ostatnia studzienka, która wykazuje klarowność (brak rozwoju bakterii) przed zmianą zmętnienia. Wiersz to duplikaty wartości MIC penicyliny G, a wiersz to duplikaty wartości MIC gentamycyny, oba w porównaniu z izolatem Streptococcus grupy G. A) rzeczywisty wynik eksperymentu, B) schematyczna interpretacja wartości z A (szary = brak wzrostu; biały = wzrost). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig5.jpg"> 
Rysunek 5: Schematyczna procedura serii rozcieńczeń w celu zliczenia pierwotnego stężenia bakterii. Rozcieńczenia przeprowadzono zgodnie z opisem (20 μl rozcieńczone w 180 μl dla serii 10-krotnych rozcieńczeń), a następnie 10 μl z rzędów A-H posiewa się na dwóch oddzielnych płytkach agarowych z krwią, jak wskazano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>
<ol start="8">
	<li>Określ pierwotną wielkość inokulum 
	UWAGA: Testy mikrobulionu są bardzo czułe dla oryginalnej wielkości użytego inokulum. Nadmierny rozmiar inokulum da fałszywie dodatni wynik, ponieważ dodane antybiotyki nie będą już w stanie hamować wzrostu w tym stosunku. Dlatego tak ważne jest, aby sprawdzić, ile bakterii zostało dodanych do mikrostudzienek. Chociaż dane nie będą dostępne w momencie eksperymentu (ze względu na konieczność 24-godzinnej inkubacji), posłużą jako kontrola. Jeśli liczba dodanych bakterii mieści się w podanym zakresie stężeń, można ufać wartościom MIC. Jeśli inokulum było zbyt wysokie lub zbyt niskie, eksperyment należy powtórzyć.
	<ol>
		<li>Seryjnie rozcieńcz bakterie
		<ol>
			<li>Przygotować 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania, aby rozcieńczyć pierwotne stężenie bakterii w celu określenia wielkości inokulum. Optymalna jest objętość 200 μL z 105-6 bakterii. Aby przeprowadzić rozcieńczenia, najpierw podwielokrotność 180 μl sterylnego PBS do każdej studzienki w B-H (w trzech powtórzeniach 1-3). </li>
			<li>Następnie dodać 100 μl roztworu bakteryjnego do A (w trzech powtórzeniach 1-3). </li>
			<li>Uzyskać 10-krotne seryjne rozcieńczenie (w trzech powtórzeniach), przenosząc 20 μl bakterii z punktu A do punktu B, energicznie pipetować. Powtórz kroki dla C-H. </li>
		</ol>
		</li>
		<li>Płytki z rozcieńczeniami bakterii do określenia wielkości inokulum
		<ol>
			<li>Oznacz płytki agaru z krwią zgodnie z Rysunek 5. </li>
			<li>Przenieść 10 μl z rozcieńczenia szeregowego na płytkę zgodnie z Rysunek 5. </li>
			<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 20-24 godziny. </li>
		</ol>
		</li>
		<li>Określ wielkość inokulum bakteryjnego
		<ol>
			<li>Policz liczbę bakterii w miejscach w obrębie 5-50 kolonii (Rysunek 6). </li>
			<li>Obliczyć początkową wielkość inokulum, obliczając średnią z trzech próbek, pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia (np. 10x dla próbek B, 100x dla próbek C, 1000x dla próbek D itd.), a następnie przez 100, aby skompensować objętość plamki wynoszącą 10 μl, co daje wielkość inokulum w jtk/ml. Jeśli inokulum mieści się w zakresie 105-6 jtk/ml, można ufać danym MIC. </li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10512/10512fig6.jpg"> 
Rycina 6: Określenie wielkości inokulum. Bakterie zaszczepione zgodnie z rysunkiem 5 inkubowano przez 20-24 godziny w temperaturze 37°C, a następnie policzono. Rząd D ma dużą liczbę rodzin do policzenia (np. 5-50). Próbki w A są nierozcieńczone, B rozcieńcza się 10x, C rozcieńcza się 100x, a D rozcieńcza się 1000x, a w każdym miejscu podaje się tylko 10 μl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10512/10512fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku. </a>

Oporność na antybiotyki jest ogólnoświatowym problemem zdrowotnym. W celu określenia mechanizmów oporności drobnoustrojów kluczowe znaczenie ma badanie metod pod kątem synergii i antagonizmu z różnymi antybiotykami. Metoda E-test jest szybka, łatwa do powtórzenia i może być wykorzystana do zbadania potencjału synergicznego terapii skojarzonych. Metodę rozcieńczania bulionu można również ocenić w celu przewidywania aktywności bakteriobójczej. Aby zbadać mechanizmy oporności różnych drobnoustrojów, kluczowa jest wiedza na ...

badanie wrażliwości na antybiotyki: testy epsilometryczne w celu określenia wartości mic dwóch antybiotyków i oceny synergii antybiotyków

Źródło: Anna Bläckberg1, Rolf Lood1 
1 Wydział Nauk Klinicznych Lund, Wydział Medycyny Zakaźnej, Centrum Biomedyczne, Uniwersytet w Lund, 221 00 Lund Szwecja
Wiedza na temat interakcji między antybiotykami a bakteriami jest ważna dla zrozumienia, w jaki sposób drobnoustroje ewoluują oporność na antybiotyki. W 1928 roku Alexander Fleming odkrył penicylinę, antybiotyk, który działa przeciwbakteryjnie poprzez zakłócanie regeneracji ściany komórkowej (1). Następnie odkryto inne antybiotyki o różnych mechanizmach działania, w tym leki hamujące replikację DNA i translację białek u bakterii; Jednak w ostatnich latach nie opracowano żadnych nowych antybiotyków. Oporność na obecne antybiotyki wzrasta, co prowadzi do poważnych chorób zakaźnych, których nie można skutecznie leczyć (2). W tym miejscu opisujemy kilka metod oceny oporności na antybiotyki w populacjach bakterii. Każda z tych metod działa, niezależnie od mechanizmu działania stosowanych antybiotyków, ponieważ miarą jest śmierć bakterii. Oporność na antybiotyki rozprzestrzenia się nie tylko szybko w szpitalach, ale także w całym społeczeństwie. W celu zbadania takich sposobów odporności opracowano różne metody, w tym test epsilometryczny (test E) i test rozcieńczenia bulionu (3). 
Test elektroniczny jest dobrze ugruntowaną metodą i jest opłacalnym narzędziem, które określa ilościowo dane dotyczące minimalnego stężenia hamującego (MIC), najniższego stężenia środka przeciwdrobnoustrojowego, które hamuje widoczny wzrost drobnoustroju. W zależności od szczepu bakteryjnego i zastosowanych antybiotyków wartość MIC może wahać się od sub μg/ml do &gt;1000 μg/ml (4). Test elektroniczny jest wykonywany przy użyciu plastikowego paska zawierającego predefiniowany gradient antybiotyku, na którym nadrukowana jest skala odczytu MIC w μg/ml. Pasek ten jest bezpośrednio przenoszony na matrycę agaru po nałożeniu na zaszczepioną płytkę agarową. Po inkubacji wzdłuż pasa widoczna jest symetryczna eliptyczna strefa hamowania, która zapobiega rozwojowi bakterii. MIC jest definiowany przez obszar zahamowania, który jest punktem końcowym, w którym elipsa przecina pas. Inną powszechną metodą określania wartości MIC jest metoda rozcieńczania mikrobulionu. Rozcieńczenie mikrobulionu obejmuje różne stężenia środka przeciwdrobnoustrojowego dodanego do pożywki bulionowej zawierającej zaszczepione bakterie. Po inkubacji MIC definiuje się jako najniższe stężenie antybiotyku, które zapobiega widocznemu wzrostowi (5). Jest to również metoda ilościowa i może być stosowana do kilku bakterii. Do wad tej metody należy możliwość wystąpienia błędów przy przygotowywaniu stężeń odczynników oraz duża liczba odczynników wymaganych do przeprowadzenia eksperymentu. Pomiar oporności na antybiotyki jest niezbędny zarówno z perspektywy klinicznej, jak i badawczej, a te metody badania oporności in vitro zostały omówione i zaprezentowane poniżej. 
Profil oporności na określoną bakterię można zastosować w celu optymalizacji leczenia antybiotykami w celu określenia, czy pacjent odniesie korzyści z leczenia skojarzonego w porównaniu z pojedynczą terapią. W przypadku stosowania więcej niż jednego antybiotyku jednocześnie konieczne jest poznanie ich wzajemnych interakcji oraz tego, czy mają działanie dodatkowe, synergistyczne czy antagonistyczne. Efekt addytywny można zaobserwować, gdy łączne działanie antybiotyków jest równe sile działania poszczególnych antybiotyków podawanych w jednakowej dawce. Z drugiej strony synergia między antybiotykami występuje wtedy, gdy łączne działanie antybiotyków jest silniejsze niż w przypadku, gdyby lek był podawany samodzielnie (6). Stosowanie kombinacji leczenia przeciwbakteryjnego stosuje się w celu uniknięcia wystąpienia oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe, a tym samym w celu wzmocnienia efektu indywidualnego leczenia antybiotykami (7). Wiedza na temat antagonizmu jest również równie ważna, aby zapobiec niepotrzebnemu stosowaniu kombinacji środków przeciwdrobnoustrojowych. Metodologia e-testów oferuje proste i kilka sposobów określenia możliwej synergii i antagonizmu między różnymi środkami przeciwdrobnoustrojowymi. Aby stawić czoła rozprzestrzenianiu się patogenów opornych na antybiotyki, ważna jest wiedza na temat możliwych synergicznych i antagonistycznych mechanizmów niektórych antybiotyków, co skutkuje skutecznością kliniczną i walką z opornością wielolekową. 
Określenie synergii za pomocą testów elektronicznych można podzielić na dwa szerokie podejścia: testy krzyżowe i niekrzyżowe. Podczas gdy oba testy synergii opierają się na wcześniejszej wiedzy na temat poszczególnych wartości MIC, oba podejścia różnią się nieco pod względem metodologii i podejścia koncepcyjnego. W teście synergii krzyżowej pierwszy antybiotyk z badanej pary umieszcza się na płytce agarowej zaszczepionej bakteriami. Po umożliwieniu, aby antybiotyki z pierwszego paska wprowadziły się do płytki (np. po 1 godzinie), pasek jest usuwany, a nowy pasek zawierający drugi antybiotyk umieszcza się dokładnie w tym samym miejscu co pierwszy, upewniając się, że dwie indywidualne wartości MIC są umieszczone jedna na drugiej. Powstałą strefę inhibicji można następnie przeanalizować w sposób opisany powyżej, a synergię obliczyć na podstawie równania 1. 
Równanie 1 - Frakcjowe stężenia hamujące (FIC)
<img src="/files/ftp_upload/10512/10512eq1.jpg">
Wartości &gt;0,5 wskazują na synergię. 
Nagradzając egzaminatora łatwymi do analizy płytkami, metoda ta jest nieco pracochłonna i czasochłonna ze względu na zmianę pasków, a także konieczność użycia dwóch płytek w jednym eksperymencie. Zamiast tego często stosuje się test krzyżowy. Zamiast dodawać dwa różne paski testowe E następnie jeden na drugim (po usunięciu pierwszego), oba są umieszczane jednocześnie, ale w formie krzyża (kąt <img align="center" src="/files/ftp_upload/10512/10512eq3.jpg"> 90°), przy czym dwie wcześniej określone wartości MIC tworzą kąt 90°. Dzięki takiemu podejściu na test synergii potrzebna jest tylko jedna płytka, a także mniej pracy, co czyni ją preferowanym wyborem, mimo że jest nieco trudniejsza do analizy. Nowe wartości MIC w podejściu skojarzonym z antybiotykami można zwizualizować jako zmodyfikowane strefy hamowania, po których synergię można określić za pomocą równania 1. 
Zamiast stosowania podejścia opartego na płytkach agarowych, podejście oparte na mikrobulionie może być często preferowane ze względu na jego większą elastyczność (np. możliwość wyboru określonych stężeń antybiotyków poza limitami paska testowego E). Ponadto sugeruje się, że testy mikrobulionowe są bardziej czułe ze względu na równomierne rozprowadzenie antybiotyków w płynnym roztworze, niezależnej od dysocjacji w fazie stałej (płytka agarowa). Studzienki w 96-dołkowej mikropłytce zostaną zaszczepione określoną liczbą bakterii (106 jtk/ml: stężenie bakterii można oszacować za pomocą pomiarów OD600 nm, norm zmętnienia lub przez rozprowadzenie próbek posiewu z 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń bakteryjnych), a do studzienek zostaną dodane antybiotyki w różnych rozcieńczeniach. Podobnie jak w przypadku pasków testowych E, MIC określa się jako punkt przecięcia (studnia/plamka) o najniższym stężeniu antybiotyków hamujących widoczny rozwój bakterii. 
Cel eksperymentalny
<ul>
	<li>Poniższy projekt opisuje strategie oznaczania wartości MIC penicyliny G i gentamycyny Streptococcus grupy G za pomocą dwóch różnych metod, testu E i rozcieńczenia mikrobulionu. W teście E użyto płytek agarowych Muellera-Hintona zaszczepionych Streptococcus grupy G w połączeniu z paskami gradientowymi penicyliny G i/lub gentamycyny; podczas gdy bulion MH z 50% lizowaną krwią końską i 20 mg/ml β-NAD stosowano z rozpuszczalnymi antybiotykami razem z Streptococcus grupy G w podejściu mikrobulionowym. </li>
</ul>
Materiały
<ul>
	<li>Kolonie bakteryjne na płytce z agarem z krwią, przechowywane &lt;7 dni w temperaturze 4°C</li>
	<li>Płytki z agarem z krwią</li>
	<li>0.5 Standardowy McFarland
	<ul>
		<li>1% BaCl2</li>
		<li>1% H2SO4</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Rurka z solą fizjologiczną (2 ml)</li>
	<li>Aplikator z bawełnianą końcówką</li>
	<li>Płytki agarowe Muellera-Hintona (płytki MHA)</li>
	<li>Rosół MH z 50% lizowaną krwią końską i 20 mg/ml β-NAD (MH-F)</li>
	<li>E-test penicylina/gentamycyna (lub antybiotyki będące przedmiotem zainteresowania) (BioMérieux, Marcy l'Etoile, Francja, Szwecja)</li>
	<li>Antybiotyki penicylina/gentamycyna (lub antybiotyki będące przedmiotem zainteresowania (proszek/roztwór))</li>
</ul>
Uwaga: Konkretne podłoża używane do rozwoju bakterii mogą się różnić w zależności od gatunku.

Wartości MIC w teście elektronicznym 
Poszczególne wartości MIC zostały zidentyfikowane na Rysunek 1 jako 0,094 μg/ml dla penicyliny G i 8 μg/ml dla gentamycyny. W przypadku testów synergii oba wykazały wartość MIC dla penicyliny G wynoszącą 0,064 μg/ml (Ryc. 2, 3), podczas gdy gentamycyna miała wartość MIC 4 μg/ml dla testów krzyżowych i niekrzyżowych. Należy zauważyć, że może wystąpić niewielka rozbieżność między testami krzyżowymi i niekrzy...

Badanie wrażliwości na antybiotyki: testy epsilometryczne w celu określenia wartości MIC dwóch antybiotyków i oceny synergii antybiotyków

Source: Anna Bl&#228;ckberg1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 ...

Wrażliwość na antybiotyki definiuje się jako wrażliwość bakterii na antybiotyki i można ją zmierzyć za pomocą testu rozcieńczenia bulionu lub testu epsilometru, zwanego również testem E. W metodzie rozcieńczania bulionu standaryzowaną liczbę bakterii dodaje się do pożywki wzrostowej zawierającej seryjne rozcieńczenia antybiotyków. Jeśli bakterie są podatne, nie mogą rosnąć przy wyższych stężeniach antybiotyków, ale nadal namnażają się przy niższych stężeniach antybiotyków, powodując zmętnienie pożywki. Najniższe stężenie antybiotyku, przy którym bakterie nie mogą już przetrwać ani się namnażać, określa się mianem minimalnego stężenia hamującego (MIC) wartości antybiotyku dla danej bakterii. W teście elektronicznym plastikowy pasek nasączony wstępnie zdefiniowanym gradientem antybiotyku nakłada się na świeżo rozłożysty trawnik bakterii na agarze Muellera-Hintona lub MH-A na płytce Petriego. Antybiotyk dyfunduje do podłoża agarowego, gdzie jest pobierany przez bakterie. Jeśli bakterie są podatne, nie mogą się namnażać i wymierają, tworząc wyraźną strefę wokół paska E, która jest określana jako strefa zahamowania wzrostu. W punkcie, w którym narośl przecina się z paskiem E, odpowiednia wartość na skali daje wartość MIC antybiotyku. Często antybiotyki stosuje się w połączeniu, aby zapobiec pojawianiu się szczepów bakterii opornych na antybiotyki. Często prowadzi to do efektu synergicznego, a nie addytywnego. Synergiczny oznacza, że łączny efekt dwóch antybiotyków jest większy niż suma ich indywidualnych działań. Jednak efekt ten uważa się za znaczący tylko wtedy, gdy wartość MIC kombinacji antybiotyków zmniejsza się co najmniej dwukrotnie. Kryterium to ocenia się, obliczając wskaźnik frakcji stężenia hamującego lub FIC. Sumując stosunek wartości MIC każdego antybiotyku w połączeniu z wartością MIC każdego antybiotyku z osobna, wskaźnik FIC mniejszy niż 0,5 wskazuje na synergię. Synergię antybiotyków można zmierzyć za pomocą dwóch metod opartych na teście elektronicznym: testu niekrzyżowego lub testu krzyżowego. W teście niekrzyżowym, po pierwsze, paski E dla dwóch różnych antybiotyków o z góry określonych wartościach MIC są nakładane na dwie oddzielne płytki. Po dyfuzji antybiotyków do pożywki, oryginalne paski E są usuwane, a paski E dla alternatywnych antybiotyków są umieszczane w taki sposób, aby ich skale MIC leżały dokładnie nad skalami MIC poprzednich pasków. W teście krzyżowym, który jest szybszą wersją testu niekrzyżowego, paski E dwóch antybiotyków są umieszczane razem w układzie krzyżowym, tak że skale ich znaków MIC tworzą kąt 90 stopni na przecięciu. Po inkubacji w obu technikach, wartość MIC każdego antybiotyku w połączeniu z innym antybiotykiem jest odczytywana w punkcie, w którym strefa zahamowania wzrostu przecina się z krawędzią paska E. Następnie obliczany jest indeks FIC. Ten film pokaże, jak określić wartość MIC danego antybiotyku dla danej bakterii za pomocą testu E i testu rozcieńczenia mikrobulionu. Dowiesz się również, jak określić synergię między dwoma antybiotykami za pomocą testu krzyżowego i testu niekrzyżowego. Na początek załóż odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice laboratoryjne i fartuch laboratoryjny. Następnie wysterylizuj przestrzeń roboczą przy użyciu 70% etanolu. Następnie zbierz 15 mililitrów sterylnego bulionu Muellera-Hintona z 50% lizowaną krwią końską i 20 miligramami na mililitr beta-nikotynamidu. I od pięciu do ośmiu płytek agarowych Muellera-Hintona. Teraz, aby przygotować wzorzec zmętnienia McFarlanda o liczbie 0,5, odmierz 9,95 mililitra 1% roztworu kwasu siarkowego. Następnie dodaj 50 mikrolitrów 1% roztworu chlorku baru do roztworu kwasu siarkowego. Dobrze wymieszać roztwór, aby uzyskać mętną zawiesinę. Przykryj tubę folią aluminiową i odłóż ją na bok. Następnie dozuj jeden mililitr roztworu soli fizjologicznej do 15-mililitrowej probówki. Użyj sterylnej pętli, aby zeskrobać próbkę wzrostu bakterii z płytki testowej bakterii, tutaj, Streptococcus grupy G. Następnie umieść pętlę obciążoną bakteriami w roztworze soli fizjologicznej, delikatnie wymieszaj, a następnie dobrze przekręć rurkę. Teraz umieść zawiesinę bakteryjną i wzorce mętności McFarlanda obok siebie i porównaj je pod kątem równoważności zmętnienia. Dodaj dodatkową sól fizjologiczną lub kolonie bakteryjne, aż zmętnienie zawiesiny bakteryjnej będzie zgodne z wzorcem. Po uzyskaniu pożądanego zmętnienia zanurz sterylny aplikator z bawełnianą końcówką w zawiesinie bakteryjnej. Aby zaszczepić płytkę MH-A, delikatnie przetrzyj całą powierzchnię płytki ruchem zygzakowatym. Następnie oznacz dolne strony płytek nazwą bakterii i datą. Aby rozpocząć, wyjmij pasek testowy penicyliny G E, trzymając go za krawędź kleszczami. Delikatnie umieść pasek na środku świeżo pobranej płytki MH-A i załóż pokrywkę. W tym przykładzie testowany jest również drugi antybiotyk, gentamycyna. W ten sposób proces umieszczania pasków powtarza się z drugą płytką i paskiem testowym E gentamycyny. Aby określić wyniki testu E, zbierz pierwszą płytkę zawierającą pasek testowy E penicyliny G. Teraz określ punkt, w którym strefa inhibicji przecina się z paskiem antybiotyku. Odczytaj odpowiednią wartość liczbową na skali. Wartość ta reprezentuje wartość MIC penicyliny G. W ten sam sposób należy określić wartość MIC dla gentamycyny. Na początek zaszczep płytkę MH-A bakteriami szczepu Streptococcus z grupy G. Oznacz spód płytki nazwą bakterii, antybiotykami, które należy zastosować, oraz datą. Teraz umieść pasek testowy E dla antybiotyku, który Cię interesuje, na środku płytki. Następnie przytrzymaj drugi pasek testowy pod kątem 90 stopni do pierwszego paska i zlokalizuj jego znak MIC. Delikatnie ułóż drugą taśmę E nad pierwszą w miejscu, w którym przecinają się dwie wartości MIC. Po umieszczeniu pasków nie przesuwaj ich. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 20 godzin. Po zaszczepieniu dwóch płytek MH-A bakteriami szczepu Streptococcus grupy G, umieść pasek E-test dla jednego antybiotyku na powierzchni jednej płytki. Następnie umieść pasek E-testu dla drugiego antybiotyku na drugiej płytce, jak pokazano. Za pomocą plastikowej pętli do zaszczepiania zaznacz wartość MIC każdego antybiotyku na powierzchni odpowiedniej płytki. Następnie przykryj płytki i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie użyj kleszczy, aby usunąć paski E. Następnie zbierz jedną z płytek i pasek E-test dla drugiego antybiotyku. Przytrzymaj pasek testowy E nad odciskiem pozostawionym przez pierwszy pasek i zlokalizuj punkt, w którym wartość MIC na pasku E pokrywa się z zaznaczoną linią. Delikatnie umieść pasek w tym punkcie przecięcia. Powtórz ten proces dla drugiej płytki i inkubuj obie płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 20 godzin. Najpierw uzyskaj zawiesinę bakteryjną o ustalonym stężeniu bakterii i rozcieńcz kulturę w bulionie MHF, aby uzyskać OD600 0,003. Następnie odważ 16 miligramów penicyliny G i 128 miligramów gentamycyny. Przenieś każdy zważony suchy antybiotyk do stożkowych probówek o pojemności 215 mililitrów. Dodaj 10 mililitrów wody destylowanej do każdej ze stożkowych rurek i dobrze wymieszaj, wirując. Oznacz probówki nazwą i stężeniem antybiotyku. Wykonując test w trzech powtórzeniach, dodać 400 mikrolitrów roboczego roztworu bakteryjnego do pierwszych studzienek w trzech rzędach 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roboczego roztworu bakteryjnego w bulionie MHF do studzienek w trzech rzędach. Teraz, aby wygenerować dwukrotne seryjne rozcieńczenie antybiotyku, najpierw dodaj cztery mikrolitry antybiotyku do pierwszego dołka, generując 100-krotne rozcieńczenie. Sekwencyjnie przenieś 200 mikrolitrów roztworu bakterio-antybiotyku do każdej studzienki, zaczynając od pierwszego dołka przez drugi do ostatniego dołka w każdym rzędzie, upewnij się, że prawidłowe mieszanie przez pipetowanie dwa do trzech razy po każdym przeniesieniu. Wyrzuć ostatnie 200 mikrolitrów roztworu bakterii i antybiotyku. Aby określić wyniki testu mikrorozcieńczenia bulionu na obecność penicyliny G, należy najpierw zlokalizować studzienki, w których nie ma widocznego wzrostu bakterii, co wskazuje na brak zmętnienia. Z tych studzienek zidentyfikuj studzienkę o najniższym stężeniu antybiotyku. Reprezentuje to wartość MIC penicyliny G dla badanych bakterii. Wartość MIC gentamycyny można określić przy użyciu tego samego testu i techniki. Aby określić wyniki testu niekrzyżowego, należy pobrać pierwszą płytkę, która zawiera pasek penicyliny G E. Następnie określ punkt, w którym strefa zahamowania wzrostu przecina się z paskiem antybiotyku. Odpowiednia wartość na skali reprezentuje wartość MIC dla penicyliny G w połączeniu z gentamycyną. W tym przykładzie wartość MIC w połączeniu wynosi 0,064 mikrograma na mililitr. Teraz należy pobrać drugą płytkę, która zawiera pasek gentamycyny E i określić wartość wartości MIC w połączeniu, jak pokazano wcześniej. Aby ocenić wpływ połączenia, najpierw oblicz frakcyjne stężenie hamujące lub FIC dla penicyliny G, dzieląc MIC w połączeniu przez MIC samego antybiotyku. Powtórz ten proces dla gentamycyny. Następnie oblicz wskaźnik FIC, korzystając z równania pokazanego tutaj. Dwukrotne zmniejszenie wartości MIC w połączeniu daje wartość wskaźnika FIC mniejszą lub równą 0,5 i wykazuje synergię między penicyliną G a gentamycyną. W tym przypadku obliczona wartość FIC wynosi 1,18, czyli jest większa niż 0,5. W związku z tym wyniki nie wykazują synergii między penicyliną G i gentamycyną a szczepem Streptococcus grupy G. Aby określić wyniki testu krzyżowego, najpierw określ punkt, w którym strefy zahamowania wzrostu przecinają się z odpowiednimi paskami E. Odczytaj wartość liczbową na każdym pasku testowym E, który odpowiada temu punktowi przecięcia. Wartości te reprezentują wartość MIC w połączeniu dla penicyliny G i gentamycyny. Następnie, aby ocenić efekt kombinacji, oblicz wskaźnik FIC za pomocą równania pokazanego tutaj. W tym przykładzie obliczona wartość FIC wynosi 1,18, czyli jest większa niż 0,5. Oznacza to, że penicylina G i gentamycyna nie działają synergistycznie przeciwko szczepowi Streptococcus grupy G.

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Biologia zaawansowana

Microbiology

Mikrobiologia

measuring bacterial resistance with e-tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform.

The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with bacteria, and the MIC scale is printed directly on the strip in micrograms per milliliter. After incubation, an ellipse-shaped zone appears where growth is blocked. The MIC is read where that inhibition zone meets the strip.

A similar MIC method is microbroth dilution. In this approach, bacteria are placed in broth with different antibiotic concentrations. After incubation, the MIC is the lowest concentration that still stops visible growth. This method is quantitative and can be used with several bacteria, although it can require many reagents and careful preparation of the concentrations.

Knowing a bacterium’s resistance profile can help guide treatment choices. It can show whether a patient may benefit from one antibiotic or from a combination. When two antibiotics are used together, they may act in an additive, synergistic, or antagonistic way. Additive means the combined effect matches the effect of each drug at equal dose, while synergy means the combined effect is stronger than either drug alone.

E-tests can also be used to look for synergy and antagonism between antimicrobial agents. One method is non-cross testing. In this setup, one antibiotic strip is first placed on the agar plate, allowed to diffuse, and then removed. A second strip is placed in the same position, with the two MIC values aligned, and the result is used to calculate the fractional inhibitory concentration, or FIC. Values above 0.5 show synergy. This method is simple to read, but it takes more time and uses two plates.

A faster option is the cross test. Here, both E-test strips are placed at the same time in a 90-degree cross, with the known MIC values meeting at the angle. Only one plate is needed, so the method saves work, although the result can be a little harder to analyze. The changed inhibition zones are then used to determine whether the antibiotics act synergistically.

A broth-based approach can also be used for combination testing. It gives more flexibility because specific antibiotic concentrations can be chosen outside the limits of an E-test strip. It may also be more sensitive because the antibiotics are evenly distributed in liquid, rather than relying on diffusion through agar. In this method, wells in a 96-well plate are filled with a set number of bacteria and different antibiotic dilutions, and the MIC is the lowest concentration that prevents visible growth.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

measuring-bacterial-resistance-with-e-tests

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Learn how E-tests and microbroth dilution measure MIC values, and how cross and non-cross setups reveal antibiotic synergy in bacteria.

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests | JoVE K12

Georgia Standards of Excellence

9-12

Biology

SB6.e

Anna Bläckberg

Rolf Lood

Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center

Lund University

Concepts

Preparation of Plates and Bacteria

Determining MIC Using E-Test

Synergy Testing: Cross Approach

Synergy Testing: Non-Cross Approach

MIC Determination Using Broth Dilution

Data Analysis: Broth Microdilution

Data Analysis and Results: Synergy Testing

Nucleic Acids and Nucleotides

Nucleic acids are the most important macromolecules for the continuity of life. They carry the cell&#39;s genetic blueprint and have instructions for its ...

Nucleic Acid Structure

The pentose sugar in DNA is deoxyribose, while in RNA the pentose sugar is ribose. The difference between the sugars is the presence of the hydroxyl group ...

DNA Base Pairing

Erwin Chargaff&#x2019;s rules on DNA equivalence paved the way for the discovery of base pairing in DNA. Chargaff&#x2019;s rules state that in a ...

From DNA to Protein

The flow of genetic information in cells from DNA to mRNA to protein is described by the central dogma, which states that genes specify the sequence of ...

The DNA Helix

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most viruses. DNA ...

The Central Dogma

The central dogma explains the flow of genetic information from DNA nucleotides to the amino acid sequence of proteins.
RNA is the Missing Link Between ...

Genomic DNA in Prokaryotes

The genome of most prokaryotic organisms consists of double-stranded DNA organized into one circular chromosome in a region of cytoplasm called the ...

Genomic DNA in Eukaryotes

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. To fit their genomes into a cell, eukaryotic DNA is packaged extraordinarily tightly inside the ...

Overview

Deoxyribonucleic acid, or DNA, is the genetic material responsible for passing traits from generation to generation in all organisms and most ...

DNA Packaging

Overview

Eukaryotes have large genomes compared to prokaryotes. In order to fit their genomes into a cell, eukaryotes must pack their DNA tightly inside ...

RNA Structure

Overview
The basic structure of RNA consists of a five-carbon sugar and one of four nitrogenous bases. Although most RNA is single-stranded, it can form ...

RNA Stability

Intact DNA strands can be found in fossils, while scientists sometimes struggle to keep RNA intact under laboratory conditions. The structural variations ...

pre-mRNA Processing

In eukaryotic cells, transcripts made by RNA polymerase are modified and processed before exiting the nucleus. Unprocessed RNA is called precursor mRNA or ...

Types of RNA

Overview
Three main types of RNA are involved in protein synthesis: messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), and ribosomal RNA (rRNA). These RNAs ...

DNA as a Genetic Template

What is Gene Expression?

A gene is a stretch of DNA that serves as the blueprint for functional RNAs and proteins. Since DNA is comprised&#160; of nucleotides and proteins are ...

Transcription

Transcription is the synthesis of RNA from a DNA sequence by RNA polymerase. It is the first step in producing a protein from a gene sequence. ...

Translation

Translation is the process of synthesizing proteins from the genetic information carried by messenger RNA (mRNA). Following transcription, it constitutes ...

Ribosomes

Ribosomes translate genetic information encoded by messenger RNA (mRNA) into proteins. Both prokaryotic and eukaryotic cells have ribosomes. Cells that ...

tRNA Activation

Initiation of Translation

Termination of Translation

What are Cells?

Cell Diversity

The concept of a cell started with microscopic observations of dead cork tissue by Robert Hooke in 1665. Hooke coined the term &#34;cell&#34; based on the ...

Cells of the Epidermis

The epidermis is made of four or five layers of epithelial cells, depending on its location in the body. From deep to superficial, these layers are the ...

Bone Cells and Tissue

Bones contain a relatively small number of cells entrenched in a matrix of organic and inorganic components. Although bone cells compose only a small ...

Gross Anatomy of Skeletal Muscles

The connective tissues play a significant role in arranging the muscle fibers into a hierarchical structure that forms a complete muscle. Consider a ...

Structure of Cardiac Muscles

Cardiac muscle, or myocardium, is a specialized type of muscle found exclusively in the heart. Its unique structural and functional characteristics enable ...

structure-and-organization-of-smooth-muscles

Structure and Organization of Smooth Muscles

In the human body, smooth muscle tissue is found lining the visceral and tubular organs such as the liver, lungs, blood vessels, and respiratory tract.
...

Chromosome Replication

Before a cell can divide, it must accurately replicate all of its chromosomes, including the DNA and its associated histone and non-histone ...

Neurons: The Cell Body and the Dendrites

A typical nerve cell comprises three main components: the cell body, dendrites, and the axon. The cell body, also known as the soma or perikaryon, serves ...

Lampbrush Chromosomes

In 1882, Flemming observed lampbrush chromosomes (LBC) in salamander eggs. Later in 1892, R&#252;ckert observed LBCs in shark egg cells and coined the ...

Neurons: The Axon

The axon is a long, thin extended portion of the neuron that carries impulses from its cell body toward the effector cell.
Axoplasm, the axon&#39;s ...

Polytene Chromosomes

Polytene chromosomes are giant interphase chromosomes with several DNA strands placed side by side. They were discovered in the year 1881 by Balbiani in ...

Nervous Tissue: Neuron Types

Neurons, the fundamental units of the nervous system, can be classified based on both their structural and functional characteristics.
Structurally, ...

Euchromatin

The extent of chromatin compaction can be studied by staining chromatin using specific DNA binding dyes. Under the microscope, the dense-compacted regions ...

Nervous Tissue: Glial Cells

Glial cells or neuroglia are non-neuronal cells in the nervous system that outnumber neurons. These include astrocytes, oligodendrocytes, microglia, and ...

Heterochromatin

Lymphoid Cells and Tissues

Lymphoid cells and lymphoid tissues are the two major components of lymphoid organs.
Lymphoid cells consist of immune system cells such as B and T ...

chromatin-position-affects-gene-expression

Chromatin Position Affects Gene Expression

Chromatin is the massive complex of DNA and proteins packaged inside the nucleus. The complexity of chromatin folding and how it is packaged inside the ...

Two structural features of the DNA molecule provide a basis for the mechanisms of heredity: the four nucleotide bases and its double-stranded nature. The ...

Organization of Genes

Chromosome Structure

A functional eukaryotic chromosome must contain three elements: a centromere, telomeres, and numerous origins of replication.
The centromere is a DNA ...

Construct an explanation based on evidence for how the structure of DNA determines the structure of proteins which carry out the essential functions of life through systems of specialized cells. Emphasis is on the conceptual understanding that DNA sequences determine the amino acid sequence and thus protein structure. Students can produce scientific writing, or presentations, and/or physical models that communicate constructed explanations.

HS-LS1-1

Characteristics of Life

Biology is a natural science that studies life and living organisms, including their structure, function, development, interactions, evolution, ...

https://cloudfront.jove.com/files/media/science-education/science-education-thumbs/10647.jpg

Levels of Organization

Biological organization is the classification of biological structures, ranging from atoms at the bottom of the hierarchy to the Earth&#x27;s biosphere. ...

The Scientific Method

The scientific method is a detailed, empirical problem-solving process used by biologists and other scientists. This iterative approach involves ...

Taxonomy

Taxonomy is the science of defining and naming groups of biological organisms based on shared characteristics. It uses a hierarchy of increasingly ...

Phylogeny

Phylogeny is concerned with the evolutionary diversification of organisms or groups of organisms. A group of organisms with a name is called a taxon ...

Develop and use a model to illustrate the hierarchical organization of interacting systems that provide specific functions within multicellular organisms. Emphasis is on functions at the organism system level such as nutrient uptake, water delivery, or organism movement in response to neural stimuli. An example of an interacting system could be an artery depending on the proper function of elastic tissue and smooth muscle to regulate and deliver the proper amount of blood within the circulatory system.

HS-LS1-2

Overview of Metabolism

Living cells constantly carry out various chemical reactions which are necessary for their proper functioning. These reactions are interlinked to one ...

Regulation of Metabolism

Cellular needs and conditions vary from cell to cell and change within individual cells over time. For example, the required enzymes and energetic demands ...

Positive and Negative Feedback Loops

Animal organs and organ systems constantly adjust to internal and external changes through a process called homeostasis (&#34;steady state&#34;). Examples ...

Functions of Life

Human life is characterized by a variety of functions that are essential for survival and well-being. These functions include metabolism, movement, ...

Requirements for Human Life

The Earth and its atmosphere have provided humans with air, water, and food, but these are not the only requirements for survival. Humans also require a ...

What is Homeostasis?

Maintaining homeostasis requires that the body continuously maintain its internal conditions. Each physiological condition has a particular set point, ...

Negative and Positive Feedback

Homeostatic Imbalance

Homeostasis is the maintenance of a stable internal environment within the body, which is crucial for the proper functioning of cells, tissues, organs, ...

Plan and conduct an investigation to provide evidence that feedback mechanisms maintain homeostasis in living organisms. Examples of investigations could include heart rate responses to exercise, stomate responses to moisture and temperature, root development in response to water levels, or cell response to hypertonic and hypotonic environments.

HS-LS1-3

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards